酶解蝦副產物制備抗氧化肽的研究

劉亞楠,王延輝,亞力坤江·阿山,錢炳俊,姚曉敏,張建華,鐘耀廣,*

(1.上海海洋大學食品學院,上海 201306;2.上海交通大學農業與生物學院,上海 200240)

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酶解蝦副產物制備抗氧化肽的研究

劉亞楠1,王延輝2,亞力坤江·阿山2,錢炳俊2,姚曉敏2,張建華2,鐘耀廣1,*

(1.上海海洋大學食品學院,上海 201306;2.上海交通大學農業與生物學院,上海 200240)

以蝦副產物為原料,采用α-胰凝乳蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶進行酶解制備抗氧化肽。酶解液經透析、Sephadex G-15凝膠過濾層析、離子交換色譜和反向高效液相色譜分離,以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力和鐵離子還原能力(FRAP)為指標進行純化,得到了高抗氧化活性組分F1。質譜分析結果表明組分F1中有三個肽,對這三個肽進行序列合成并測定其活性,發現十肽GCKVALIVVG的活性最高,其DPPH自由基清除能力按抗壞血酸當量計(AAE)為(16.10±0.02) μmol AAE/g pro,鐵離子還原能力為(245.37±0.03) μmol AAE/g pro。本實驗研究制備并分離純化得到高活性的抗氧化肽,為蝦副產物的生產應用提供了理論依據。

蝦副產物,酶解,分離純化,抗氧化肽

氧化反應會對食品和生物系統產生很多不利的影響,是引起食品腐敗,營養品質下降和食品安全的重要原因[1]。近些年,抗氧化劑在國內外得到蓬勃的發展,用途越來越廣泛。不僅用于含脂肪食品的抗氧化防御,而且作為功能因子用于保健食品及化妝品等的開發[2]。人工合成的抗氧化劑因具有潛在的副作用而受到限制[3],因此天然、無毒副作用的食源性抗氧化肽的研究成為熱點。

我國蝦類資源極為豐富,2015年我國對蝦養殖產量超過120萬t。在蝦仁加工業飛速發展的同時,產生了大量副產物,這既造成了生物資源的浪費,又污染了環境。蝦副產物中蛋白質含量較高,如果能選用合適的酶對其進行酶解制備抗氧化肽,將提高蝦副產物的利用價值[4],變廢為寶。

抗氧化肽構效關系(QSAR)的研究發現,抗氧化活性強的肽鏈N端氨基酸大多高度疏水且電荷數較低,比如丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸和亮氨酸[5];中心位置氨基酸可以形成較多的氫鍵,如精氨酸,賴氨酸和組氨酸[6]。另外,酪氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、賴氨酸和色氨酸都與抗氧化功能有關,其中C末端為酪氨酸或色氨酸等芳香族氨基酸的小肽有很強的抗氧化活性[7]。α-胰凝乳蛋白酶優先剪切羧基端為酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的肽鍵,嗜熱菌蛋白酶則從疏水性氨基酸殘基的N-側水解。因此,選擇這兩種酶組合水解應能夠獲得抗氧化活性較高的肽段。本實驗借鑒QSAR研究成果,選擇α-胰凝乳蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶對蝦副產物進行酶解,并通過透析、凝膠過濾層析、離子交換色譜和反相高效液相色譜(RP-HPLC)進行分離純化,制備得到活性高的抗氧化肽。實現了蝦副產物資源的充分利用,為抗氧化肽的制備提供新途徑。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

南美白對蝦上海海旭水產有限公司;α-胰凝乳蛋白酶(10000 U/mg protein)、嗜熱菌蛋白酶(175 U/mg protein)、三硝基苯磺酸(TNBS)、HPLC標準肽混合物H2016、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)購自美國Sigma-Aldrich公司;透析袋美國Spectrum公司;Sephadex G-15、DEAE Sephacel美國GE公司;乙腈(色譜級)德國Merck Millipore公司;三氟乙酸(TFA)、鄰苯二甲醛(OPA)國藥集團化學試劑有限公司。

多功能粉碎機上海正慧工貿公司;恒溫水浴鍋上海齊欣儀器公司;恒溫干燥箱德國Binder公司;臺式pH計瑞士Mettler-Toledo公司;5424型高速冷凍離心機德國Eppendorf公司;UVmini-1240型分光光度計日本Shimadzu公司;旋轉蒸發器、電腦數顯恒流泵、自動部份收集器上海滬西分析儀器廠;高效液相色譜系統(600 Controller 泵;717 plus自動進樣器;2996紫外檢測器;Anpel LAG-5000G無油空氣發生器)美國Waters公司;酶標儀瑞士帝肯公司;納升液相色譜-四極桿飛行時間串聯質譜聯用儀德國Bruke Dionex公司。

1.2實驗方法

1.2.1原料準備將南美白對蝦剝除蝦仁后將剩余的蝦頭與蝦殼洗凈,放于恒溫干燥箱中60 ℃烘16 h,用多功能粉碎機粉碎,并過60目篩。

1.2.2蝦副產物總蛋白最佳提取時間的確定稱取0.4 g的蝦殼粉,加入6 mL磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L,pH8.0)中,37 ℃搖床分別孵育0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4和6 h。利用Bradford試劑盒測定總蛋白液濃度[8]。

1.2.3最佳酶解時間的確定采用α-胰凝乳蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶依次水解上述蝦副產物蛋白提取液。首先添加1.12%(w/w)的α-胰凝乳蛋白酶于pH8.0、37 ℃條件下對蛋白液分別酶解0.25、0.5、1、2、4和6 h,測定蛋白水解度(DH)。確定α-胰凝乳蛋白酶的最佳酶解時間。然后,對其酶解液進行第二步酶解。添加0.56%(w/w)的嗜熱菌蛋白酶于pH8.0,70 ℃分別酶解1、2、4、6、8 h,以DH為指標選取最佳酶解時間。

DH的測定參考Adler-Nissen[9]方法并進行修改:取0.1 mL酶解液樣品于試管中,加入2.2 mL磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L,pH 8.2)和2 mL 0.1% TNBS溶液混勻,50 ℃避光水浴1 h。加入4 mL 0.1 mol/L鹽酸終止反應,室溫靜置30 min,于340 nm測定混合液吸光值。以不同濃度的L-亮氨酸替代樣品,作標準曲線。按照下式計算[10]:

式中:ht為反應后氨基態氮濃度(mmol/g);h0為反應前氨基態氮濃度(mmol/g);htot為每克原料蛋白的肽鍵毫摩爾數(mmol/g),蝦副產物的htot=8.073 mmol/g[11]。

1.2.4抗氧化肽的分離純化

1.2.4.1透析將上述酶解液依次利用1000 u和500 u的CE透析袋于去離子水中進行透析12 h,每4 h換液1次。取<500 u和500～1000 u兩種組分,分別測定兩組分的抗氧化活性,方法見1.2.6。選擇活性較高的組分進行下一步分離純化。

1.2.4.2凝膠過濾層析將上述組分經旋轉蒸發濃縮后,用Sephadex G-15(1.6 cm×90 cm)凝膠柱層析分離,上樣量為1 mL。洗脫液為去離子水,流速為0.5 mL/min,每管按3 mL收集,共收集100管,于214 nm檢測[12]。測定各洗脫峰的抗氧化活性,選取抗氧化活性高的組分,進行下一步分離純化。

1.2.4.3離子交換色譜將洗脫峰收集后濃縮,用于離子交換色譜,上樣量為2 mL。洗脫液為NaCl溶液(溶解在0.05 mol/L,pH8.0 Tris-HCl緩沖液中),流速為0.8 mL/min,每管收集4 mL,按表1進行洗脫,于214 nm檢測其吸光值。收集各峰,旋轉蒸發濃縮后檢測活性,選取活性較高的組分進行下一步分離純化。

表1　DEAE Sephacel離子交換色譜洗脫程序

1.2.4.4RP-HPLC將抗氧化活性較強的洗脫峰收集后,采用RP-HPLC進一步分離。色譜條件:C18反相色譜柱Inersil ODS-3(4.5 nm×250 nm),檢測波長215 nm;流動相:A液,0.05% TFA超純水;B液,0.05% TFA+100% CH3CN,以A、B液各50%進行洗脫,流速0.5 mL/min。

1.2.4.5質譜分析采用納升液相色普-四極桿飛行時間串聯質譜聯用儀對抗氧化肽組分G1-2-1進行鑒定,實驗條件如下:色譜條件:使用Thermofisher Dionex C18柱(150 mm×75 um,3 μm)作為色譜柱,流動相分別為含0.1%葉酸的乙腈溶液和含0.1%葉酸的雙蒸水(過0.22 μm的水系濾膜),實驗采用梯度洗脫的方式,流速為250 nL/min;柱后按分流比為1∶50進行分流;監測和記錄205～400 nm范圍內的紫外光譜;柱溫為58 ℃。質譜條件:負離子模式檢測;檢測范圍350～1500 m/z;樣品孔電壓20 V;源毛細管電壓2100 V;MCP檢測電壓2100 V;噴霧氣流量設為2 L/min;脫溶劑的氣流量設為350 L/h;脫溶劑溫度設為150 ℃;離子源溫度是100 ℃;序列搜索軟件:mascot2.4。

1.2.5多肽含量的測定根據Church[13]的OPA方法進行改進:將40 mg OPA溶于1 mL甲醇中,與2.5 mL 20%(w/w)SDS溶液和25 mL 0.1 mol/L四硼酸鈉溶液混合,并添加0.1 mLβ-羥基乙醇,最后用去離子水定容至50 mL,制成OPA溶液。將50 μL組分與2 mL OPA液混合,室溫反應2 min,立即于340 nm下測定吸光值。

1.2.6抗氧化活性的測定

1.2.6.1DPPH自由基清除率參照Saiga等[14]的方法進行測定,并將結果表示為抗壞血酸(AAE)當量。

1.2.6.2鐵離子還原能力(FRAP)參照Benzie等[15]的方法進行測定。

1.2.7多肽的合成確認抗氧化肽的氨基酸序列之后,通過吉爾生化上海有限公司按測定多肽序列進行合成,方法采用固相多肽合成技術[16]。合成多肽后,對其進行抗氧化活性鑒定。

1.2.8數據統計分析實驗均至少重復了三次平行實驗,每次平行實驗設置三組平行。利用IBM SPSS 19.0軟件對數據進行單因素方差分析,p<0.05表示具有顯著性差異。

2　結果與討論

2.1蝦副產物總蛋白提取時間優化

選取不同濃度的小牛血清蛋白(BSA)在562 nm處測定吸收值,繪制標準曲線見圖1,蝦副產物總蛋白濃度隨時間變化見圖2。結果顯示,隨著提取時間的增長,水溶性蝦蛋白濃度逐漸上升,1.5 h時水溶性蝦蛋白濃度達到23.14%±0.01%,2 h時水溶性蝦蛋白濃度為23.49%±0.01%,此后3、4、6 h得到的水溶性蝦蛋白濃度無顯著增長(p>0.05)。故選取2 h為蝦蛋白提取時間。

圖1　BSA標準曲線Fig.1　Standard curve of BSA concentration

圖2　不同時間下蝦副產物總蛋白濃度曲線Fig.2　Protein concentration at different times

2.2酶解時間的確定

蛋白質水解度是指蛋白質酶解過程中,被裂解的肽鍵占總肽鍵數的百分比。亮氨酸濃度的標準曲線見圖3。一個亮氨酸分子被認為含有一個α-氨基,因此以亮氨酸的濃度表示α-氨基的濃度,從而計算出相應的水解度。

圖3　亮氨酸標準曲線Fig.3　Standard curve of Leucine

用α-胰凝乳蛋白酶對蝦副產物提取液進行酶解,得到蝦副產物水解度隨時間變化的曲線見圖4。如圖所示,隨著時間的增長,DH逐漸增大,在4 h時DH達到16.43%,6 h時為16.49%,兩者無顯著差異(p>0.05)。故選用4 h作為α-胰凝乳蛋白酶最佳水解時間,對蝦副產物進行批量水解,供第二步酶解使用。

圖4　蝦副產物α-胰凝乳蛋白酶水解度曲線Fig.4　Effect of enzymolysis time on the DH of α-chymotrymotrypsin hydrolysate

用嗜熱菌蛋白酶對α-胰凝乳蛋白酶酶解液進行第二步酶解,得到DH變化如圖5所示。由圖可知,隨著時間的增長,DH逐漸上升,6 h時DH達到5.50%,8 h時為5.60%,6 h后變化不大(p>0.05)。因此選6 h為嗜熱菌蛋白酶最佳酶解時間,批量制備酶解液,進行下一步分離純化。第二步酶解的水解度低于第一步酶解,這可能與蝦副產物蛋白的自身氨基酸序列和酶的特異性切割位點組成有關。

圖5　嗜熱菌蛋白酶水解度曲線Fig.5　Effect of enzymolysis time on the DH of Thermolysin hydrolysate

2.3抗氧化肽的分離純化

2.3.1透析已報道的生物活性肽的相對分子質量(Mw)大多在3000 u以下,抗氧化肽多是2000 u以下的短肽[17]。故選用1000 u和500 u的CE透析袋依次對酶解液進行透析,得到<500 u和500～1000 u兩種組分。為比較不同組分的抗氧化活性,需確定其肽濃度。首先,以HPLC標準肽混合物H2016作為參照,繪制了肽濃度的標準曲線(見圖6)。所得標準曲線中,肽標準物濃度和吸光度值的相關系數R2=0.9999,線性相關性較強,可用公式y=0.2904 x+0.001計算透析后各組分的濃度。然后,建立了抗壞血酸DPPH自由基清除能力標準曲線(如圖7)和FRAP體系測抗氧化能力所用的標準曲線(如圖8)。

圖6　多肽濃度標準曲線Fig.6　Standard curve of peptide mixture concentration

圖7　抗壞血酸的DPPH自由基清除能力標準曲線Fig.7　Standard curve of DPPH radical scavenging ability of AAE

圖8　抗壞血酸的鐵離子還原能力標準曲線Fig.8　Standard curve of ferric reducing antioxidant power of AAE

圖9　兩種組分的抗氧化活性Fig.9　The antioxidant activity of two components

如圖9所示,兩種不同相對分子質量的蝦副產物水解組分均顯示出一定的DPPH自由基清除能力和鐵離子還原能力。其中<500 u組分的DPPH自由基清除能力為(1.99±0.01) μmol AAE/g,鐵離子還原能力為(9.46±0.37) μmol AAE/g;500～1000 u組分表現出較強的抗氧化活性,上述兩指標值分別為(3.87±0.03) μmol AAE/g和(14.65±0.08) μmol AAE/g。選擇500～1000 u的組分進行下一步分離純化。

2.3.2凝膠過濾層析所得500～1000 u的組分經Sephadex G-15凝膠過濾層析色譜柱分離,洗脫曲線和抗氧化活性分別如圖10和圖11所示。由結果可知,通過凝膠層析,共得到3個分離組分(G1至G3)?；钚澡b定表明G1具有最強的抗氧化活性,其DPPH自由基清除能力為(7.96±0.06) μmol AAE/g,鐵離子還原能力為(53.11±0.21) μmol AAE/g,因此選擇G1進行下一步的分離純化。

圖10　Sephadex G-15凝膠過濾色譜Fig.10　Elution profile of peptides on Sephadex G-15 chromatography

圖11　Sephadex G-15洗脫組分的抗氧化活性Fig.11　The antioxidant activity of components purified by Sephadex G-15 chromatography

圖12　G1的DEAE Sephacel離子交換色譜圖Fig.12　Elution profile of fraction G1through DEAE Sephacel chromatography

圖13　DEAE Sephacel洗脫組分的抗氧化活性Fig.13　The antioxidant activity of components purified by DEAE Sephacel chromatography

2.3.3離子交換色譜多次收集組分G1進行旋轉蒸發濃縮,所得濃縮液用DEAE Sephacel離子色譜柱分離,結果見圖12。其中H1是未吸附組分,H2、H3和H4是吸附組分。收集各組分測定其抗氧化活性,見圖13。由結果可知,H2具有最高的清除活性,DPPH自由基清除能力為(10.54±0.03) μmol AAE/g,FRAP為(89.29±0.01) μmol AAE/g。因此選擇H2進行下一步的分離純化。

2.3.4RP-HPLC將經旋轉蒸發濃縮、透析脫鹽后的組分H2,用Inersil ODS-3柱反相高效液相色譜進行分離,結果如圖14所示。

圖14　H2的RP-HPLC色譜圖Fig.14　Elution profile of fraction H2 by RP-HPLC

分離后共得到F1和F2兩個峰,多次收集兩個峰進行旋轉蒸發濃縮,所得兩組分濃縮液肽濃度稀釋至同一水平,分別測定其抗氧化活性,結果如圖15所示。F1具有較高的抗氧化活性,其DPPH自由基清除能力為(14.91±0.09) μmol AAE/g,鐵離子還原能力為(112.53±0.54) μmol AAE/g。

圖15　HPLC洗脫組分的抗氧化活性Fig.15　Antioxidative activities of the fractions isolated by RP-HPLC

2.3.5質譜分析及活性鑒定由表2可知,通過α-胰凝乳蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶兩步酶解之后,組分F1中含有3個主要的肽,分別為十四肽YSLKMGGVSVVVIA,十三肽DISHNQRGAILVR,十肽GCKVALIVVG。確認抗氧化肽的氨基酸序列后,對多肽進行合成。分別測定三種不同多肽的抗氧化活性,結果如表2,由測定結果可知,十肽GCKVALIVVG具有最高的抗氧化性,其DPPH自由基清除能力為(16.10±0.02) μmol AAE/g,鐵離子還原能力為(245.37±0.03) μmol AAE/g。通過測定短肽的DPPH自由基清除能力和鐵離子還原能力,發現結果具有一致性,當一種活性指標高時,另外一個活性指標也高。其DPPH自由基清除能力與Faithong[18]等人從泰國傳統發酵磷蝦產品中和Jiang[19]等人酶解藍圓鲹肌肉獲得的抗氧化肽測定結果相近。鐵離子還原能力高于Ajibola等人[20]研究的非洲山藥豆水解組分,低于Bougatef等人[21]從美國星鯊肌肉獲得的組分。

表2　三種多肽抗氧化活性測定

3　結論

本實驗選用α-胰凝乳蛋白酶與嗜熱菌蛋白酶在優化條件下依次對蝦副產物進行酶解,經過透析、凝膠層析色譜、離子交換層析和RP-HPLC分離純化得到抗氧化活性高的組分,經質譜分析,其抗氧化能力較強組分為十肽GCKVALIVVG,該肽的DPPH自由基清除能力為(16.10±0.02) μmol AAE/g pro,鐵離子還原能力為(245.37±0.03) μmol AAE/g pro。

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Preparation of antioxidant peptides from Shrimp byproducts by enzymolysis

LIU Ya-nan1,WANG Yan-hui2,Yalikunjiang Ashan2,QIAN Bing-jun2, YAO Xiao-min2,ZHANG Jian-hua2,ZHONG Yao-guang1,*

(1. College of Food Science & Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China; 2. School of Agriculture & Biology,Shanghai JiaoTong University,Shanghai 200240,China)

To prepare antioxidant peptides by specific enzyme hydrolysis,using shrimp byproducts as raw material. Alpha-chymotrypsin and thermolysin were chosen to hydrolysis the shrimp byproducts. The fractions showing high antioxidative activity were isolated from the hydrolysates by dialysis and using consecutive chromatographic methods including Sephadex G-15 gel filtration,DEAE Sephacel ion exchange chromatography,and Inersil ODS-3 reverse phase high-performance liquid chromatography. The antioxidant activity was assayed based on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)radical scavenging ability and ferric-reducing antioxidant power(FRAP). The fraction(F1)obtained after a series of separation showed high antioxidant activity. Three peptides were found in fraction F1by time-of-flight mass spectrometry analysis. The decapeptide had the highest concentration and antioxidant activity. Its DPPH radical scavenging activity was(16.10±0.02) μmol AAE/g protein and FRAP was(245.37±0.03) μmol AAE/g protein. The peptide which showed high antioxidant activity were obtained from shrimp byproducts,the results provided theoretical basis for the production and application of the byproduct of shrimp.

Shrimp byproducts;enzymatic hydrolysis;separation and purification;antioxidant peptides

2016-04-08

劉亞楠(1990-),女,碩士研究生,研究方向:食品工程,E-mail:Liu_Yanan1990@163.com。

鐘耀廣(1965-),男,博士,教授,研究方向:食品安全,E-mail:ygzhong@shou.edu.cn。

國家海洋局公益性行業科研專項經費項目(201205031)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)17-0090-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.009