特應性與非特應性鼻息肉中黏膜炎癥模式的特征分析*

黃遠　余文興　巴羅　楊奉玲　張靜　杜進濤

(1.遂寧市中心醫院耳鼻咽喉頭頸外科， 四川 遂寧 629000； 2.西藏自治區人民醫院耳鼻咽喉科, 西藏 拉薩 850099；3.四川大學華西醫院耳鼻咽喉頭頸外科上呼吸道實驗室，四川 成都 610041)

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特應性與非特應性鼻息肉中黏膜炎癥模式的特征分析*

黃遠1余文興1巴羅2楊奉玲1張靜1杜進濤3

(1.遂寧市中心醫院耳鼻咽喉頭頸外科， 四川 遂寧 629000； 2.西藏自治區人民醫院耳鼻咽喉科, 西藏 拉薩 850099；3.四川大學華西醫院耳鼻咽喉頭頸外科上呼吸道實驗室，四川 成都 610041)

目的對致敏因素相關特應性鼻息肉與非特應性鼻息肉間進行黏膜免疫表型及炎癥模式的臨床比較研究。方法在進行功能性鼻內窺鏡手術中獲取85例慢性鼻竇炎伴鼻息肉患者的息肉組織，其中特應性息肉40例、非特應性息肉45例。另選非變應性鼻中隔偏曲患者36例的下鼻甲粘膜組織作對照；采用Elisa法檢測各種炎癥相關免疫細胞因子。通過皮膚點刺及血清檢測特異性IgE將鼻息肉劃分特應性與非特應性息肉進行比較分析。進一步通過體外刺激實驗和PCR檢測Th細胞相關轉錄因子mRNA進行驗證。結果特應性鼻息肉中主要以IL-5、 ECP和總IgE等嗜酸性炎癥反應性免疫指標增高為主，同時Th2轉錄因子GATA-3 mRNA 顯著升高(P<0.05)；但兩組息肉中均表現為FOXP3 mRNA顯著降低(P<0.05)。體外實驗抗-IgE刺激后IL-5, IL-2和IL-17等在特應性息肉中釋放顯著增加(P<0.05)，而IFN-γ, IL-6及 IL-8在兩組息肉間無顯著差異。結論特應性與非特應性鼻息肉患者在息肉組織及全身層面表現為各自獨特的免疫表型及炎癥模式特征，可為臨床有效的靶向治療策略提供參考。

鼻息肉； 特應性； 細胞因子； T輔助細胞； 免疫球蛋白E

慢性鼻竇炎是一種比較普遍的慢性疾病，依據中鼻道內有無息肉生長將其分類為伴有或不伴有鼻息肉的兩種慢性鼻竇炎亞型[1]。多項研究表明不伴息肉的慢性鼻竇炎炎癥反應與Th1免疫反應密切相關，而伴有鼻息肉的鼻竇炎具有Th2傾向嗜酸性炎癥反應特征。確切地說伴有鼻息肉鼻竇炎的發病，某種程度上環境因素(包括細菌、病毒及真菌等)與宿主反應有著密切而復雜的關系。目前認為變應性與感染性雙重反應可能是慢性鼻竇炎鼻息肉發病發展的主要因素[2]。鼻息肉發病機制中變應性作用一直處于爭論狀態，有學者認為變應性及強化Th2免疫反應與組織中嗜酸性細胞浸潤密切相關，況且該結論在歐美人群鼻息肉研究中反復得到證實[3]。然而最近東亞許多國家鼻息肉研究發現嗜酸性粒細胞反應并不突出，反之表現為強化Th1/Th17免疫反應及普遍中性粒細胞炎癥反應之特征[4]；并且該現象與非變應性因素存在某種關聯[5-7]。為深入研究變應性因素在國人人群鼻息肉發病病理機制中的作用，我們將特應性與非特應性鼻息肉進行系統免疫機制的分類研究，現將結果報告于下。

1　對象與方法

1.1對象選擇收集2013年12月～2015年12月間分別在遂寧市中心醫院與華西醫院及西藏自治區人民醫院耳鼻咽喉科擬行功能性鼻竇內窺鏡手術121例患者(女性54名，男性67名)，年齡16～60歲，其中包括85例慢性鼻竇炎鼻息肉(CRSwNP)患者作為研究對象，分為特應性組40例，非特應性組45例及36例非變應性單純鼻中隔偏曲患者作為正常對照組。術前所有患者停用各種藥物3周以上。標本收集：CRSwNP患者樣本取自息肉組織，正常對照組織樣本取自中隔偏曲行鼻中隔成型術患者的下鼻甲粘膜組織并備存于-80℃ 冰箱。 術前癥狀嚴重程度采用VAS評分評估，鼻內鏡鼻腔內及息肉表現程度采用Davos分級方法，CT掃描分級依據Lund-Mackay評估方法。評估過敏采用皮膚點刺實驗和變應原特異性IgE抗體Phadiatop檢測。

1.2研究方法

1.2.1檢測細胞因子及免疫介質三組患者所取標本先行稱重，每0.1 g 標本加入1.0 ml 0.9%NaCl溶液，勻漿前加入混合蛋白酶抑制劑(Complete Roche; Mannheim, Germany)。組織勻漿(Braun 勻漿器1500rpm轉速5分鐘)。勻漿液在4℃下離心(3000 rpm轉速，15分鐘),收集上清液分裝EP管并采用Elisa法檢測，試劑盒為Fluorokine MAP Multiplex Kits (R&D Systems, Minneapolis,MN,USA)，測定IL-2sRα、IL-5、IL-6、IL-8、IL-17、 IFN-γ、ECP、MPO及總IgE和SAE-IgA等。檢測血清中蒿草和塵螨特殊IgE水平。

1.2.2轉錄因子RT-PCR檢測通過定量RT-PCR評估轉錄因子GATA-3, T-bet, FOXP3和 RORc等的mRNA 水平。使用RNeasy 試劑盒(QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)按照操作說明書萃取總RNA。cDNA制備：通過PrimeScript RT 試劑盒 (Takara Biotechnology Co, Ltd, Dalian, China)將 0.5μg的總RNA反轉錄生成cDNA。cDNA相當于40ng 總RNA被用于執行定量RT-PCR。 mRNA制備分析：通過使用GATA-3、T-bet、FOXP3、RORc的特異性引物序列20在iCycler iQ Real-Time PCR 檢測系統 (BioRad Laboratories, CA, USA)中完成擴增。聚合酶鏈反應使用SYBR Premix Ex Taq II 試劑盒 (Takara Biotechnology Co, Ltd, Dalian, China) 進行。通過geNorm軟件(Ghent University, Ghent, Belgium) 驗證后，三個基因：肌動蛋白β、羥甲基膽素合酶和延長因子1的表達被用于標準化轉錄。通過使用qBase program (version 1.3.5; Ghent University, Ghent, Belgium)，分析出任一基因的相對表達水平。

1.2.3抗IgE刺激鼻息肉組織釋放細胞因子檢測按統計學原理各組隨機選出樣本，即特應性NP 12例， 非特應性NP 12例。用10ml RPMI 1640 組織培養液(Sigma-Aldrich, Bornem, Belgium)，分別不同鼻息肉患者的新鮮鼻息肉標本浸泡在-4 ℃培養24小時后，組織切碎混懸液過濾以獲得大小約0.9 mm3， 每0.04克組織加入1 ml培養液的比例將組織塊再次浸泡混勻，1 μg/ml的濃度加入人骨髓瘤 IgE (Calbiochem, VWR International, Leuven, Belgium) 在37℃下5%CO2孵化1小時，再用培養液洗三次。再次1ml培養液浸泡混勻，然后在48孔的組織培養板(BD Falcon,VWR,Leuven,Belgium)中每孔加入0.5 ml組織混懸液，再于每孔中加入陰性對照培養液或0.5 μg/mlSEB(Sigma-Aldrich) 然后放入37 ℃下5%CO2孵化30分鐘。孵化結束樣本離心1300rpm 10分鐘，將上清液按上述Elisa方法檢測細胞因子。

1.3統計學分析所有數據資料應用統計分析軟件包SPSS 18.0 (SPSS, Inc, Chicago)進行統計分析。定量資料采用非參數檢驗(秩和檢驗Kruskal-Wallis 法和Mann-Whitney 雙尾U檢驗)；基線變化分析采用方差分析或Fisher確切概率法以及部分T檢驗等。采用 Sigmaplot 18.0 software版本，繪制數據圖示。數據以箱型圖顯示中位數，范圍及四分位數。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1特應性與非特應性鼻息肉臨床特點比較納入的85例慢性鼻竇炎伴鼻息肉患者，按照慢性鼻竇炎歐洲指南診斷，根據病史確認有無過敏、皮膚點刺及血清中變應原特殊IgE檢測結果，將鼻息肉劃分為特應性鼻息肉40例和非特應性鼻息肉45例；另對照非變應性鼻炎鼻中隔偏曲患者36例。兩種息肉亞型人口分布大致均衡，兩者均有較高臨床癥狀評估積分。共有8例哮喘病史均分布在特應性息肉組，并且特應性鼻息肉患者表現為在噴嚏、鼻癢及流清涕等癥狀積分相對較高(P<0.05)，見表1。

表1　三組患者臨床癥狀參數評估比較

注：表中數據由中位數和可信區間表達，P值由ANOVA單因素方差分析和似然比概率得來。NS.沒有顯著性差異;①對照vs 非特應性鼻息肉; ②對照vs 特應性鼻息肉; ③兩組息肉

2.2各組中多種基線炎癥介質檢測水平息肉組織中IL-5, IFN-γ, IL-6, IL-8,和IL-2sR,等細胞因子的表達均顯著高于對照組，但IL-17在息肉與對照間無顯著差異。此外，在特應性息肉中IL-5和 IL-6,顯著高于非變應性息肉組(P<0.05)；而IFN-γ, IL-8, 和 IL-2sR等因子表達在兩組息肉間無顯著差異。總IgE、ECP和MPO在息肉中顯著高于對照 (P<0.05)，而SAE-IgE無顯著差異。兩組息肉中比較總IgE和 ECP 在特應性息肉顯著高于非特應性息肉 (P<0.05)，但 MPO在兩組息肉間無顯著差異，見表2。

表2　三組患者主要炎癥因子、介質以及總IgE SAE-IgE表達差異的比較

注：NS.無顯著差異; ①對照vs 非特應性NP; ②對照vs 特應性NP; ③兩組NP

2.3特應性與非特應性息肉中轉錄因子mRNA 表達水平特應和非特應組息肉中的轉錄因子T-bet 和 GATA-3 的mRNA 顯著高于對照組，然而轉錄因子FOXP3的 mRNA與對照相比在息肉中明顯下降(P<0.05)。轉錄因子RORc的 mRNA表達在對照與息肉組間無顯著差異。另發現GATA-3 mRNA l表達水平在特應性息肉中顯著高于非特應性息肉組(P<0.05)。而T-bet、FOXP3及 RORc表達在兩組亞型息肉間無顯著差異，見表3。

2.4體外抗IgE誘導刺激合成鼻息肉組織內細胞因子水平比較鼻息肉組織在24小時用標準培養液(RPMI)中刺激培養后，釋放的IL-5和IL-6在特應性息肉中顯著高于非特應性組(P<0.05)，而自發釋放的IFN-γ、IL-17、,IL-2及 IL-8等在兩息肉組間無顯著差異。抗-IgE (10 μg/mL)刺激24小時合成釋放的IL-5、IL-2和 IL-17比培養液單純刺激兩息肉組顯著升高(P<0.05)。 釋放IFN-γ、 IL-6,和IL-8等在兩息肉組間無顯著差異。當抗-IgE刺激后兩息肉組比較IL-5, IL-2, IL-17等在特應性組比非特應組顯著增高 (P<0.05)，但IFN-γ、IL-6和 IL-8釋放在兩息肉組間無顯著差異，見 圖1。

表3　三組患者轉錄因子FOXP3、T-bet,、GATA3和ROR等的mRNA表達水平比較

圖1體外刺激各組鼻息肉釋放炎癥因子水平

Figure 1The level of inflammatory mediators in stimulated nasal polyp tissues

注：組內成對資料比較使用Kruskal-Wallis 檢驗，組間不成對資料使用The Mann-WhitneyU雙尾。 統計意義為P≤0.05。RPMI.組織培養液; Co.對照; NANP.非特應性鼻息肉; ANP.特應性鼻息肉

3　討論

研究發現息肉組織中組織重塑相關轉錄因子FOXP3 mRNA表達顯著下降,而轉錄因子GATA-3 與 T-bet mRNA表達水平顯著增強。評估組織中常規主導細胞因子(IL-5, IFN-γ、IL-6、IL-8、 IL-2sR等)，有趣發現與我們團隊前期發現的結論相吻合[8,9]，即特應性息肉表現為嗜酸性免疫因子IL-5, ECP及總IgE等顯著增多并伴有Th2細胞的轉錄因子GATA-3的 mRNA表達水平顯著增強。表明特應性與非特應性鼻息肉患者中存在明顯免疫表型與炎癥模式的差異性。 目前為止，對于慢性鼻竇炎鼻息肉發病機制還尚未明了，近年來認為慢性鼻竇炎鼻息肉(CRSwNP)是一種復雜異質性疾病譜的一種單元。盡管在西方人群中普遍將CRSwNP認為Th2傾向嗜酸性炎癥性特征；然而最近研究發現在亞洲人群(中國、韓國及日本等)中鼻息肉表現為一種Th17傾向中性粒細胞性炎癥模式的特征[5，7]。在泰國人群中慢性鼻竇炎伴鼻息肉雖表現為Th17//Th1傾向中性粒細胞炎癥特征，但隨著時間向Th2轉化特征[10]。預示著慢性鼻竇炎鼻息肉發病機制隨著地區差異而表現出不同的特征；不僅在不同國家、種族之間有差異而且同一國家不同地方之間也表現出不同發病機制特征[11]。前期國內研究報道，在我國沿海與中部地區慢性鼻竇炎鼻息肉表現出不同炎癥模式并其與上呼吸道不同細菌類型感染相關[11,12,]。有趣的是本研究發現作為分化Th1細胞的關鍵轉錄因子T-bet在兩種息肉中均有增高現象，可能細菌對抗獲得性免疫反應在早期鼻息肉發病機制中的作用較為顯著[13]。

我們關注細菌感染因素在變應性鼻息肉發病機制中的作用，結果表明轉錄因子GATA-3在特應性息肉中顯著高于非特應性息肉組，眾所周知GATA-3是分化Th2細胞及控制產生相應細胞因子的關鍵性轉錄因子。而IL-5在嗜酸性粒細胞的募集和凋亡過程中起到中軸調節作用，如此在特應性鼻息肉中GATA-3 和IL-5的同時升高，明確闡述變應性因素導致局部IgE升高和大致嗜酸性反應的加劇。特應性在慢性鼻竇炎鼻息肉中病理機理及臨床癥狀中的重要作用已經闡述多年，然而變應性作為潛在致病因素在伴有或不伴有鼻息肉慢性鼻竇炎中的作用仍在爭論不休[14,15]。不過有更多研究證實特應性與非特應性CRSwNP患者表現不同免疫炎癥機制特征。如；Hamilos等報道[8]，特應性與非特應性CRSwNP亞型顯現不同細胞因子表達趨勢，其中特應性亞型中主要以IL-4 和IL-5為主，而非特應性亞型中以IFN-γ為主導。最近Peric等[16]發現,變應因素未能改變CRSwNP患者的各項臨床參數，包括癥狀、CT及鼻內窺鏡檢查結果，但是發現變應性CRSwNP患者鼻腔分泌物中嗜酸性細胞及IL-4、IL-5及 IL-6濃度顯著高于非變應組。而在Scavuzzo等[9]也研究提示，特應性CRSwNP患者中總IgE 和IL-8的濃度顯著高于非特應性CRSwNP。上述研究結論與我們的結果完全相符，發現特應性息肉組織中強化嗜酸性反應，增強GATA-3 mRNA表達及IL-5、 ECP和總IgE濃度顯著高于非特應組。由此表明不論地域、種族差異，特應性CRSwNP患者能夠表現出嗜酸性炎癥模式之特征。通過本研究發現，變應原因素也是我國人群CRSwNP發病的重要病因之一，同時闡明了傳統意義上鼻息肉發病中軸作用的嗜酸性免疫指標IL-5, ECP和 IgE等，在不同亞型息肉中表現出截然不同的差異性。

盡管有眾多相關資料強調變應性因素在 CRSwNP發病機制中核心作用，但還有待于展開更深入研究來闡述其確切病理機制。為此，新近研究表明局部IgE產生，在特應性CRSwNP組織中驅動嗜酸性炎癥反應起到核心作用[17]。例如；Bachert等[18]報道，西方人群鼻息肉組織中的總IgE和特殊IgE抗原與局部嗜酸性炎癥反應密切相關。最近亞洲眾多研究證實，鼻息肉發病中肥大細胞表面具有分化及轉化IgE、產生IgE及IgE局域作用[19]。更有趣的是，Cao等[20],研究發現鼻息肉局部IgE產生，源于常見空氣致敏原介導肥大細胞激活并促成鼻息肉中嗜酸性炎癥反應的結果。為了觀察局部IgE產生如何在變應性或嗜酸性炎癥中的重要作用機制，我們建立體外模型刺激實驗。用抗-IgE刺激新鮮息肉組織觀察組織中各種炎癥介質釋放情況，發現兩組亞型息肉中均有IL-5, IL-2及 IL-17等釋放顯著升高，其中在特應性息肉中IL-5、 IL-2和IL-17A等釋放高于非特應性息肉組。本研究結果能夠初步闡述，空氣致敏因素導致鼻息肉中IgE介導炎癥反應性免疫機制作用。另外能夠為變應性鼻息肉IgE介導炎癥反應的靶向干預提供理論根基。我們的結論認為，變應性因素在慢性鼻竇炎鼻息肉發病過程中起到重要作用，推斷局部IgE產生能夠募集更多嗜酸性細胞并且導致Th2傾向性免疫反應等。

4　結論

由于系統性致敏因素在慢性鼻竇炎伴鼻息肉發病機制中作用尚未清楚，本研究發現特應性鼻息肉中主要以IL-5、 ECP和總IgE等嗜酸性炎癥反應的免疫指標增高為主，同時Th2轉錄因子GATA-3 mRNA 顯著升高。但特應與非特應兩組息肉中均表現FOXP3 mRNA顯著降低。體外抗IgE刺激后特應性息肉中釋放更多IL-5、 IL-2及IL-17等炎癥介質。認為特應息肉與非特應性息肉各自具有獨特免疫表型及炎癥模式特征，提示對該病治療策略上能反映有效靶向目標提供臨床參考。

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Characterization of inflammatory profiles in atopic and nonatopic nasal polyps

HANG Yuan1, YU Wenxing1, BA Luo2,et al

(1.DepartmentofOtorhinolaryngology,HeadandNeckSurgery,CentralHospitalofShuining,Suining629000,Sichuan,China; 2.DepartmentofOtorhinolaryngology,ThePeople’sHospitalofTibetAutonomousRegion,Lhasa850099,China; 3.TheUpperAirwaysResearchLaboratory,DepartmentofOtorhinolaryngology,HeadandNeckSurgery,WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

ObjectiveThis study sought to characterize the pattern of cytokines and immune-type in nasal polyp tissues with and without atopic patients. MethodsAtopic and nonatopic polyp and normal tissues were collected from 85 CRSwNP patients and 36 control subjects. The levels of Th cells cytokine and inflammatory mediators in tissue homogenates were measured using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). sIgE in serum and prick skin for determining of Atopic were detected. The mRNA levels of relative transcription factors were determined using quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR). The anti-IgE stimulated polyp tissues in vitro were did for further verified. Results Atopic CRSwNP patients were characterized by enhanced eosinophilic inflammation (elevated IL-5, ECP and total IgE), and significantly increased GATA-3 mRNA level (P<0.05). However, both atopic and non-atopic CRSwNP patients showed decreased FOXP3 mRNA expression (P<0.05). After anti-IgE stimulation, atopic polyps released more IL-5, IL-2 and IL-17 in the supernatant of stimulated polyp tissues than nonatopic. ConclusionAtopic and nonatopic nasal polyp patients carry on different immuny-type and profile of different inflammation response in polyp tissues.

Nasal polyps; Atopy; Cytokine; T help cell; IgE

國家自然科學基金(81560172；81260158)

巴羅Email：bhanor@163.com

R 765.25

Adoi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.10.007

2016-04-05； 編輯： 陳舟貴)