干酪可食性涂膜保鮮劑配比的研究

劉　敏,趙　浩,范貴生

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

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干酪可食性涂膜保鮮劑配比的研究

劉敏,趙浩,范貴生*

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

為研究開發(fā)可食用干酪保鮮劑,以酪蛋白酸鈉為基材,添加天然抑菌材料構(gòu)成基液,在此基礎(chǔ)上分別對(duì)單一添加納他霉素和溶菌酶的基液進(jìn)行了抑菌效果的對(duì)比,供試菌為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假單胞菌、酵母菌和霉菌。同時(shí)對(duì)混合添加納他霉素和溶菌酶的基液的抑菌效果進(jìn)行了研究并對(duì)其配比進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明:單一添加納他霉素的抑菌保鮮液對(duì)霉菌和酵母菌的抑菌性隨其用量增加而增強(qiáng),而且不同用量之間均存在顯著差異(p<0.05),對(duì)金黃色葡萄球菌、假單胞菌的抑菌效果呈先增加后減小,而對(duì)大腸桿菌的抑菌作用在不同用量之間不存在顯著差異(p>0.05);單一添加溶菌酶的抑菌保鮮液對(duì)酵母菌的抑制作用較強(qiáng)(p<0.05),對(duì)其它菌種抑菌圈小于12 mm。運(yùn)用響應(yīng)面優(yōu)化法以吸光值增量為指標(biāo)對(duì)殼聚糖、那他霉素、溶菌酶混合添加的的配比進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明:那他霉素0.07 g/100 mL基液、溶菌酶1.0 g/100 mL基液,所得吸光值增量達(dá)到最小值為1.225,且殼聚糖與那他霉素和殼聚糖與溶菌酶之間存在顯著的交互作用(p<0.05),那他霉素和溶菌酶交互作用不顯著(p>0.05),并在此配比下的抑菌圈直徑分別是大腸桿菌13.67 mm,金黃色葡萄球菌14.33 mm,假單胞菌15.66 mm,酵母菌18.00 mm和霉菌17.76 mm。

可食性,復(fù)合保鮮劑,抑菌效果,響應(yīng)面

契達(dá)干酪的消費(fèi)市場(chǎng)很大,深受我國(guó)消費(fèi)者青睞,目前全球的干酪生產(chǎn)總量近2000萬噸[1]。契達(dá)干酪屬于硬質(zhì)干酪,其結(jié)構(gòu)緊密,質(zhì)地柔軟,水分含量較大,因此極不容易儲(chǔ)藏,在后成熟過程中容易被微生物污染,造成干酪腐敗變質(zhì)甚至影響消費(fèi)者的健康[2]。一些病原菌例如單增李斯特菌、沙門氏菌、大腸桿菌等還會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重疾病和死亡[3-4]。還有一些微生物如假單胞菌、酵母菌、霉菌還會(huì)對(duì)干酪的風(fēng)味,質(zhì)地,感官等性狀造成影響而降低其經(jīng)濟(jì)價(jià)值[5]。隨著干酪消費(fèi)市場(chǎng)的逐漸擴(kuò)大,提高防腐措施迫在眉睫,目前利用單一或復(fù)合保鮮液涂覆或浸漬處理干酪是國(guó)外研究較多的方法,在我國(guó)干酪保鮮劑抑菌包裝市場(chǎng)的研究比較鮮見。

本文就針對(duì)干酪易被微生物污染問題研制一種可食性抑菌保鮮液,實(shí)驗(yàn)是以酪蛋白酸鈉、殼聚糖為基材,甘油為增塑劑,納他霉素和溶菌酶為抑菌劑,在單因素的基礎(chǔ)上測(cè)定納他霉素、溶菌酶分別對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假單胞菌、酵母菌和霉菌的抑菌性,并通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化對(duì)干酪保鮮效果較好的2種保鮮劑的配比,分析殼聚糖、納他霉素、溶菌酶之間的協(xié)同作用和拮抗作用,為干酪保鮮提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

契達(dá)干酪實(shí)驗(yàn)室自制,真空包裝成熟兩個(gè)月以上。

酪蛋白酸鈉東京化成工業(yè)株式會(huì)社;殼聚糖食品級(jí),脫乙酰度≥90%,干燥質(zhì)量損失率≤8.0%;甘油河南濱海實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司;冰乙酸北京金輝通業(yè)化工公司;納他霉素內(nèi)蒙古澤生試劑有限公司;溶菌酶內(nèi)蒙古園藝興試劑有限公司;大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假單胞菌、酵母菌和霉菌內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品系保存。

TWCL-D調(diào)溫磁力攪拌器鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;13 cm×13 cm方皿;鼓風(fēng)干燥箱上海樂傲實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;超凈臺(tái)北京王堂藍(lán)翼科技有限公司;高壓滅菌鍋上海俊晟生物科技有限公司;恒溫恒濕箱天津市泰斯特儀器有限公司;酶標(biāo)儀美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌懸液的制備將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假單胞菌分別接種于滅菌后的PCA培養(yǎng)基上,37 ℃下培養(yǎng)24 h,活化三次,將第三代菌種采用平板計(jì)數(shù)法,用滅菌后的生理鹽水稀釋成1×108CFU/mL的菌懸液備用。酵母菌、青霉菌分別接種于滅菌后的PDA培養(yǎng)基上,28 ℃下培養(yǎng)3 d,活化三次,將第三代菌種采用平板計(jì)數(shù)法,用滅菌后的生理鹽水稀釋成1×106CFU/mL的菌懸液備用。

1.2.2抑菌保鮮液的制備稱取5 g酪蛋白酸鈉用100 mL蒸餾水磁力攪拌至溶解,2 g殼聚糖用100 mL體積分?jǐn)?shù)為1%的冰乙酸水溶液磁力攪拌至溶解,兩者的溶液各取50 mL混合并用調(diào)溫磁力攪拌器攪拌,攪拌過程中加入2%甘油,再加入0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 g的納他霉素制成濃度為0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.09%納他霉素保鮮液。同理制備含有0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%溶菌酶的保鮮液。

1.2.3不同保鮮劑對(duì)不同菌種的抑制效果取100 μL大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假單胞菌菌懸液接種于已滅菌并冷卻的PCA培養(yǎng)基上并用涂布棒涂均勻備用,酵母菌、霉菌菌懸液接種于PDA培養(yǎng)基上涂布均勻備用,將牛津杯(已滅菌)放入含有不同菌的培養(yǎng)基中,加入200 μL不同濃度的不同保鮮液,以只含有2%殼聚糖保鮮液做對(duì)照,每個(gè)濃度做三個(gè)平行。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假單胞菌置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h,酵母菌、霉菌置于真菌培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)3 d。用測(cè)微尺測(cè)量抑菌圈直徑,比較不同濃度的不同保鮮劑的抑菌效果,由于牛津杯直徑為7 mm左右,所以抑菌圈直徑d<8 mm(文中“-”也表示無抑菌性)為無抑菌性,8 mm12 mm為有較強(qiáng)抑菌性。

1.2.4干酪樣品的處理取至少成熟2個(gè)月以上的契達(dá)干酪,用無菌刀片將干酪切成5 g大小,并置于不同保鮮劑里浸漬1 min,取出吹干,再浸漬1 min,再吹干,反復(fù)3次,確保保鮮液完全復(fù)合在干酪上,待其完全干后置于盤中并用保鮮膜封住,置于8 ℃冰箱里放置7 d,同時(shí)以第 0 d做空白對(duì)照。

1.2.5干酪中菌落總數(shù)增量的測(cè)定為了更好的了解保鮮劑在干酪中的實(shí)際抑菌性能,所以在以測(cè)量抑菌圈直徑為指標(biāo)的單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面設(shè)計(jì),將保鮮液應(yīng)用于實(shí)際干酪中,以測(cè)量干酪中的菌落總數(shù)為指標(biāo)研究其抑菌性能,測(cè)量干酪中菌落總數(shù)的具體方法是:將第0 d的干酪取出置于燒杯中,加入95 mL水,采用高速攪拌機(jī)攪碎混勻,用移液槍吸取200 μL于96孔板里,平行做四個(gè),用酶標(biāo)儀在610 nm下測(cè)其吸光值,同理放置7 d的干酪樣品測(cè)法同上,第7 d的吸光值與第0 d的吸光值的差值,為干酪菌落總數(shù)的增量(增量越小,保鮮劑抑菌效果越好)即吸光值增量,A610 nm增量=A610 nm 7 d-A610 nm 0 d。

1.2.6最佳保鮮劑配比的確定根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用響應(yīng)面設(shè)計(jì),運(yùn)用Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[6-7]做3因素3水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1　響應(yīng)面分析因素水平表

注:殼聚糖在本文沒有做單因素抑菌實(shí)驗(yàn),因?yàn)樵诟衫铱墒承园b膜的制備及性能研究[8]中,將殼聚糖當(dāng)做成膜劑已優(yōu)化了其成膜配比,又因?yàn)闅ぞ厶蔷哂幸志?所以文中沒有將殼聚糖固定成一種濃度主要是想利用3因素3水平進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),并通過響應(yīng)面分析法了解殼聚糖和其他兩種抑菌劑之間的交互作用。

1.2.7數(shù)據(jù)分析采用Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及差異顯著性檢驗(yàn),所有數(shù)值均為3次重復(fù)的平均值。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

表2　那他霉素對(duì)不同菌種的抑菌效果

注:每一行中具有不相同字母的數(shù)值之間差異顯著(p<0.05),表2同。

表3　溶菌酶對(duì)不同菌種的抑菌效果

2.1.1那他霉素的添加量對(duì)不同菌種的抑菌效果由表2可知,那他霉素對(duì)霉菌的抑菌效果最優(yōu),且抑菌性隨著納他霉素濃度增加而增大,差異達(dá)到顯著水平(p<0.05);酵母菌的抑菌性隨著那他霉素用量的增加而逐漸增大,從0.03%開始增大明顯,并且不同用量之間存在顯著差異(p<0.05);雖然那他霉素是一種廣譜真菌抑制劑[9],但是它對(duì)大腸桿菌也起到了一定的抑制作用,當(dāng)納他霉素濃度達(dá)到0.07%時(shí)大腸桿菌的抑菌圈直徑出現(xiàn)最大值為14.00 mm;當(dāng)納他霉素濃度達(dá)到0.05%時(shí),金黃色葡萄球菌和假單胞菌的抑菌圈達(dá)到最大分別為16.00 mm和20.33 mm;綜合考慮,那他霉素用量確定為0.03%～0.07%范圍。

2.1.2溶菌酶的添加量對(duì)不同菌種的抑菌效果由表3可以看出,與對(duì)照組相比,溶菌酶的加入對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和假單胞菌的抑菌效果不明顯,當(dāng)溶菌酶濃度在0%～1.0%之間時(shí),溶菌酶對(duì)大腸桿菌發(fā)揮了一定的抑菌作用,當(dāng)溶菌酶濃度大于1.0%時(shí)對(duì)大腸桿菌已經(jīng)沒有抑制性;溶菌酶是一種對(duì)革蘭氏陽性菌有強(qiáng)烈抑制性的抑菌劑,但是本文將殼聚糖與溶菌酶復(fù)合使用卻沒有充分發(fā)揮溶菌酶對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制性,甚至在溶菌酶濃度大于等于1.5%時(shí)沒有任何抑菌性,究其原因很有可能是溶菌酶與殼聚糖交互使用出現(xiàn)了拮抗作用;酵母菌的抑菌圈隨著溶菌酶的濃度增加呈先增加后減小的趨勢(shì),并且在0%～2%之間存在顯著差異(p<0.05);溶菌酶對(duì)霉菌的抑菌性在不同用量之間沒有顯著性差異(p>0.05);綜合考慮,溶菌酶用量確定為0.5%～1.5%范圍。

2.1.3保鮮劑配比的響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與優(yōu)化根據(jù)表4方案進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),在17個(gè)實(shí)驗(yàn)中其中有12組是析因?qū)嶒?yàn),5組是中心實(shí)驗(yàn),用來估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4,回歸方程方差分析見表5。經(jīng)回歸擬合后,實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響可用回歸方程表示為:

Y=1.35-0.19X1-0.11X2-0.031X3-0059X1X2+0.078X1X3+0.038X2X3+0.056X12+0.11X22+0.09X32

表4　響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表5可以看出,建立的模型p<0.0001,說明模型極顯著,失擬項(xiàng)p=0.08>0.05,表明差異不顯著,說明殘差均由隨機(jī)誤差引起的,模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9743,說明響應(yīng)值的變化有97.43%來源于所選變量,因此該模型擬合程度良好,實(shí)驗(yàn)誤差小,可以用此模型來分析預(yù)測(cè)干酪天然復(fù)合保鮮劑的配比[10]。

表5　回歸方程的方差分析

2.1.4因素間的交互作用根據(jù)回歸方程利用Design-Expert 軟件做不同因素的響應(yīng)面分析圖1～圖3。等高線的形狀可以反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小,圓形表示交互作用不顯著,橢圓形表示兩者交互作用顯著[11]。

從圖1看出殼聚糖和那他霉素的交互作用顯著,在實(shí)驗(yàn)水平范圍內(nèi),干酪吸光值增量隨著殼聚糖含量和那他霉素含量的增加而呈現(xiàn)出逐漸減小的趨勢(shì),在高水平區(qū)兩者的交互作用使吸光值增量達(dá)到了最低點(diǎn),且沿殼聚糖用量方向等高線密度變化相對(duì)較高,說明殼聚糖用量對(duì)吸光值增量的影響大于那他霉素用量。

圖1　殼聚糖、那他霉素用量與吸光值增量的響應(yīng)面Fig.1　Response surface for absorbance value increment as a function of the amount of chitosan and natamycin

圖2顯示了那他霉素取中心水平時(shí),殼聚糖和溶菌酶對(duì)吸光值增量的交互作用。從等高線圖可以看出殼聚糖與溶菌酶的交互作用顯著,在實(shí)驗(yàn)水平范圍內(nèi),吸光值增量隨著殼聚糖用量呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢(shì),當(dāng)在殼聚糖用量高水平區(qū)時(shí),隨著溶菌酶用量的增加吸光值增量逐漸增加。沿殼聚糖用量方向等高線密度變化相對(duì)較高,說明殼聚糖用量對(duì)吸光值增量的影響大于溶菌酶用量。

圖2　殼聚糖、溶菌酶用量與吸光值增量的響應(yīng)面Fig.2　Response surface for absorbance value increment as a function of the amount of chitosan and lysozyme

圖3顯示了殼聚糖取中心水平時(shí),那他霉素和溶菌酶對(duì)吸光值增量的交互作用。從等高線圖接近圓形可知,那他霉素與溶菌酶的交互作用不顯著,那他霉素用量影響顯著,在實(shí)驗(yàn)水平范圍內(nèi),沿那他霉素用量方向等高線密度變化相對(duì)較高,說明那他霉素用量對(duì)干酪吸光值增量的影響大于溶菌酶用量。

圖3　那他霉素、溶菌酶用量與吸光值增量的響應(yīng)面Fig.3　Response surface for absorbance value increment as a function of the amount of natamycin and lysozyme

綜上,3因素對(duì)干酪吸光值增量影響的大小順序依次是殼聚糖用量>那他霉素用量>溶菌酶用量,這也與通過表5中F值判斷的結(jié)果相一致。

2.1.5復(fù)合保鮮劑最佳配比的確定通過響應(yīng)曲面法所得的回歸方程,得出了最優(yōu)復(fù)合保鮮劑的配比:殼聚糖用量2.0 g/100 mL、那他霉素用量0.07 g/100 mL、溶菌酶用量1.0 g/100 mL,此時(shí)干酪的吸光值增量達(dá)到最小值。為了檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性,用此最佳條件進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到干酪吸光值增量為1.225,與理論預(yù)測(cè)值1.221非常接近,表明基于響應(yīng)曲面法所得的優(yōu)化復(fù)合保鮮劑配比準(zhǔn)確可靠,具有實(shí)用價(jià)值,但又考慮到用吸光值增量評(píng)價(jià)抑菌效果不具有普遍性,因此在該配比下又以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假單胞菌、酵母菌和霉菌為供試菌種做了抑菌圈實(shí)驗(yàn),得到抑菌圈直徑分別為大腸桿菌13.67 mm,金黃色葡萄球菌14.33 mm,假單胞菌15.66 mm,酵母菌18.00 mm和霉菌17.76 mm。

3　結(jié)論

本文在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過測(cè)量抑菌圈直徑研究了天然保鮮劑那他霉素、溶菌酶對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假單胞菌、酵母菌和霉菌的抑菌作用,結(jié)果表明:綜合納他霉素分別對(duì)5種菌種的抑制效果,初步確定納他霉素的濃度范圍為0.03%～0.07%,溶菌酶的濃度范圍初步確定為0.5%～1.5%,然后利用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design-Expert,采用響應(yīng)曲面法建立了復(fù)合保鮮劑配比的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型,對(duì)各因子與響應(yīng)值的影響進(jìn)行了分析,結(jié)果表明:模型擬合程度高,實(shí)驗(yàn)誤差小。得到復(fù)合保鮮劑最佳配比為:殼聚糖用量2.0 g/100 mL、那他霉素用量0.07 g/100 mL、溶菌酶用量1.0 g/100 mL,此條件下干酪吸光值增量為1.225,對(duì)供試菌種的抑菌圈直徑分別為大腸桿菌13.67 mm,金黃色葡萄球菌14.33 mm,假單胞菌15.66 mm,酵母菌18.00 mm和霉菌17.76 mm。利用該方法可以更好的為天然復(fù)合保鮮劑的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Study on presciption of coating edible preservative for cheese

LIU Min,ZHAO Hao,FAN Gui-sheng*

(Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,Chnia)

To study and develop an edible preservation film,the antibacterial property of the base liquid mixture adding the inhibiting components of natamycin and lysozyme were tested. The base liquid was composed of caseinate sodium,and chitosan and glycerol. The test bacteria wereE.coli,Staphylococcusaureus,Pseudomonasfluorescens,yeast and mold. The result showed that the antibacterial effect of natamycin on mold and yeast was enhanced with the increase of its dosage,and there were significant differences between different dosage(p<0.05).Inihibiting effect of natamycin onStaphylococcusaureus,Pseudomonasfluorescenswas first increased and then decreased and the effect onE.colishowed no significant difference among different amount(p>0.05).The inhibitory effect of lysozyme had a significant effect on yeast(p<0.05),but the inhibition zone of other bacteria were less than 12 mm. Response surface analysis was employed to optimize parameters of the prescription of the base liquid with blend of natamycin and lysozyme.The evaluating index was the increment of absorbance. The results revealed that the optimum additive amount of natamycin and lysozyme was 0.07 g/100 mL base liquid and 1 g/100 mL base liquid. At this dose,the absorbance increment of the base liquid reached a minimum value.The result also showed that there were significant interaction effects between chitosan and natamycin,as well as between chitosan and lysozyme(p<0.05),wheras the interaction effects between natamycin and lysozyme was not significant(p>0.05),and the diameter of the inhibition zone ofE.coli,Staphylococcusaureus,Pseudomonas,yeast and mold were 13.67,14.33,15.66,18.00,17.76 mm in this ratio respectively.

edibility;complex preservative;antibactria effect;response surface

2016-03-01

劉敏(1975-)，女，碩士，副教授，研究方向:農(nóng)畜產(chǎn)品加工與貯藏，E-mail:Minliu0000@163.com。

范貴生(1957-)，男，博士，教授，研究方向:食品包裝與儲(chǔ)運(yùn),E-mail:spfgsh@imau.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31260382)；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金(2015MS0316)。

TS202

A

1002-0306(2016)17-0257-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.042