中等強度跑臺運動經Wnt/β-catenin途徑對骨量的影響效應

李　荀,　陳曉紅,　鄭　陸,　王文榮,　王智強

(1.山東體育學院 體育科學研究院,山東 濟南 250102; 2.首都體育學院 運動科學與健康學院,北京 100191)

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中等強度跑臺運動經Wnt/β-catenin途徑對骨量的影響效應

李荀1,陳曉紅2,鄭陸2,王文榮2,王智強2

(1.山東體育學院 體育科學研究院,山東 濟南 250102; 2.首都體育學院 運動科學與健康學院,北京 100191)

目的:探討中等強度跑臺運動經Wnt/β-catenin途徑對去卵巢大鼠骨量的影響效應。方法:將雌性SD大鼠隨機分為基礎對照組(BC)、假手術組(SHAM)、去卵巢組(OVX)、去卵巢+運動組(OVX+T);后3組各分為4、8、12周組。OVX+T組進行中等強度跑臺運動。以雙能X線骨密度儀測定大鼠全身骨密度(BMD);以qRT-PCR測定股骨Wnt3α及β-catenin mRNA表達;以Western blot測定股骨Wnt3α及β-catenin蛋白表達。結果:OVX+T組大鼠BMD隨運動時間延長而升高,OVX+T12組BMD顯著高于同期OVX組(P<0.01)；OVX+T各組Wnt3α mRNA及蛋白表達水平顯著高于同期SHAM組和OVX組(P<0.05),且隨時間延長表達量增加；OVX+T組β-catenin的mRNA表達水平均顯著高于同期SHAM和OVX組(P<0.01),且以OVX+T4組表達量最高,顯著高于OVX+T8組和OVX+T12組(P<0.05,P<0.05);蛋白表達以OVX+T8組表達量最高,顯著高于OVX+T4組和OVX+T12組(P<0.01,P<0.05),且顯著高于同期SHAM組和OXV組(P<0.01,P<0.01),同時,OVX+T12組與同期OVX組相比顯著升高(P<0.05)。結論:中等強度跑臺運動能有效增加去卵巢大鼠股骨Wnt和β-catenin基因及蛋白的表達,激活Wnt/β-catenin信號通路,進而改善去卵巢大鼠骨密度;運動增加去卵巢大鼠骨量的機制與Wnt/β-catenin信號通路參與骨骼機械力傳導,成骨效應增強密切相關。

中等強度跑臺運動;去卵巢大鼠；Wnt/β-catenin通路;骨量;效應

骨量的維持是由骨形成與骨吸收相耦聯的動態過程,一旦成骨細胞功能降低,破骨細胞功能增強,2種細胞功能失去動態平衡,即可發生骨丟失。近年來諸多研究證實,Wnt信號通路對骨重建起著重要作用[1-3],因而成為新的研究熱點。Wnt/β-catenin信號通路為Wnt信號經典通路,既可以通過調節成骨細胞的分化和特異基因的表達、增強成骨細胞活性、促進骨基質的形成及礦化等環節影響成骨作用[4]，也可通過影響破骨細胞的發生和骨吸收而影響破骨作用[5],實現對骨量的調控。

運動的健骨效應已得到廣泛關注,中等強度有氧運動是增加骨量的有效途徑[6],其作為一種有效的預防和康復手段可以有效改善骨質疏松患者骨代謝,但健骨效應的機制不甚明了。近期有研究[7]表明,14周的中等強度跑臺運動可促進去卵巢大鼠腰椎(L5)Wnt3α/β-catenin信號通路激活,改善骨強度；而對股骨的作用機制如何？不同持續時間的運動對其影響效應又如何？本文擬探討中等強度有氧運動對骨量的影響機制,為運動防治骨質疏松提供實驗依據。

1　研究對象與方法

1.1實驗對象及分組3月齡雌性SD大鼠100只,體重(270±10)g,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。大鼠的飼養、訓練均于北京大學實驗動物中心(SPF級實驗室)進行,分籠飼養,每籠3只,自由飲水、進食,以國家標準嚙齒類動物常規飼料喂養。環境溫度(20±2)℃,相對溫度55%～58%,12 h晝/夜循環照明。

大鼠適應性喂養1周后,用隨機數字表法將大鼠分為4組:基礎對照組(BC,n=10)、單純去卵巢組(OVX,n=30)、假手術組(SHAM,n=30)、去卵巢+運動組(OVX+T,n=30)。OVX組大鼠行雙側卵巢切除術,術后3 d,隨機分為OVX4組(n=10)、OVX8組(n=10)、OVX12組(n=10),分別常規飼養4周、8周和12周。SHAM組按照OVX組模型制作方法進行,手術步驟同OVX組,取雙側卵巢周圍與卵巢等體積脂肪切除,術后3 d,隨機分為SHAM4組(n=10)、SHAM8組(n=10)、SHAM12組(n=10),分別常規飼養4周、8周和12周。OVX+T組大鼠行卵巢切除術,術后3 d,隨機分為3組:OVX+T4組(n=10)、OVX+T8組(n=10)、OVX+T12組(n=10),分別進行為期4周、8周、12周的中等強度跑臺運動。

OVX組術后行大鼠陰道脫落細胞監測,4～5d/周,觀察脫落細胞成熟程度,以確定去卵巢手術效果。術后2周內大鼠陰道脫落細胞鏡檢陸續顯現為動情間期變化,證明OVX模型建造成功。

1.2運動方案采用段氏PT2000型鼠類跑臺運動。起始跑速為12 m/min,坡度0°,20 min/次;隔日跑速增加3 m/min,運動持續時間增加10 min。第2周起,跑速為18 m/min,60 min/次,坡度5°,5 d/周。負荷設定參照國際通用的Bedford運動負荷標準[8]。

1.3組織取樣及處理于末次運動后24～36 h稱重,并以3.45 mL/kg體重腹腔注射10%水合氯醛麻醉,測定大鼠全身骨密度(BMD)后,心臟取血處死。取大鼠右側股骨,去除肌肉、肌腱等軟組織后,以生理鹽水紗布包裹置于凍存管中,于-80 ℃保存,用于Wnt3a及β-catenin mRNA及蛋白的測定。

1.4測試指標與方法(1)BMD測定。以雙能X線骨密度儀(DXA;Lunar Prodigy,GE Inc.,USA)測定大鼠全身BMD,用enCORE(小動物分析軟件-版本10.50.086)進行分析。每日實驗前,以隨機附帶模塊對DXA進行質控檢測。

(2)Wnt3α及β-catenin mRNA測定。采用qRT-PCR方法測定。取股骨上1/2,于研磨機內液氮環境下研磨成粉,以Trizol法(Trizol試劑盒)提取總RNA。采用紫外分光光度計測定RNA濃度,并通過A230 nm、A325 nm和A260 nm/A280 nm的值,觀察樣本被污染的程度及RNA純度。各靶基因引物的設計與合成由北京天一輝遠生物技術公司完成,引物序列見表1。

表1　各靶基因及引物序列

取1 μg總RNA,逆轉錄合成cDNA,以SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(寶生物工程有限公司)進行熒光定量PCR測試。95 ℃ 30 s預變性后,95 ℃ 3 s→60 ℃ 30 s,40 cycles;同時設置溶解曲線,95 ℃ 15 s→65 ℃ 60 s→95 ℃ 15 s。待測基因的相對表達量采用2-△△CT方法[9]分析,其中△△CT=(CT實驗組待測基因-CT實驗組參照基因)-(CT對照組待測基因-CT對照參照基因)。

(3)采用Western Blot方法測定Wnt3α及β-catenin蛋白表達。取右股骨上1/2,于研磨機內液氮環境下研磨成粉，置于研缽中,加入含有蛋白酶抑制劑的組織裂解液,于冰上勻速研磨15 min。4 ℃,13 000 r/min,離心15 min,取上清。以BCA法進行蛋白濃度測定,按試劑盒(普利萊基因技術有限公司)說明書完成。取各標本蛋白140 μg,加5×loading buffer,混勻,100 ℃煮沸15 min。將樣品加入SDS-PAGE膠中,濃縮膠100 V,分離膠120 V,恒壓電泳。采用濕式轉膜法將蛋白轉移至PVDF膜,冰浴中,300 mA恒流轉膜160 min。用5%BSA室溫封閉1 h后,分別加入適當濃度的Wnt3α、β-catenin和β-actin一抗,4 ℃孵育過夜。TBST清洗后,加入適當濃度HRP標記的二抗,室溫孵育1 h。清洗后,與Super ECL底物發光液反應,X光膠片壓片、曝光,經顯影、定影后,掃描儀掃描,用Gel-Pro Analyzer軟件測定條帶光密度值。將Wnt3α及β-catenin的光密度值分別與相應的β-actin比值作為其蛋白的相對表達量。

1.5數據處理采用SPSS 16.0軟件進行數據統計分析,結果以平均數±標準差(M±SD)表示。屬正態分布者,采用One-way ANOVA分別對同期各組間實驗數據以及各組不同時間點的實驗數據進行組間差異性檢驗。出現顯著性時用LSD(L)方進行組間多重比較檢驗。P<0.05表示差異有顯著性,P<0.01表示差異具有非常顯著性。

2　研究結果

2.1骨密度(BMD)的變化SHAM組大鼠BMD表現為隨月齡增長而穩定增加,與BC組相比,SHAM各組BMD均顯著增加(P<0.05,P<0.01,P<0.01),但各組間無顯著性差異。OVX組大鼠BMD呈緩慢下降趨勢,OVX8、OVX12均顯著低于同期SHAM組(P<0.01,P<0.01)。OVX+T組大鼠BMD呈現出隨運動時間增加而升高的趨勢;OVX+T4組仍顯著低于同期SHAM組(P<0.05),且與同期OVX組相比無顯著性差異;OVX+T8組顯著高于OVX+T4組(P<0.05),且與同期SHAM組相比無顯著性差異;OVX+T12組顯著高于OVX+T4組(P<0.05),與OVX+T8組相比升高幅度較小,無顯著性差異,與同期OVX組比較顯著升高(P<0.01),且與同期SHAM組相比無顯著性差異(表2)。

2.2Wnt3α mRNA表達的變化隨月齡增長,SHAM組及OVX組各組間Wnt3α mRNA表達較為穩定,各組間無顯著性差異,且同期兩組間均無顯著性差異。隨著運動時間的延長,OVX+T各組Wnt3α mRNA表達呈升高趨勢;OVX+T4組顯著高于同期SHAM和OVX組(P<0.01);OVX+T8組與OVX+T4組相比升高幅度較小,無顯著性差異,與同期SHAM和OVX組相比顯著升高(P<0.01);OVX+T12組與OVX+T4組相比顯著升高(P<0.05),且顯著高于同期SHAM和OVX組(P<0.01)(表3)。

表2　大鼠全身BMD　g/cm2

注:a表示P<0.05 vs BC組,aa表示P<0.01 vs BC組;b表示P<0.05 vs同期SHAM組,bb表示P<0.01 vs同期SHAM組;cc表示P<0.01 vs同期OVX組;d表示P<0.05 vs OVX+T4組,表3～表6同此

表3　Wnt3a mRNA相對表達量(2-△△CT)

2.3Wnt3α蛋白表達的變化隨月齡增長,SHAM組及OVX組各組間Wnt3α蛋白表達較為穩定,各組間無顯著性差異;OVX組表達略低于SHAM組,但無顯著性差異。隨運動時間延長,OVX+T各組Wnt3α蛋白表達呈升高趨勢;OVX+T4組、OVX+T8組與同期SHAM和OVX組相比均顯著升高(P<0.05),但兩組間無顯著性差異;OVX+T12組與OVX+T4組相比顯著升高(P<0.05),且顯著高于同期SHAM和OVX組(P<0.01)(表4、圖1)。

表4　Wnt3a蛋白相對表達量

圖1　大鼠Wnt3α蛋白表達

2.4β-catenin mRNA表達的變化隨月齡增長,SHAM組各組間β-catenin mRNA表達較為穩定,各組間無顯著性差異。OVX組各組表達均顯著低于同期SHAM組(P<0.01),且OVX8組表達量最高,顯著高于OVX4組(P<0.01)。OVX+T各組表達量均顯著高于同期SHAM組和同期OXV組(P<0.01);且OVX+T4組表達量最高,顯著高于OVX+T8組和OVX+T12組(P<0.05)(表5)。

表5　β-catenin mRNA相對表達量(2-△△CT)

2.5β-catenin蛋白表達的變化隨月齡增長,SHAM組及OVX組各組間β-catenin蛋白表達較為穩定,各組間無顯著性差異。OVX+T各組β-catenin蛋白表達以OVX+T8組表達量最高,顯著高于OVX+T4組和OVX+T12組(P<0.01,P<0.05),且顯著高于同期SHAM組和同期OXV組(P<0.01)。OVX+T12組與同期OVX組相比顯著升高(P<0.05)(表6、圖2)。

表6　β-catenin蛋白相對表達量

圖2　大鼠β-catenin蛋白表達

3　分析與討論

3.1中等強度跑臺運動對骨量的作用效應目前普遍認為,以DXA方法測試BMD是評價骨量的“金標準”[10]。本研究結果顯示,SHAM組大鼠BMD表現為隨月齡增大而穩定增加,至12周組達到最大值,說明本研究選擇的3月齡大鼠BMD尚未達到峰值,BMD的增加為自然增長狀態。該結果與沈輝等[11]的研究報道一致。本研究所用大鼠為3月齡大鼠,造模耗時最長為12周,6月齡大鼠骨尚處在快速生長期(在雌性大鼠的生長發育過程中,6月齡為快速生長期,6～9月齡進入骨生長靜止期,骨代謝相對穩定,10月齡達到峰值骨量)；因此,3～6月齡期間,促進骨骼生長和骨量蓄積的各種因素(遺傳、生長激素及甲狀腺激素等內分泌因素等)將有利于大鼠骨量的增加。

本研究結果顯示,OVX組大鼠BMD呈現緩慢下降態勢,OVX8組及OVX12組均顯著低于同期SHAM組(P<0.01)。表明去卵巢對大鼠骨量的直接作用結果顯著,全面抑制大鼠的骨量。去卵巢導致雌激素驟降是大鼠全身BMD下降的根本原因。雌激素是骨代謝的主要調控激素,通過與成骨細胞和破骨細胞上的雌激素受體結合,行使其促進骨形成,抑制骨吸收的骨保護作用[12]。另一方面,雌激素通過上調OPG(骨保護蛋白,可抑制破骨細胞的分化和成熟)表達發揮骨保護作用。當雌激素驟減,OPG表達受抑,破骨細胞分化和成熟加劇[13-14]。此外,雌激素水平對骨重建閾值具有下調作用。當雌激素減少,骨重建閾值提高,導致原先能夠使得骨進行保留型骨重建的應變只能進行廢用型骨重建(低骨量和骨微結構退變為特征),進而使BMD降低。

本研究結果顯示,OVX+T運動組大鼠BMD呈現出隨運動時間增長而增加的態勢,OVX+T8組和OVX+T12組雖均低于同期SHAM組,但已無統計學意義。與同期OVX組比較,OVX+T12組BMD顯著升高(P<0.01)。結果顯示,4～8周運動干預尚未明顯的骨量增加,經12周中等強度跑臺運動干預,運動的力學負荷刺激效果顯著,骨量增加顯著。運動導致骨量顯著增加出現的時間節點為8周,8～12周之間效果持續,這與我們前期的另一項動物實驗研究結果基本一致[15]。表明持續8～12周的中等強度跑臺運動對骨骼產生良性刺激,BMD顯著增加。而運動導致骨量增加的機制,一方面與有氧跑步運動增加了機體的機械負荷刺激有關,這種刺激通過參與做功的肌群產生肌力以及對骨的直接作用,影響和促進了大鼠骨建造和骨重建過程[16-17];另一方面,與運動刺激部分抵消廢用型骨重建過程有關,OVX大鼠因雌激素減少導致骨重建閾值下調,骨的基礎多細胞單位數目增加并增強骨轉換,機體發生廢用型骨重建過程,骨代謝平衡被破壞[18],中等強度跑臺運動負荷可能通過增加骨骼載荷以增加骨骼的應變,使之達到骨重建閾值進行保留型骨重建,而部分抵消因雌激素驟降所帶來的不利效應。運動可以緩解/抵抗因雌激素水平降低所導致的骨量下降,延緩骨質疏松的發生；而其中的機械力傳導機制是否與Wnt/β-catenin途徑有關,則成為探討大鼠骨量變化機制的關鍵。

3.2中等強度跑臺運動對Wnt/β-catenin通路的影響及經該通路對骨量的作用機制Wnt信號通路包括3條細胞內信號傳導通路[19]:Wnt/β-catenin通路、Wnt/PCP(平面細胞極性)通路、Wnt/Ca2+通路,其中Wnt/β-catenin通路又被稱為經典Wnt通路,是一種作用廣泛的信號通路。Wnt蛋白作為Wnt/β-catenin通路的起始因子,主要包括Wnt3α等,通過作用于細胞膜表面的受體,激活細胞的第二信使,引起細胞質內β-catenin降解復合物的生成,導致β-catenin的積累,致使β-catenin進入細胞核內,促進基因的轉錄,從而發揮其生物學效應,影響細胞的增殖、分化。

Wnt/β-catenin通路在骨重建過程中發揮著重要作用[1-3]。Wnt/β-catenin通路在骨形成過程中扮演重要角色[20],可促進具有多分化潛能的間充質干細胞向成骨細胞方向分化;在成骨細胞的增殖和分化階段,可誘導骨形態發生蛋白表達促進其分化。目前研究發現,Wnt/β-catenin信號通路不僅直接誘導成骨細胞分化,亦可促進成骨細胞礦化[21]。在有些情況下,Wnt/β-catenin信號通路也會下調成骨細胞的凋亡,進而促進骨形成[19]。此外,Wnt/β-catenin信號通路也可通過影響破骨細胞的發生和骨吸收而影響破骨作用[5],其可通過增加成骨細胞和骨細胞OPG分泌,間接抑制破骨細胞分化和骨吸收[22-23]。Wnt配體也可直接影響破骨細胞及其前體,形成自分泌環:在早期,β-catenin的激活有利于前體細胞的增殖;而在后期,Wnt3α會抑制破骨細胞形成[24](圖3)。

圖3　Wnt/β-catenin信號通路對骨細胞的作用機制[19]

Wnt蛋白作為Wnt/β-catenin信號通路的起始因子,能夠影響細胞的增殖、分化;β-catenin是Wnt/β-catenin通路中的關鍵因子,其量的積累是Wnt經典通路的關鍵環節,是應力刺激的關鍵調控點[25]。有研究發現[26],大鼠去卵巢4周、8周時,骨組織中β-catenin mRNA表達量顯著下降,表明去卵巢大鼠骨組織中Wnt/β-catenin信號通路受到抑制,骨密度降低。Bu等[7]研究發現,大鼠去卵巢14周時,第5腰椎(L5)骨組織中β-cantenin mRNA表達量顯著低于假手術組,同時L5骨強度顯著下降。也有對去卵巢大鼠股骨研究發現[27],去卵巢12周時,股骨骨密度顯著下降,同時骨組織中β-catenin mRNA表達量顯著下降。提示Wnt/β-catenin信號通路的抑制可能是絕經后骨質疏松癥發病機制之一。而另有研究[28]發現,大鼠去卵巢12周時,股骨骨密度顯著下降,而骨組織中β-cantenin mRNA及蛋白表達與正常對照組相比顯著增加(P<0.05),表明Wnt/β-catenin信號通路被激活。究其原因,Wnt/β-catenin信號通路在去勢大鼠中的功能狀態可能與去卵巢的時間有關。本研究結果顯示,大鼠去卵巢后,骨組織中β-catenin mRNA表達量顯著下降,去卵巢4周、8周、12周時均顯著低于其同期假手術組(P<0.01),表明去卵巢后Wnt/β-catenin信號通路受到抑制,與上述大多數研究結果一致。

本研究對去卵巢大鼠分別進行4周、8周、12周不同時間的有氧運動干預,發現運動各組的Wnt3α mRNA及蛋白表達均顯著高于同期去卵巢組及假手術組,并且隨運動時間的延長,表達量逐漸增加。由于細胞外Wnt3α的增加,可與膜上受體結合,引起細胞質內β-catenin的累積,促使β-catenin進入細胞核內,促進成骨細胞的增殖和分化。本研究也發現,運動各組的β-catenin mRNA表達量也顯著高于同期去卵巢組及假手術組;運動8周和12周時,β-catenin蛋白表達量也顯著高于同期去卵巢組,表明中等強度跑臺運動可激活Wnt3α/β-catenin信號通路,改善去卵巢大鼠的骨量下降。這與Bu等[7]研究結果一致,即對去卵巢大鼠進行14周的中等強度跑臺運動干預后發現,運動后L5骨組織中β-cantenin mRNA表達量顯著高于單純去卵巢組,同時L5骨強度顯著增大,表明有氧運動可激活Wnt3α/β-catenin信號通路,改善去卵巢大鼠的骨量及骨強度下降。提示中等強度跑臺運動可以通過激活Wnt3α/β-catenin信號通路,參與運動優化大鼠骨骼的機械力傳導,增強成骨效應,進而改善去卵巢致骨質疏松大鼠的骨量下降。

4　結束語

中等強度跑臺運動有效增加去卵巢大鼠股骨Wnt和β-catenin基因及蛋白的表達,激活Wnt/β-catenin信號通路,進而改善去卵巢大鼠骨密度;運動增加去卵巢大鼠骨量的機制與Wnt/β-catenin信號通路參與了骨骼機械力傳導,成骨效應增強密切相關。

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Effects of Treadmill Running with Moderate Intensity on Bone Mass by Wnt/β-catenin

∥LI Xun1,CHEN XiaoHong2,ZHENG Lu2,WANG Wenrong2,WANG Zhiqiang2

Objective: To determine the effects of moderate intensity treadmill running on bone mass by Wnt/β-catenin in OVX rats.Methods: The female SD rats were randomly divided into 4 groups: basal control group (BC),sham control groups (SHAM),Ovariectomy groups (OVX),Ovariectomy+training groups (OVX+T);and SHAM,OVX and OVX+T were respectively divided into 4 W,8 W and 12 W group.OVX+T groups respectively received 4,8,and 12 Weeks aerobic training on treadmill.Bone mass density (BMD) was measured by dual energy X-ray absorptiometry (DXA).Wnt3α and β-catenin mRNA expression of femur were detected by qRT-PCR.Wnt3α and β-catenin protein expression of femur were measured by western blot.Results: BMD in OVX+T group significantly increased with the exercise time going,and BMD in OVX+T12 Was significantly higher than that in OVX12 (P<0.01).Compared with the same-time SHAM and OVX groups,Wnt3α mRNA and Wnt3α expression in each group of OVX+T significantly increased respectively (P<0.05).β-catenin mRNA in OVX+T significantly increased comparing with the same-time SHAM and OVX groups (allP<0.01);β-catenin mRNA in OVX+T4 Was the highest,with significant difference comparing with OVX+T8 and OVX+T12 (P<0.05,P<0.05).β-catenin in OVX+T8 Was the highest,with significant difference comparing with OVX+T4 and OVX+T12 (P<0.01,P<0.05).Compared with the same-time SHAM and OVX groups,β-catenin in OVX+T8 significantly increased (P<0.01,P<0.01).Conclusion: The moderate intensity treadmill running can effectively induce Wnt3α and β-catenin mRNA and protein expression increase,activate the Wnt/β-catenin pathway,and elevate BMD of the femur in OVX rats.This showed that the mechanism of exercise’s increasing bone mass in OVX rats may be related to Wnt/β-catenin pathway,which participates in the bone mechanical force transduction and improves osteogenesis effects.

treadmill running with moderate intensity;ovariectomized rat;Wnt/β-catenin pathway;bone mass;effect

’s address1.Sport Science Research Center,Shandong Sport University,Jinan 250102,Shandong,China;2.School of Sport Science and Health,Capital University of Physical Education and Sports,Beijing 100191,China

2016-01-08;

2016-04-10

北京市教委科研基地科技創新平臺項目(PXM2012-014206-000037)

李荀(1986-),女,山東萊蕪人,山東體育學院講師,博士;Tel.:(0531)89655306,E-mail:lixun0221@126.com

簡介:鄭陸(1959-),女,江蘇淮安人,首都體育學院教授,博士;Tel.:15010546853,E-mail:zhenglu@cupes.edu.cn

G804.5

A

10.16099/j.sus.2016.05.009

文章編分類號1000-5498(2016)05-0057-06