載牛血清白蛋白殼聚糖微球的制備及其體外釋藥特性評價

李思陽,朱吉人,孔慶新,王　洋

(1.江蘇食品藥品職業技術學院,江蘇淮安 223003;2.東北林業大學,黑龍江哈爾濱 150040)

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載牛血清白蛋白殼聚糖微球的制備及其體外釋藥特性評價

李思陽1,朱吉人1,孔慶新1,王洋2，*

(1.江蘇食品藥品職業技術學院,江蘇淮安 223003;2.東北林業大學,黑龍江哈爾濱 150040)

目的:優化載牛血清白蛋白殼聚糖微球的制備工藝,并考察其體外釋藥特性,從而提高蛋白藥物的穩定性,控制其釋放速度,延長藥物作用時間,提高藥物生物利用度。方法:以高分子天然材料殼聚糖為載體,以離子凝膠法制備載牛血清白蛋白殼聚糖微球,通過單因素實驗和正交實驗設計優化制備工藝,并考察其體外釋放特性。結果:掃描電子顯微鏡觀察載牛血清白蛋白殼聚糖微球具有明顯的球狀結構;其最佳制備工藝為:殼聚糖分子量為300 ku、三聚磷酸鈉濃度為10 mg/mL、殼聚糖濃度為3 mg/mL、牛血清白蛋白用量為30 mg,制備的微球載藥率可達30.13%,體外釋放可持續48 h,累積釋放率達到70%,具有良好的緩釋效果。結論:載牛血清白蛋白殼聚糖微球具有較高的載藥量,緩釋效果明顯,為殼聚糖作為藥物緩控釋載體的進一步研究提供依據。

殼聚糖,牛血清白蛋白,微球,制備,釋放

多肽及蛋白類物質在治療、診斷各種疾病方面發揮著重要作用,但由于大多數蛋白類藥物存在穩定性差,半衰期短,生物利用率較低等缺陷,因此限制了其臨床應用[1]。因此,這類藥物在修飾結構、改進劑型、新型藥物載體系統以及給藥方式改變等方向的研究成為關注的熱點[2]。

微球(Microspheres)是一種骨架型的微粒,是液體或固體類藥物分散和(或)溶解于高分子材料中,其粒徑大小通常在1～250 μm之間,呈類球形或球形微粒[3-5]。微球作為一種新型緩釋載體傳遞系統,具有靶向作用、降低機體免疫反應以及藥物在靶組織中可以維持較高的濃度等特點,不僅在多肽和蛋白質藥物給藥系統研究方向上突顯優越性[6],而且在食品領域也有廣泛的應用,如固定化酶[7]、食品微生物檢驗[8]等。

殼聚糖是甲殼素脫乙酰衍生物,是一種帶正電荷的直鏈多糖,具有生物黏附性和生物相容性好、毒性低、同時兼有較強的粘附作用[9-11]。因此,使用具有負載、靶向、緩釋、控釋等作用的殼聚糖作為藥物載體材料具有天然的優勢[12-14]。

本研究以殼聚糖為載體,以離子凝膠法制備載牛血清白蛋白殼聚糖微球,優化其制備工藝,探討其體外釋放特性,使其達到一種長期平穩緩釋的效果,為其他多肽及蛋白質類藥物殼聚糖微球的研究提供借鑒。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

殼聚糖(分子量3、50、300、1000 ku)濟南海得貝海洋生物工程有限公司;牛血清白蛋白(批號:1074)MP生物醫學;其他試劑均為市售分析純。

FEI QUANTA 200掃描電子顯微鏡美國FEI公司;DG5033A型酶聯免疫檢測儀南京華東電子集團醫療裝備有限責任公司;5810R型離心機德國eppendorf公司;Vortex-6型旋渦混合器江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1牛血清白蛋白標準曲線的繪制考馬斯亮藍G-250染液的配制:將3 mg考馬斯亮藍G-250溶于1.25 mL 95%乙醇,加入2.5 mL濃磷酸,待染料充分溶解后,用濾紙過濾,定容至25 mL,備用。

精密稱取20 mg牛血清白蛋白粉末置于1.5 mL離心管,以1 mL去離子水溶解,搖勻即得濃度為20 mg/mL的牛血清白蛋白標準溶液,將其稀釋至成0.2 mg/mL的牛血清白蛋白標準溶液。將0.2 mg/mL的牛血清白蛋白標準溶液分別稀釋至0、0.04、0.08、0.12、0.16 mg/mL系列對照品溶液。取3份上述濃度的牛血清白蛋白標準溶液50 μL分別置于96孔板同一排相鄰孔中,分別加入200 μL考馬斯亮藍G-250備用染液,充分振蕩,于10 min內用酶標儀測定595 nm處吸光度A[15-16]。以牛血清白蛋白濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.2載牛血清白蛋白殼聚糖微球的制備將醋酸溶液稀釋至1%,加一定量殼聚于1%的醋酸溶液中,充分攪拌至殼聚糖完全溶解,即配制成一定濃度的殼聚糖醋酸溶液。取配制的殼聚糖醋酸溶液20 mL置于50 mL離心管中,加入一定量牛血清白蛋白粉末,充分攪拌至牛血清白蛋白完全溶解。然后,室溫高速攪拌下緩慢滴加一定濃度的三聚磷酸鈉溶液4 mL,反應1 h,得到載牛血清白蛋白殼聚糖微球混懸液。將該混懸液10000 r/min離心3 min,取上清備用。再用去離子水洗滌沉淀三次,烘干稱重,即成功制備載牛血清白蛋白殼聚糖微球。

1.2.3載藥率的測定將“1.2.2中”得到的上清分別定容,以不加牛血清白蛋白制備空白殼聚糖微球獲得的上清做空白對照,用2.1的方法測595 nm處吸光度,計算上清牛血清白蛋白的質量,計算載藥率。

載藥率(%)=[(Wa-Ws)/W總]×100

Wa:投藥量;Ws:上清液中含藥量;W總:載藥微球總質量,即沉淀質量。

1.2.4掃描電子顯微鏡觀察稱取適量微泡沉淀樣品于離心管中,加入少量去離子水,渦旋,使沉淀分散均勻,取50 μL懸濁液置于鋁片上,涂抹均勻,噴金,在掃描電鏡圖像在12.5 kV、9.5 mm工作距離的陽離子加速電壓下掃描圖像。

1.2.5載牛血清白蛋白殼聚糖微球單因素實驗

1.2.5.1殼聚糖分子量對載牛血清白蛋白殼聚糖微球成球性的影響分別選取分子量為3、50、300 1000 ku的殼聚糖分別制備濃度為5 mg/mL的醋酸殼聚糖溶液20 mL,分別加入2 mg牛血清白蛋白,充分攪拌至牛血清白蛋白完全溶解。在室溫高速攪拌下,向上述溶液中分別緩慢滴加濃度為10 mg/mL的三聚磷酸鈉溶液4 mL,攪拌反應1 h。

1.2.5.2殼聚糖和三聚磷酸鈉濃度對載牛血清白蛋白殼聚糖微球成球性的影響制備濃度分別為1、2.5、5、7.5、10 mg/mL的醋酸殼聚糖溶液20 mL。向上述不同濃度醋酸殼聚糖溶液中分別加入2 mg牛血清白蛋白,充分攪拌至牛血清白蛋白完全溶解。在室溫高速攪拌下,分別向上述不同濃度牛血清白蛋白醋酸殼聚糖溶液中緩慢滴加濃度分別為2.5、5、10、15、20、30 mg/mL的三聚磷酸鈉溶液4 mL,攪拌反應1 h。

1.2.5.3牛血清白蛋白用量對載牛血清白蛋白殼聚糖微球載藥率的影響用分子量為50 ku的殼聚糖制備濃度為5 mg/mL的醋酸殼聚糖溶液,分別加入質量為2、5、10、15、20、30 mg牛血清白蛋白粉末,充分攪拌至牛血清白蛋白完全溶解。高速攪拌下緩慢滴加濃度為10 mg/mL三聚磷酸鈉溶液4 mL,繼續攪拌反應1 h。按“1.2.3項下內容”測載藥率(n=3)。

1.2.6正交實驗根據單因素實驗結果,以載牛血清白蛋白殼聚糖微球載藥率為考察指標,選取影響載牛血清白蛋白殼聚糖微球成球性及載藥率的殼聚糖分子量、殼聚糖濃度、三聚磷酸鈉濃度以及牛血清白蛋白用量4個因素,各取3個水平,進行L9(34)正交實驗設計(表1),以確定載牛血清白蛋白殼聚糖微球的最佳制備工藝,并進行驗證實驗。

表1　L9(34)正交實驗因素水平表

1.2.7體外釋藥特性評價

1.2.7.1牛血清白蛋白PBS標準曲線繪制精密稱取5 mg 牛血清白蛋白粉末,PBS緩沖液定容至25 mL,得到0.2 mg/mL母液。母液用PBS溶液分別稀釋至0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL系列對照品溶液。取3份上述濃度的牛血清白蛋白對照品溶液50 μL分別置于96孔板同一排相鄰孔中,分別加入200 μL考馬斯亮藍G-250備用染液,充分振蕩,于10 min內用酶標儀測定595 nm處吸光度A[15-16]。以牛血清白蛋白濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

表4　分子量300 ku殼聚糖及三聚磷酸鈉濃度對成球性的影響

1.2.7.2體外釋放精密稱取5 mg載牛血清白蛋白凍干粉末樣品于10 mL離心管中,加入5 mL去離子水,待渦旋混勻后,吸取1 mL溶液于透析袋內密封。透析袋置于25 mL PBS(pH7.4)釋放介質中,用于模擬人體內環境,37 ℃恒溫培養箱中磁力攪拌,在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10、12、18、24、36、48 h時間點分別取3 mL釋放液并補充相同體積的新鮮釋放液。用酶標儀測定595 nm處吸光度,通過“1.2.7.1”標準曲線計算出釋放液中牛血清白蛋白的含量,計算出累積釋放率。

2　結果與討論

2.1牛血清白蛋白標準曲線

以牛血清白蛋白濃度C為橫坐標,吸光度A為縱坐標繪制標準曲線,得到標準曲線方程:y=5.1724x+0.043,R2=0.9928,結果表明,牛血清白蛋白在0～0.16 mg/mL濃度范圍內線性關系良好。

2.2載牛血清白蛋白殼聚糖微球單因素實驗

2.2.1殼聚糖分子量對載牛血清白蛋白殼聚糖微球成球性的影響殼聚糖分子量對載牛血清白蛋白殼聚糖微球成球性的影響結果如表2,可以看出,相同濃度殼聚糖醋酸溶液,隨著殼聚糖分子量的升高,殼聚糖醋酸溶液越黏稠,產生的殼聚糖微球顆粒越大。由于分子量為1000 ku的殼聚糖溶液粘度過大,不適合制備小粒徑的殼聚糖微球,所以殼聚糖分子量取3、50、300 ku較適宜。

2.2.2殼聚糖和三聚磷酸鈉濃度對載牛血清白蛋白殼聚糖微球成球性的影響由于殼聚糖分子量越大,同一濃度殼聚糖醋酸溶液越黏稠,所以取分子量為3、300 ku的殼聚糖分別做殼聚糖濃度對載牛血清白蛋白殼聚糖微球成球性的影響實驗,結果見表3,表4。

表3　分子量3 ku殼聚糖及三聚磷酸鈉濃度對成球性的影響

由表3可以看出,殼聚糖濃度與三聚磷酸鈉濃度均較低時,無微球生成;殼聚糖濃度與三聚磷酸鈉濃度均較高時,產生大量微球。殼聚糖濃度為1 mg/mL時,無論三聚磷酸鈉濃度為多少,都無微球生成。三聚磷酸鈉濃度小于等于5 mg/mL時,無論分子量為3 ku的殼聚糖濃度為多少,都無微球生成。所以分子量為3 ku的殼聚糖濃度取2.5～10 mg/mL,三聚磷酸鈉濃度取10～30 mg/mL制備載牛血清白蛋白殼聚糖微球比較合適。

由表4可以看出,隨著殼聚糖濃度和三聚磷酸鈉濃度的升高,產生的微球越多,微球的顆粒越大。當分子量為300 ku的殼聚糖濃度為1 mg/mL時,無論三聚磷酸鈉濃度為多少,都無微球生成;當殼聚糖濃度為10 mg/mL時,醋酸殼聚糖溶液粘稠,形成的微球顆粒較大。當三聚磷酸鈉濃度為2.5 mg/mL時,無論分子量為300 ku的殼聚糖濃度為多少,都無微球生成;當三聚磷酸鈉濃度為30 mg/mL時,形成的微球顆粒較大。所以分子量為300 ku的殼聚糖濃度取2.5～7.5 mg/mL,三聚磷酸鈉濃度取5～20 mg/mL制備載牛血清白蛋白殼聚糖微球比較合適。

綜上,殼聚糖濃度范圍取2.5～7.5 mg/mL,三聚磷酸鈉濃度范圍取10～20 mg/mL。

2.2.3牛血清白蛋白用量對載牛血清白蛋白殼聚糖微球載藥率的影響當牛血清白蛋白的用量較低時,隨著牛血清白蛋白用量的增加,載藥量會逐漸提高,然而,由于殼聚糖的有效負載量有限,因此當牛血清白蛋白的用量達到一定量時,即使繼續增加其用量,載藥率也不會增加。其具體結果見圖1。

圖1　牛血清白蛋白用量對載牛血清白蛋白殼聚糖微球載藥率的影響Fig.1　The effect of bovine serum albumin concentration on the drug loading rate of bovine serum albumin chitosan microspheres

由表1可以看出,隨著牛血清白蛋白用量的加大,載牛血清白蛋白殼聚糖微球載藥率也增大,當其增加至40 mg后,載藥量變化不明顯。

2.3正交實驗結果

根據單因素實驗結果,選取影響載牛血清白蛋白殼聚糖微球成球性及載藥率的殼聚糖分子量、殼聚糖濃度、三聚磷酸鈉濃度以及牛血清白蛋白用量4個因素,各取3個水平(表5),進行L9(34)正交實驗設計,結果見表5。

表5　L9(34)正交實驗設計表及結果

由表5可知,這4個因素對載牛血清白蛋白殼聚糖微球載藥率的影響順序為A>C>D>B,即殼聚糖分子量>三聚磷酸鈉濃度>牛血清白蛋白用量>殼聚糖濃度。因此,最優組合為A3B1C1D3,即殼聚糖分子量為300 ku、殼聚糖濃度為3 mg/mL、三聚磷酸鈉濃度為10 mg/mL、牛血清白蛋白用量為30 mg。在此條件下,進行驗證實驗,得到的載藥率可達30.13%。

2.4掃描電子顯微鏡觀察圖像

掃描電鏡圖像見圖2,載牛血清白蛋白殼聚糖微球具有明顯的球狀結構,表面光滑,粒徑大小在2 μm左右。

圖2　載牛血清白蛋白殼聚糖微球掃描電鏡圖像Fig.2　The SEM images of bovine serum albumin chitosan microspheres

2.5體外釋藥特性評價

2.5.1牛血清白蛋白PBS標準曲線以牛血清白蛋白濃度C為橫坐標,吸光度A為縱坐標繪制標準曲線,得到標準曲線方程:y=5.775x+0.0105,R2=0.9999,結果表明,牛血清白蛋白在0.02～0.1 mg/mL濃度范圍內線性關系良好。

2.5.2體外釋放從圖3中可以看出,空白對照組游離的牛血清白蛋白釋放較快,約4 h累積釋放率超過了85%,12 h后基本釋放完全,累計釋放率達到99%,而載牛血清白蛋白殼聚糖微球12 h累計釋放率為60%左右,且持續緩慢釋放,48 h后,累積釋放率接近70%,且仍然繼續釋放。這一結果充分證實了載牛血清白蛋白殼聚糖微球明顯的緩釋效果和持續釋放特性。

圖3　載牛血清白蛋白殼聚糖微球體外釋放圖Fig. 3　In vitro release of bovine serum albumin chitosan microspheres

3　結論

隨著科學的不斷發展,許多蛋白質藥物進入臨床階段,但蛋白質藥物生物利用率較低,穩定性差,半衰期短,需要頻繁給藥,對患者生理和心理上造成很大負擔;通過將蛋白類藥物制成微球,使其發揮緩釋、控釋作用,已成為近年來開發蛋白類藥物緩控釋制劑的研究的方向[17-18]。本研究以高分子材料殼聚糖為載體,運用離子凝膠法成功制備載牛血清白蛋白殼聚糖微球。研究發現,殼聚糖分子量、三聚磷酸鈉濃度以及殼聚糖濃度對載牛血清白蛋白殼聚糖微球成球性有較大影響,牛血清白蛋白加入量對微球載藥率有影響。通過單因素實驗與正交實驗,研究制備載牛血清白蛋白殼聚糖微球的最佳方法,結果顯示,載藥率隨殼聚糖分子量的增加、殼聚糖濃度的降低、三聚磷酸鈉濃度的降低、牛血清白蛋白用量的增加而增加。

此外,通過體外釋放實驗表明,載牛血清白蛋白殼聚糖微球能夠在體外持續緩慢釋放,具有明顯的緩釋效果和持續釋放特性,該研究為以殼聚糖作為藥物緩控釋載體的進一步研究提供依據,為蛋白類藥物殼聚糖微球的研究提供借鑒。

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Preparation of bovine serum albumin chitosan microspheres and evaluation of its drug release characteristicsinvitro

LI Si-yang1,ZHU Ji-ren1,KONG Qing-xin1,WANG Yang2,*

(1.Jiangsu Food & Pharmaceutical Science College,Huaian 223003,China; 2.Northeast Forestry University,Harbin 150040,China)

objective:To optimize the preparation technology of bovine serum albumin chitosan microspheres and investigate the drug release characteristicsinvitro,in order to improve the stability of protein drugs,control the drug release rate,prolong the time of drug action and improve the bioavailability of drugs. Methods:Natural polymer chitosan were used as the material,the bovine serum albumin chitosan microspheres were prepared by ionic gelation method,the single factor test and orthogonal design were used to optimize the technology of preparation,and the characteristics of the study were also investigatedinvitrorelease. Results Laser scanning microscope was for encapsulation of the bovine serum albumin chitosan microspheres. The best preparation technology were chitosan molecular of 300 ku,the concentration of sodium tripolyphosphate of 10 mg/mL,the concentration of chitosan of 3 mg/mL,the amount of bovine serum albumin of 30 mg. Under this condition,the microsphere drug loading rate was 30.13%,and theinvitrorelease studies showed that 70% of BSA was released from the bovine serum albumin chitosan microspheres in the first 48 h which confirmed a good sustained-release effect and sustained release characteristics. Conclusion:The bovine serum albumin chitosan microspheres with high drug-loading content and obvious slow release effect can provide the basis for further research.

chitosan;bovine serum albumin;microspheres;preparation;release

2015-06-26

李思陽(1987-)，男, 碩士研究生，研究方向:新型載藥系統，E-mail：253595136@qq.com。

王洋(1971-)，女，博士，教授，主要從事藥劑學和植物次生代謝研究，E-mail：ywang@nefu.edu.cn。

江蘇省大學生實踐創新項目(201513104007Y)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)17-0157-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.022