氮磷營養鹽對大腸桿菌四環素耐藥性的影響

陳秀萍，肖正潤，林　晶，汪燕秋，張　潔，黃啟發，俞道進

(福建農林大學 動物科學學院，福建 福州 350002)

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氮磷營養鹽對大腸桿菌四環素耐藥性的影響

陳秀萍，肖正潤，林晶，汪燕秋，張潔，黃啟發，俞道進*

(福建農林大學 動物科學學院，福建 福州 350002)

根據臨床和實驗室標準協會(clinical and laboratory standards institute， CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法檢測泥樣中大腸桿菌對四環素的敏感性，并應用PCR法檢測四環素耐藥基因tetA，tetB，探討氮磷營養鹽對大腸桿菌四環素耐藥性影響的可能機制。結果表明：添加不同劑量氮磷營養鹽能夠導致大腸桿菌對四環素產生耐藥性，但大腸桿菌的耐藥率與劑量間無明顯相關性。37株高耐藥率大腸桿菌tetA基因的陽性率為100%，66株低耐藥率大腸桿菌tetA基因的陽性率為16.67%，而16株對藥物敏感的大腸桿菌未檢測到tetA基因；但供試大腸桿菌均未檢測到tetB基因。這表明，氮磷營養鹽誘導的大腸桿菌四環素耐藥性與tetA基因有關。

微宇宙；大腸桿菌；四環素

水體富營養化是指由于過多的營養物質(主要是氮、磷)排入水中，從而引起各類水生生物異常繁殖和生長的現象[1]，現已成為全世界需要共同面對的重大水環境問題。當環境發生改變時，細菌會通過各種變異來適應環境，而在這一過程中可能會導致細菌耐藥性的產生。國內外許多學者利用微宇宙技術對獸藥、化學物質等對生態環境的影響進行了研究：如Gorzerino等[2]通過建立24套小型水生微宇宙系統，探討了輔助劑Agral 90對2種除草劑(敵草快和氟磺胺草醚)毒性的影響；俞道進等[3]通過模擬池塘生態系統，觀察了土霉素殘留對誘導底泥細菌耐藥性的影響。

四環素類藥物為廣譜抗生素，主要用于抑制革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，已經成功應用于醫學臨床[4]。四環素類藥物主要通過阻止氨酰tRNA與核糖體結合位點(A)的結合來阻止菌體蛋白合成[5]。之前的研究顯示，細菌對四環素的耐藥性與tet基因有關。一般而言，細菌中四環素耐藥性的迅速傳播源于質粒、轉座子和整合子上tet基因的定位[6]。

本試驗以大腸桿菌作為研究對象，通過建立微宇宙，采用臨床和實驗室標準協會(clinical and laboratory standards institute， CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法檢測細菌耐藥性，研究氮磷營養鹽對水環境中大腸桿菌四環素耐藥性產生的影響；并采用PCR法檢測四環素耐藥基因tetA，tetB，探討氮磷營養鹽對大腸桿菌四環素耐藥性影響的可能機制。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1微宇宙

用于建立微宇宙的底泥系福建省福州市森林公園采集的無抗生素污染土壤；所用水為裝好適量的過濾水(單蒸水)，并在陽光下暴曬1 d。使用容積18 L的白色透明儲物箱建立微宇宙，并在外面搭建規格為3 m×3 m×2 m的帳篷，四周用白色透明的塑料膜圍起來，頂端也用塑料膜覆蓋。

1.1.2主要試劑

瓊脂糖，購于上海鼎國生物技術有限公司；四環素，購于中國藥品生物制品檢驗所；溴化乙啶，購于上海鼎國生物技術有限公司；PCR引物，由大連寶生物工程公司合成；DL Marker 2000與2×PCR Master均購于大連寶生物工程公司；5×TBE緩沖液，購于上海生工生物工程公司。

1.1.3培養基

MH(B)培養基(Mueller-Hinton Broth)，購于北京奧博星生物技術有限責任公司。伊紅美藍瓊脂(eosin-methylene blue agar，EMB)，CM105；麥康凱瓊脂(MacConkey agar)，CM908；二者均購于北京陸橋技術有限責任公司。

1.2試驗方法

1.2.1建立微宇宙及獲取菌株樣本

將高壓滅菌后的泥土分別置于8個18 L的白色儲物箱中，每個儲物箱中的底泥厚度約為5 cm，再加入16 L單蒸水，最后加入適量大腸桿菌ATCC 25922標準菌株稀釋液。在每個水位做好標記，適時補充單蒸水以保證微宇宙容積恒定。將8個儲物箱放于塑料大棚內靜置30 d左右，儲物箱之間相距大約10 cm。

在微宇宙靜置期間，測定微宇宙中總氮(TN)、總磷(TP)基底值。待系統穩定后，于水-底泥界面采樣(即為第0 d)，然后根據基底值加入已滅菌的氮(NH4NO3)、磷(NaH2PO4)營養液，并分別于第1，8，16，24，32，40，68，108天采樣，然后進行細菌的分離、純化，獲得菌株樣本。試驗設置空白組和3個處理組，每組設2個重復。參考水體富營養化標準及宋玉芝等[7]、鄭丙輝等[8]的研究設定微宇宙中TN，TP的終濃度，詳見表1。

表1微宇宙中TN，TP的處理方案

Table 1Treatments of TN and TP in microcosm

1.2.2微量肉湯稀釋法測定四環素的最小抑菌濃度(MIC)

首先，配置濃度為5 120 μg·mL-1的四環素母液，然后將其分裝于2 mL的無菌離心管中，-20 ℃冰箱保存。使用時，先用0.22 μm的無菌過濾器過濾，再稀釋10倍成工作液。

取E.coli純培養菌液在搖床中振蕩培養6 h后，取菌液在600 nm處用紫外分光光度計測定D值(MH肉湯作為參比)，然后用已滅菌的MH肉湯將菌液稀釋至(1～2)×108cfu·mL-1(D值為0.08～0.10)。接種時將前述菌液再稀釋10倍。

利用96孔U型板，在其第1至12列，分別加入100 μL含有四環素的MH肉湯，其中的四環素濃度依次為256，128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0 μg·mL-1。用移液槍吸取5μL上述稀釋好的菌液(濃度為107cfu·mL-1)加入到U型板中，蓋好蓋子。為保證試驗結果，每塊孔板的操作時間應盡量控制在15 min以內。將加樣的U型板在37 ℃恒溫培養箱中培養16～20 h，觀察結果。首先，觀察對照孔的細菌是否正常生長，以及質控菌株是否在質控范圍，同時觀察有無污染孔。然后從第11列開始依次觀察渾濁的孔(渾濁說明有細菌生長)，直到觀察到清澈的孔(細菌不生長的孔)為止，則這個清澈的孔的抗生素濃度即為最小抑菌濃度(MIC值)。細菌對抗生素的耐受程度按照CLSI的標準來判定。

1.2.3基因檢測

采用煮沸法提取大腸桿菌的基因組DNA[9]，參照Schwaiger等[10]的方法合成引物，序列見表2。反應體系：上下游引物(20 μmol·L-1)各0.8 μL，2×PCR Master 10.0 μL，DNA模板2.0 μL，用雙蒸水補足體系至20 μL。擴增程序見表3。以無菌雙蒸水作為陰性對照，以實驗室保存的標準菌株作為陽性對照。擴增好的產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用全自動凝膠圖像分析系統觀察、記錄結果。

表2PCR引物基因序列及預期產物片段

Table 2Multiple PCR primer sequences and expected product of gene segments

基因產物長度/bp引物序列ui-dA196uidA-F5'-CGATTCCGTTTCAGGGTT-3'uidA-R5'-TTTCTGATAGGACCGAGCAT-3'tetA888tetA-F5'-GTGAAACCCAACATACCCC-3'tetA-R5'-GAAGGCAAGCAGGATGTAG-3'tetB416tetB-F5'-CTCAGTATTCCAAGCCTTTG-3'tetB-R5'-CTAAGCACTTGTCTCCTGTT-3'

表3不同基因的擴增程序

Table 3Amplification conditions of different genes

擴增基因第一階段 預變性 第二階段第三階段變性 → 退火 → 延伸循環次數延伸uidA94℃3min94℃1min→58℃30s→72℃1min3572℃7mintetA94℃5min94℃1min→56℃1min→72℃1min3572℃5mintetB94℃5min94℃30s→62℃30s→72℃90s3572℃5min

2　結果與分析

2.1添加不同劑量氮磷營養鹽對大腸桿菌產生四環素耐藥性的影響

從表4可以看出，向微宇宙中添加不同濃度的氮磷營養鹽后，分離到的大腸桿菌對四環素產生耐藥性。其中，加入低劑量氮磷營養鹽后1 d，就可從微宇宙中分離得到耐藥菌株(占比6.25%)；8～24 d期間，微宇宙中耐藥的大腸桿菌占比逐漸升高(從6.25%上升至72.7%)；至32 d又略有下降；40～108 d內耐藥菌占比均為100%。加入中劑量氮磷營養鹽后，第8天才可從微宇宙中分離得到耐藥菌株(占比26.7%)；第16天微宇宙中耐藥菌占比達71.4%；至第24天下降至33.3%；32～40 d期間，微宇宙中耐藥菌占比回升至100%；但當時間延長至68 d時，未能從微宇宙中分離得到大腸桿菌，因此無法進行藥敏試驗；一直到第108天，才再次分離到大腸桿菌，耐藥菌占比為66.7%。加入高劑量氮磷營養鹽后16 d才可從微宇宙中分離得到耐藥菌株(占比56.2%)；16～32 d期間，微宇宙中耐藥的大腸桿菌占比逐漸下降；至40 d又突然上升至100%，且一直持續到108 d。不加入氮磷營養鹽的空白組，試驗全程均未分離得到耐藥大腸桿菌，僅獲得部分中介菌株。

2.2基因檢測結果

以提取的細菌DNA為模板，使用uidA基因的引物進行PCR反應，部分檢測結果如圖1所示。結果表明，擴增獲得的條帶長度符合預期，陽性率達98.05%(402/410)，說明微宇宙中分離到的細菌大部分均為大腸桿菌。

表4添加氮磷營養鹽后不同時間微宇宙中分離得到的耐藥大腸桿菌及中介菌的比例(%)

Table 4Proportions of TE resistant and intermediateE.colistrains at different time after nitrogen and phosphorous addition

處理1d8d16d24d32d40d68d108dRIRIRIRIRIRIRIRI空白組00012.5025.0020.0030.0027.3033.30100低劑量組6.2525.06.2537.562.537.572.718.262.537.5100010001000中劑量組025.026.76.6771.428.633.322.2100010000066.733.3高劑量組018.7018.756.243.735.757.19.0990.9100010001000

注：I表示敏感與耐藥的中介菌株在全部分離菌中的比例；R表示耐藥菌株在全部分離菌中的比例。

M表示DNA分子量標準； +表示陽性對照， 系實驗室保存菌株； -表示陰性對照(雙蒸水)； 1—8為不同樣本。 下同。圖1　部分樣品uidA基因的PCR檢測結果Fig.1　The PCR amplification results of uidA gene

對102株耐四環素大腸桿菌的tetA基因和tetB基因進行檢測。結果表明，選取的37株高耐藥菌tetA基因的檢測陽性率為100%，66株較低耐藥性大腸桿菌中tetA的檢測陽性率為16.67%，而16株對四環素敏感的大腸桿菌中未檢測到tetA基因。部分檢測結果如圖2所示。此外，無論是對照菌株還是在本試驗中分離得到的四環素耐藥菌，均未檢測到tetB基因。這表明添加氮磷營養鹽后，大腸桿菌對四環素耐藥性的產生可能與tetA基因有關，但與tetB基因無關。

圖2　四環素耐藥基因tetA的PCR檢測結果Fig.2　PCR detection result of tetracycline resistance gene tetA in isolated strains

3　結論與討論

本研究表明，不同劑量的氮磷營養鹽均能誘導大腸桿菌對四環素產生耐藥性，其影響程度與添加劑量無明顯相關性，但耐藥性出現的時間與劑量表現出一定的負相關性。張揚等[11]證明，tetA或tetA+tetB是導致細菌對四環素類藥物產生耐藥性的主要機制。但在本研究中，各處理條件下分離得到的大腸桿菌中均未檢測到tetB基因，但耐藥菌中可檢測到tetA基因，且該基因的檢測陽性率與分離菌群的耐藥性水平表現出一定的正相關性，表明tetA基因可能參與了氮磷營養鹽誘導的大腸桿菌四環素耐藥性的產生過程。tetA和tetB基因檢測結果的差異性可能與其來源有關。早期研究表明，tetA主要是在動物源性的菌株中被發現，而tetB主要是在從人類中分離到的菌株中檢測出[10]。

在本試驗中，微宇宙中空白組0—108 d均未檢測出tetA基因，但加入氮磷營養鹽后，部分耐藥菌中檢測到了tetA基因。這表明環境因素的改變可能會誘發細菌基因組的改變，導致耐藥基因的產生。Thevenon等[12]在對部分日內瓦湖沉積物的研究中發現了大腸桿菌和腸球菌對5種抗生素的耐藥性，并且從1970年開始，隨著湖泊富營養化程度的加深，大腸桿菌和腸球菌對5種抗生素的多重耐藥性增加，大腸桿菌的耐藥率從0.12%增加到4.6%，腸球菌的耐藥率從0.016%增加至11.6%。此外，還可以從所有泥沙樣本(包括不被污水處理廠排放的污水所影響的樣本)中擴增出aadA耐藥基因。Alvero[13]從兩個不同程度富營養化的湖泊水中分離出87份異養性細菌，其中，有71%的細菌對抗生素具有耐藥性，44%的細菌具有多重耐藥性。值得注意的是，在前述試驗中，分離出高耐藥水平菌株的湖水并沒有直接被污水所污染。所以，由營養因素誘導產生的細菌耐藥性及其耐藥機制值得進一步探討。

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(責任編輯高峻)

Effect of nitrogen and phosphorous on tetracycline resistance of Escherichia coli

CHEN Xiu-ping， XIAO Zheng-run， LIN Jing， WANG Yan-qiu， ZHANG Jie， HUANG Qi-fa， YU Dao-jin*

(CollegeofAnimalScience，FujianAgricultureandForestryUniversity，Fuzhou350002，China)

In the present study， sensitivity ofEscherichiacolistrains to tetracycline (TE) was detected by broth micro-dilution method， andtetA，tetBgenes ofE.colistrains were detected by PCR methods to explore the possible mechanisms. It was shown that addition of different concentrations of nitrogen and phosphorous induced resistance ofE.colito TE. But， there was no significant correction between TE resistance ofE.coliand nitrogen or phosphorus dose. For 37 strains with high TE resistance， the detection rate oftetAgene was 100%; for 66 strains with lower TE resistance， the detection rate oftetAgene was 16.67%; and notetAgene was detected in the strains sensitive to TE. Interestingly， notetBgene was detected in either TE resistant or sensitiveE.colistrains， which indicated thattetAgene， other thantetBgene， might be involved in the nitrogen and phosphorus induced TE resistance ofE.coli.

microcosm;Escherichiacoli; tetracycline

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.02.11

2015-01-09

國家自然科學基金項目(31272606)

陳秀萍(1989—)，女，福建永安人，在讀碩士研究生，研究方向為獸醫藥理學及獸藥新制劑。E-mail：1120643004@fafu.edu.cn

，俞道進，E-mail：yudaojin@yeah.net

S852.61；X52

A

1004-1524(2016)02-0247-05

陳秀萍，肖正潤，林晶，等. 氮磷營養鹽對大腸桿菌四環素耐藥性的影響[J].浙江農業學報，2016，28(2)： 247-251.