產雌馬酚梭菌C1對小雞沙門氏菌攻毒保護效果

尹業師，方　丹，朱立穎，劉　偉，吳　健，王　欣，*

(1. 浙江省農業科學院 植物保護與微生物研究所/農產品質量安全國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 310021；2. 華中農業大學 動物醫學院，湖北 武漢 430070)

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產雌馬酚梭菌C1對小雞沙門氏菌攻毒保護效果

尹業師1，方丹2，朱立穎1，劉偉1，吳健2，王欣1，*

(1. 浙江省農業科學院 植物保護與微生物研究所/農產品質量安全國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 310021；2. 華中農業大學 動物醫學院，湖北 武漢 430070)

部分梭菌對機體的免疫系統具有明顯的調節作用，可開發成新型益生菌。由于雞盲腸內容物中梭菌含量較高，從小雞肓腸內容物中分離培養功能性梭狀芽孢桿菌，并在小雞中初步研究其對沙門氏菌攻毒的保護效果。該研究首先采用梭菌選擇性培養基，從小雞肓腸內容物中分離獲得了一株可以將大豆素轉化為雌馬酚的革蘭氏陽性纖維狀梭菌C1，以四環素為對照，研究梭菌C1對小雞沙門氏菌攻毒的保護作用。結果表明，梭菌C1組和四環素組均具有降低肓腸內容物中沙門氏菌活菌數和促進小雞生長的功能，推測梭菌C1具有開發為四環素替代品的潛能。雖然較高濃度的S-雌馬酚(5 mg·mL-1)在體外對沙門氏菌有一定的抑制作用，梭菌C1也具有將大豆素轉化為雌馬酚的能力，但梭菌C1在體外對沙門氏菌的抑制作用并不明顯，其益生機制還有待進一步研究。

梭菌；雌馬酚；小雞；沙門氏菌

隨著“超級細菌”的報道與流行，細菌的抗菌素耐藥越來越受到關注。在細菌抗菌素耐藥日趨嚴峻的形勢下，很多學者把耐藥菌的產生歸因于畜禽抗菌素的濫用[1-2]。歐盟很多國家已經禁止使用抗菌素作為動物促生長劑，而抗菌素替代品——益生菌的應用前景廣闊。目前，商用的益生菌主要是乳酸菌和雙歧桿菌，但家禽消化道中的優勢菌群主要為擬桿菌和梭菌[3-4]，所以尋求新的益生菌迫在眉睫。雖然有些擬桿菌和梭菌是條件性致病菌，但最近研究表明，很多擬桿菌和梭菌均有助于宿主對營養物質的消化利用及調控宿主免疫系統的發育成熟[5-8]。所以，開發新的擬桿菌和梭菌在益生菌定殖和功能發揮方面具有一定優勢。

梭狀芽孢桿菌是硬壁菌門中一類革蘭氏陽性桿狀細菌，具有產生內孢子和在惡劣條件下存活的生態優勢。盡管有些梭菌由于能產生毒素類物質而具有致病性，但大部分梭菌與宿主之間維持著共生關系。ⅩⅣa簇和Ⅳ簇梭菌占腸道總菌的10%～40%[4]，能夠產生各種具有生物活性的酶，以幫助宿主降解利用宿主自身無法消化的多糖和寡糖類物質[5]，其降解產物包括乙酸、丙酸和丁酸等重要的能量來源物質。最新研究發現，ⅩⅣa簇和Ⅳ簇梭菌具有調節宿主免疫系統發育和成熟的功能[6]，由梭菌屬ⅩⅣa簇和Ⅳ簇組成的46株梭菌的復合物，具有促進腸道上皮T淋巴細胞和免疫球蛋白A(IgA)分泌細胞分化增殖的能力[7]。因此，從雞腸道內容物分離培養梭狀芽孢桿菌，研究其生理功能顯得尤為重要。

本研究采用梭菌選擇培養基，從雞盲腸內容物中分離獲得了一株可以將大豆素轉化為雌馬酚的梭狀芽孢桿菌C1。沙門氏菌攻毒保護試驗表明，梭菌C1具有抑制沙門氏菌定殖和促進小雞生長的功能。

1　材料與方法

1.1梭菌C1的分離鑒定

15日齡AA肉雞購自浙江大學海寧種雞場。小雞用乙醚麻醉后，直接扭頸處死，腹腔解剖后將肓腸轉移到37 ℃厭氧工作站(英國Electrotek公司)。稱取小雞肓腸內容物0.2 g，加入2 mL滅菌PBS，混勻后配制成10%的懸液。再用PBS將10%的懸液按10-2，10-4，10-6和10-8進行梯度稀釋，然后取各個稀釋度菌液100 μL涂布在梭菌選擇培養基平板上(青島海博生物技術有限公司)。平板在37 ℃厭氧工作站內倒置培養3 d后，挑取乳白色菌落至液體梭菌培養基中(青島海博生物技術有限公司)，靜置培養5 d后將菌液離心沉淀(5 000g離心 5 min)，然后用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit試劑盒(Qiagen)進行細菌基因組DNA提取。采用細菌16S rDNA全長通用引物27F和1492R進行PCR擴增。PCR反應體系為25 μL，具體操作步驟參照TaKaRa ExTaq說明書進行。采用革蘭氏染色液(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)和生物顯微鏡CX51(OLYMPUS)對梭菌C1進行形態學觀察。

1.2梭菌C1產雌馬酚能力檢測

將121 ℃高壓滅菌20 min的BHI培養基分裝到試管中，每管5 mL，然后加入5 μL濃度為5 mg·mL-1的大豆素貯存液，混勻后接種活化好的梭菌C1 50 μL，在37 ℃厭氧工作站中靜置培養96 h后收集發酵液。發酵液5 000g離心 5 min，將900 μL上清液用等量的乙酸乙酯萃取抽提3次，然后將萃取的上清液混合，45 ℃冷凍離心濃縮成粉末，加入200 μL甲醇溶解，經0.22 μm聚偏氟乙稀微孔濾膜過濾后，參照王宇等[9]的方法，使用HPLC對溶液中的雌馬酚濃度進行檢測。

1.3梭菌C1菌懸液和發酵液上清對沙門氏菌的體外抑制試驗

配置1.2%的LB瓊脂平板，用一次性細菌接種環將過夜培養的沙門氏菌劃線接種到冷卻凝固的LB平板上，然后將直徑6 mm的無菌濾紙片輕輕放入平板中，將5 μL梭菌C1菌懸液、梭菌C1發酵液上清、四環素水溶液(2 mg·mL-1)及不同濃度的S-雌馬酚溶液(0.2，1.0和5.0 mg·mL-1)和相應的有機溶劑甲醇分別點到濾紙片上。平板在37 ℃細菌培養箱內倒置培養14 h后觀察抑菌圈大小。

1.4梭菌C1對小雞沙門氏菌攻毒保護試驗

1.4.1試驗動物

剛出殼清潔級Ross308肉雞，購自浙江大學海寧種雞場。

1.4.2試驗日糧

所喂飼料參照文獻[10]的配方配制。

1.4.3試驗用菌株

梭菌C1為本研究從小雞肓腸內容物中分離獲得；沙門氏菌CVCC519購自中國獸醫藥品監察所。菌株活化后保存在4 ℃冰箱備用。

1.4.4飼養試驗設計

將剛出殼的小雞平均分成3組，分別標記為梭菌C1組、四環素組和對照組。每組小雞初始體質量平均為(44±1.1)g。每組設2個平行，每個平行各10只小雞。梭菌C1組小雞每天每只經口腔用灌胃針灌喂0.2 mL活化好的梭菌C1(2×107cfu·mL-1)，連續灌喂5 d；四環素組按0.1 g·mL-1的量將四環素添加在飲水中，小雞自由飲用，每天更換1次；對照組不進行任何干預。6日齡時對所有小雞進行沙門氏菌攻毒，每只小雞灌喂0.2 mL活化好的沙門氏菌菌液(2×107cfu·mL-1)，連續灌喂2 d。攻毒后，梭菌C1組再用梭菌C1菌液灌喂2 d，四環素組再在飲水中添加0.1 g·mL-1四環素2 d，此后不再進行干預。所有試驗組小雞均自由采食飲水。

1.4.5小雞平均體質量檢測

分別在沙門氏菌攻毒后第2，9，16和23天記錄每只小雞體質量，并計算平均體質量。

1.4.6沙門氏菌活菌數檢測

分別在沙門氏菌攻毒后第2，9，16和23天隨機選取每個試驗組4只小雞，每個平行各2只，解剖后取其盲腸內容物。用電子天平稱取0.1 g盲腸內容物，迅速加入0.9 mL PBS充分混勻。將稀釋好的雞盲腸內容物再用PBS依次進行梯度稀釋，然后分別取10-4，10-5，10-6，10-7四個稀釋度的菌液各100 μL涂布到可用于沙門氏菌鑒別的選擇性瓊脂平板DHL上，37 ℃培養過夜后進行菌落記數。

1.5數據統計

試驗數據采用SPSS 20.0進行平均值與標準誤差分析及統計學檢驗。

2　結果與分析

2.1梭菌C1的分子生物學鑒定與形態學觀察

對梭菌C1的16S rRNA序列PCR產物進行Sanger測序，然后對所得序列在NCBI數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行BLAST比對分析，結果顯示，梭菌C1與從人糞便樣品中分離到的一株產雌馬酚梭菌TM-40相似度最高，其16S rRNA基因的DNA序列相似性達到100%。形態學觀察表明，梭菌C1是一種具有分節的纖維狀革蘭氏陽性菌(圖1)。綜上所述，推測梭菌C1可能是一株新的具有產生雌馬酚能力的梭菌。

圖1　梭菌C1革蘭氏染色結果Fig.1　Gram stain results of the Clostridium C1

2.2梭菌C1產S-雌馬酚能力檢測

由于梭菌C1與雌馬酚產生菌TM40同源性最高，本研究對梭菌C1是否也具有雌馬酚產生能力進行了檢測。從圖2的HPLC檢測結果可以看出，與S-雌馬酚標準品相比，梭菌C1發酵液在約9.5 min時也能檢測到相對應的光譜吸收峰，說明梭菌C1在體外具有將大豆素轉化為S-雌馬酚的能力。

2.3梭菌C1和S-雌馬酚對沙門氏菌的體外抑制試驗

平板抑菌圈試驗結果顯示，無論有氧還是厭氧條件下，四環素對沙門氏菌均出現明顯的抑菌圈，而梭菌C1菌懸液及其上清液周圍沒有出現明顯的抑菌圈(圖3)，說明梭菌C1在體外對沙門氏菌的抑制效果不明顯。從圖3可以看出，S-雌馬酚溶液在體外對沙門氏菌的生長有一定的抑制作用，但其抑制作用具有濃度依賴性，只有5 mg·mL-1S-雌馬酚溶液周圍出現了較明顯的抑菌圈。

A： S-雌馬酚標準品； B： 梭菌C1發酵液樣品。圖2　HPLC檢測梭菌C1發酵液中的雌馬酚含量Fig.2　Equol concentration in Clostridium C1 fermentation broth using HPLC

1： 梭菌C1菌懸液； 2： 梭菌C1發酵液上清； 3： 四環素； 4： 甲醇； 5： 0.2 mg·mL-1 S-雌馬酚； 6： 1 mg·ml-1 S-雌馬酚； 7： 5 mg·mL-1 S-雌馬酚。圖3　不同處理對沙門氏菌的體外抑制效果Fig.3　Inhibition effects on the growth of Salmonella by different treatments

2.4梭菌C1對小雞的促生長作用

如圖4所示，四環素組小雞生長速度最快，在沙門氏菌感染后第9天小雞平均體質量就明顯高于對照組(P<0.01)，一直到試驗結束即沙門氏菌感染后第23天，四環素組小雞平均體質量仍明顯高于對照組(P<0.05)。梭菌C1組在沙門氏菌感染后第2天生長速度就比對照組快，尤其是在沙門氏菌感染后第16和23天，其平均體質量顯著高于對照組(P<0.05)。雖然在沙門氏菌感染后第9天，四環素平均體質量顯著高于梭菌C1組，但到感染后第16和23天，梭菌C1組與四環素組之間沒有顯著差異(P>0.05)，說明梭菌C1與四環素對小雞具有類似的促生長功能。

沙門氏菌感染后，相同時間不同處理間無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖4　小雞平均體質量Fig.4　Average weight of chicken

2.5梭菌C1對小雞肓腸內容物中沙門氏菌活菌數的影響

如圖5所示，與對照組相比，四環素組沙門氏菌活菌數持續下降，在沙門氏菌感染后第2天，四環素組小雞肓腸內容物中沙門氏菌活菌數顯著低于對照組(P<0.05)，到感染后第23天，已經檢測不到沙門氏菌活菌的存在。梭菌C1組的沙門氏菌活菌數在感染后第2天即少于對照組，從感染后第9天直到試驗結束即感染后第23天，梭菌C1組的沙門氏菌活菌數均顯著低于對照組。但在試驗中，只在感染后第2和9天，梭菌C1組與四環素組間沙門氏菌活菌數無顯著差異(P> 0.05)；在感染后第16和23天，梭菌C1組沙門氏菌活菌數極顯著高于四環素組(P<0.01)，說明梭菌C1處理只在短期內具有與四環素類似的抵御沙門氏菌繁衍和定殖的效果。

沙門氏菌感染后，相同時間不同處理間無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖5　小雞盲腸內容物沙門氏菌活菌計數Fig.5　Numbers of live Salmonella in chicken cecal contents

3　結論與討論

沙門氏菌感染是一種動物源性人畜共患病，嚴重影響公共健康、食品安全和動物生產[11]。迄今為止，疫苗和抗菌素對沙門氏菌的防治效果還不是很理想[12-13]。竟爭性排斥益生菌曾被認為是一種防治沙門氏菌感染的替代療法[14]。目前，很多學者正在試圖從環境樣品中分離對沙門氏菌具有防治作用的益生菌。Yang等[15]對小豬和小雞腸道來源乳酸產生菌防治沙門氏菌的效果和防治機制進行了初步研究，發現乳酸產生菌雖然在體外對沙門氏菌生長具有抑制作用，但在小雞腸道內卻不能減少沙門氏菌活菌數，本研究結果與此存在一定的差異。盡管益生菌可能通過多種途徑抑制沙門氏菌在胃腸道內的定殖和繁衍，但產生抗菌類物質仍是其最直接和最主要的途徑[16]。Yang等[15]推測乳酸產生菌在體內不能減少腸道沙門氏菌定殖的原因可能是乳酸產生菌在腸道環境中沒有分泌抗菌類物質。本研究中，雖然體外試驗沒有觀察到梭菌C1對沙門氏菌有明顯的抑制效果，但動物試驗卻表明，梭菌C1組小雞肓腸內容物中沙門氏菌活菌數明顯減少。這可能是由于梭菌C1在體內分泌或積累了更多的抗菌類物質如S-雌馬酚，或者梭菌C1具有刺激宿主免疫的功能，從而達到在體內間接抑制沙門氏菌的功效。雖然已有大量學者對益生菌的益生效果和作用機制進行了研究，但各自研究結果間存在著一定的差異，這可能是不同益生菌的防治效果和作用機制有所不同所致。Yang等[15]研究發現，乳酸產生菌防治沙門氏菌的益生機制可能是減少脾臟和肝臟沙門氏菌的數量及降低沙門氏菌毒力基因的表達。Eloe-Fadrosh等[17]研究報道，鼠李糖乳桿菌LGG的益生機制可能是通過促進其他腸道菌群(包括擬桿菌屬、雙歧桿菌屬等)的生長，從而促進免疫系統的健康發育。

綜上所述，不同益生菌防治沙門氏菌感染的生理活性表現形式和作用機制存在差異。本研究從小雞肓腸內容物中分離獲得了一株雌馬酚產生梭菌C1，雖然體外抑制試驗結果表明，梭菌C1或其發酵液上清對沙門氏菌的生長并沒有明顯的抑制作用；但動物試驗結果表明，梭菌C1不僅可以減少小雞體內沙門氏菌活菌數，還能促進小雞生長，其作用機制有待進一步研究。

大豆異黃酮具有促進畜禽生長和乳腺發育、提高動物繁殖力和泌乳性能、增強機體免疫力等功能，且食品中大豆異黃酮等天然植物雌激素對人類健康有益。因此，大豆異黃酮作為一種新型飼料添加劑具有較大的開發價值和廣闊的應用前景。臨床上大豆異黃酮的療效主要歸功于其代謝產物S-雌馬酚[18]。S-雌馬酚是一種植物雌激素，是大豆異黃酮在哺乳動物腸道中經微生物轉化后的代謝產物，其生物學活性包括雌激素樣活性[19]、抗氧化活性[20]等均較其前體大豆素強。但機體將大豆素代謝轉化為雌馬酚的能力具有個體差異，亞洲人群中只有30%～50%的人具有將大豆異黃酮轉化為雌馬酚的能力，在大白母豬糞便中雌馬酚的個體差異系數也可以達到60%以上[21]。所以在以豆制品為主要飼料來源的養殖業中，以雌馬酚產生菌作為益生菌將能更好地發揮大豆異黃酮的生物功能。

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(責任編輯侯春曉)

Protective effect of an equol-producing Clostridium C1 against Salmonella infection in chicken

YIN Ye-shi1， FANG Dan2， ZHU Li-ying1， LIU Wei1， WU Jian2， WANG Xin1，*

(1.InstituteofPlantProtectionandMicrobiology，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences/StateKeyLaboratoryofBreedingBaseforAgriculturalProductQualitySecurity，Hangzhou310021，China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan430070，China)

SomeClostidiumcould regulate the development of the host immune system. Hence， theseClostidiumstrains had the potential to be used as probiotics. Since the population ofClostridiumin chicken cecal contents was relative high， the aims of this study were to isolate functionalClostidiumstrains from chicken cecal contents and subsequently study their protective effect againstSalmonellainfection. In this study， a Gram-positive filamentousClostridiumsp C1 which could transfer daidzein to equol， was isolated from chicken cecal contents and then the animal experiments were conducted to study the protective effect ofClostridiumsp C1 onSalmonellainfection. As the tetracycline treated group did， theClostridiumsp C1 also had effect on decreasing the number ofSalmonellain cecal contents and promoting the growth of chicken. Thus， theClostridiumsp C1 had the potential to be used as a tetracycline substitute. Although， the high concentration of S-equol (5 mg·mL-1) had the function on inhibiting the growth ofSalmonellainvitroand theClostridiumsp C1 had the function of transfering daidzein to S-equol， the inhibition effects ofClostridiumsp C1 onSamonellagrowth was not observedinvitro. The probiotic mechanism ofClostridiumsp C1 need to be further studied.

Clostridium; equol; chicken;Salmonella

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.02.09

2015-07-06

國家自然基金(3100097)；“十二五”農村領域國家科技計劃(2013BAD10B02-03)

尹業師(1982—)，男，湖南邵陽人，博士，副研究員，主要從事腸道微生態與微生物資源研究。E-mail: yinyeshi@126.com

，王欣，xxww101@sina.com

S831.7

A

1004-1524(2016)02-0234-06

尹業師， 方丹， 朱立穎， 等. 產雌馬酚梭菌C1對小雞沙門氏菌攻毒保護效果[J]. 浙江農業學報， 2016， 28(2): 234-239.