229份水稻品種及重要育種材料抗稻瘟病Pik位點基因型鑒定

陳子強，田大剛，梁廷敏,2，陳在杰，胡昌泉，王　鋒，陳松彪*

(1．福建省農業科學院生物技術研究所/福建省農業遺傳工程重點實驗室，福建　福州　350003；2. 福建農林大學生命科學學院，福建　福州　350002)

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229份水稻品種及重要育種材料抗稻瘟病Pik位點基因型鑒定

陳子強1，田大剛1，梁廷敏1,2，陳在杰1，胡昌泉1，王鋒1，陳松彪1*

(1．福建省農業科學院生物技術研究所/福建省農業遺傳工程重點實驗室，福建福州350003；2. 福建農林大學生命科學學院，福建福州350002)

Pik位點包含Pi-k、Pi-km、Pi-kp、Pi1、Pi-kh等抗稻瘟病等位基因，在我國水稻抗病育種中具有重要應用價值。本研究對229份水稻品種及重要育種材料的Pik位點進行基因型鑒定。利用K/N-單元型分子標記對水稻材料Pik位點進行多態性分析，鑒定了80份材料為K1K2功能性基因型。進一步通過Pi-k、Pi-kp和Pi1功能分子標記檢測，結合功能多態位點序列分析，從80份K1K2型材料中，鑒定了黑稻、京虎B為Pi-k基因型；軟米谷為Pi-kp基因型；恩恢99-64為Pi1基因型。研究還發現，高配合力強優恢復系閩恢3301的Pik位點為功能性K1K2基因型，其K1K2片段的序列與已克隆Pi-k、Pi-km、Pi-kp、Pi1、Pi-kh等位基因的序列存在差異，表明閩恢3301的Pik位點可能存在一個新等位基因。本研究明確了229份水稻材料Pik位點的K/N-基因型，結果可為水稻抗稻瘟病育種和品種合理布局提供參考。

水稻；稻瘟病；Pik位點；閩恢3301；基因分型

稻瘟病是水稻生產上最嚴重病害之一，每年可造成水稻減產10%～30%[1]。長期生產實踐表明，培育和推廣抗病水稻品種是防治稻瘟病最經濟有效、對環境安全的措施。因此，解析水稻品種及育種材料的抗病遺傳基礎，對開展水稻抗稻瘟病育種和合理布局抗病品種具有重要意義。

迄今為止，已有近百個稻瘟病抗性基因被人們鑒定，其中有23個基因已經被克隆[2]。隨著越來越多的稻瘟病抗性基因被克隆，基于抗病基因功能序列開發的分子標記，促使人們能夠快速、準確地鑒定各種水稻種質資源抗病基因的分布，進而指導水稻抗病分子育種[3-8]。

Pik位點位于水稻第11染色體長臂近端粒處，是水稻一個主效抗稻瘟病位點。該位點具有Pi-k、Pi-km、Pi-kp、Pi-kh、Pi1及Pi-ks等多個抗稻瘟病等位基因。這些基因對我國不同稻區的稻瘟菌生理小種均具有較廣譜及較持久、高效抗性，因此，在我國水稻抗病育種中具有重要的應用價值[9-14]。Pi-km[9]、Pi-kp[11]、Pi-k[12]、Pi1[13]和Pi-kh[14]等基因已被克隆。研究表明，Pik位點等位基因介導的抗性由2個緊密連鎖、具有獨立功能的NBS-LRR基因協同作用[9-14]。對比抗病品種Kusabue(Pi-k)、Tsuyuake(Pi-km)、K60(Pi-kp)、C101LAC(Pi1)等Pik位點2個功能性NBS-LRR基因序列與感病品種日本晴非功能DNA序列發現，該位點可分為K-單元型(K1K2功能型)和N-單元型(N1N2非功能型)[12]。進一步研究發現，Pi-km、Pi-k、Pi-kp和Pi1基因型取決K1、K2區間的6個SNP，其中K1基因組C1-685A /G能區分Pi-km與其他等位基因，T1-2944G能區分Pi-k與其他等位基因，K1基因組T1-786A/G和K2基因組A2-1879G是Pi-kp特異的SNP位點，K1基因組T1-687G和K2基因組T2-2261A是Pi1特異的SNP位點[12-13]。基于這些多態開發的分子標記能夠檢測Pik位點的N/K-基因型并區分不同等位基因型。

本研究對229份中國水稻品種及重要育種材料的抗稻瘟病Pik位點進行K/N-單元型多態性分析及等位基因分型，明確了這些水稻材料Pik位點的K/N-基因型。研究結果將為水稻抗稻瘟病育種和品種合理布局提供參考。

1　材料與方法

1.1水稻材料

水稻Pik位點單基因系材料IRBLKM-TS(Pi-km)、IRBLk-Ka(Pi-k)、IRBLkp-K60(Pi-kp)、IRBL1-F5(Pi1)、IRBLks-S(Pi-ks)及IRBLkh-K3(Pi-kh)和Pib位點單基因系材料IRBLb-B(Pi-b)由國際水稻研究所Zhou Bo博士惠贈。229份水稻品種及重要育種材料以及參考基因組水稻品種日本晴由福建省農業科學院遺傳工程重點實驗室保存。

1.2水稻基因組DNA 的提取

取3～4葉期水稻植株的新鮮葉片組織100 mg，裝入 2 mL離心管，用液氮研磨成粉末。采用CTAB法提取基因組DNA[15]。

1.3PCR擴增、酶切檢測及SNP位點測序

PCR體系總體積為25 μL，其中2.5 μL的10×buffer，2.0 μL的2.5 mmol dNTP, 1.0 μL上游引物和1.0 μL下游引物, 1.0 μL的基因組DNA，0.5 μL的Taq聚合酶，ddH2O補至25 μL。PCR 反應程序為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 kb·min-1，35個循環；72℃延伸5 min。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物。

Pi-k、Pikp-k2、Pi1-k1基因型檢測采用dCAPS標記策略，分別以dCAPS-2953[12]、dCAPS-1879[12]和Pi1-5C[13]等3個標記的引物進行擴增。PCR產物在37℃條件下，分別用限制性內切酶KpnI、NdeI、ClaI進行酶切處理4 h。酶切產物用3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

Pikp-k1和Pi1-k2基因型通過測序進行檢測。PCR產物經試劑盒(TIANGEN公司，北京)回收純化，由英駿生物技術公司(上海)進行測序。

2　結果與分析

2.1229份水稻材料抗稻瘟病Pi-k位點K/N-單元型多態分析

利用4對特異性引物Ku1-GT[12]、Ku2-GT[12]、NP5-GT[12]、NP6-GT[12](表1)對日本晴及攜帶Pi-b、Pi-k、Pi-km、Pi-kp、Pi-kh、Pi1和Pi-ks等位基因的單基因系進行單元型檢測。利用N-型標記NP5-GT和NP6-GT可以從日本晴和IRBLb-B單基因系基因組分別檢測637 bp和676 bp的片段，而6個單基因系則無擴增產物；相反，利用K-型標記Ku1-GT和Ku2-GT可以從6個單基因系基因組分別檢測到1 600 bp和4 879 bp的片段，而日本晴和IRBLb-B單基因系則無擴增產物(圖1，表2)，驗證了Pik位點存在K-單元型(K1K2功能型)和N-單元型(N1N2非功能型)的現象[12]。

進一步利用上述4對引物對229份水稻品種及重要育種材料(表2)進行檢測，結果表明，117、02428、IR046、R187粳、安農晚粳B和黑竹粳等80份材料為K1K2基因型；D297B、R527、ZR21、白芒粳、光殼香糯和黑粳糯2號等53份材料為N1N2基因型；其余96份材料則為無規則基因型(圖1，表2)。

表1　供試引物

表2　229份水稻品種及重要育種材料Pik位點N/K-基因型檢測

(續上表)

2.2Pik位點等位基因型鑒定

Zhai等[12]和Hua等[13]設計了針對Pi-km、Pi-k、Pi-kp、Pi1等位基因的dCAPS標記。本研究參考這些標記進行水稻材料檢測，發現dCAPS-2953標記(對應Pi-k基因型)、dCAPS-1879標記(對應Pikp-k2基因型和Pikh-k2基因型)和Pi1-5C標記(對應Pi1-k1基因型)擴增、酶切效果穩定。以dCAPS-2953標記對80份K1K2型水稻材料進行檢測，結果發現黑稻、京虎B等2份材料的基因型與IRBLk-Ka(Pi-k)一致；以dCAPS-1879標記進行分析，檢測到軟米谷在Pikp-k2位點上與IRBLkp-K60(Pi-kp)、IRBLkh-K3(Pi-kh)基因型一致；以Pi1-5C標記進行分析，檢測到洞庭晚秈、彬晚3號、恩恢99-64等3份材料在Pi1-k1位點上與IRBL1-F5(Pi1)基因型一致(圖2)。

為進一步分析軟米谷在Pikp-k1位點上，洞庭晚秈、彬晚3號、恩恢99-64在Pi1-k2位點上的基因型，分別對軟米谷和洞庭晚秈、彬晚3號、恩恢99-64的相應位點進行PCR擴增和序列測序。結果發現，軟米谷在Pikp-k1位點上的基因型與IRBLkp-K60(Pi-kp)一致；恩恢99-64在Pi1-k2位點上的基因型與IRBL1-F5(Pi1)一致，洞庭晚秈、彬晚3號的Pi1-k2位點基因型則與IRBL1-F5(Pi1)存在變異(圖3)。

2.3閩恢3301基因型分析

閩恢3301是福建省農業科學院生物技術研究所近年來選育的高配合力強優恢復系[16]，以其為父本配制并審定了十多個超高產組合，并大面積應用于生產中。K/N-單元型多態檢測的結果表明，閩恢3301的Pik位點為K1K2基因型(圖1，表2)。進一步以dCAPS-2953、dCAPS-1879、Pi1-5C等三個標記對閩恢3301的Pik位點進行檢測，發現其基因型不同于Pi-k、Pi-kp、Pi1。為明確閩恢3301的基因型，對閩恢3301Pik位點的K1和K2片段進行測序并與5個已克隆等位基因Pi-k、Pi-km、Pi-kp、Pi1和Pi-kh的序列進行比對，結果發現，閩恢3301的K1與Pikp-k1功能位點相同，但其K2不同于Pikp-k2或Pi1-k2功能位點。綜合K1和K2位點，閩恢3301序列與5個等位基因的序列存在多態(圖3)，說明閩恢3301的Pik位點可能存在新的等位基因。

3　討　論

目前已鑒定的水稻抗稻瘟病基因分布在除第3染色體外的其余11條染色體上，許多基因以基因簇形式分布在不同的染色體區域。其中，第6染色體的Pi2/9位點、第11染色體的Pik位點以及第12染色體的Pi-ta位點，均存在著數目眾多的抗病等位基因[2]。Pik位點的多個等位基因均具有對中國不同稻區稻瘟菌生理小種較廣譜和持久的抗性，如Wang等[10]鑒定發現，Pi-km、Pi-k、Pi-kp等基因對廣東、湖南、四川、江蘇等稻瘟菌株的抗性頻率達到90%以上。另一方面，不同抗病基因對不同地區稻瘟菌株的抗性表現差異明顯，如上述3個基因對東北稻區稻瘟菌株的抗性頻率低于50%[10]。因此，了解水稻材料抗病位點基因型，根據不同稻區稻瘟病發病情況選擇、選育攜帶不同抗病基因的抗病品種，對不同稻區稻瘟病防控具有重要指導意義。

基于K/N-單元型分子標記檢測，本研究從229份水稻材料中，鑒定了80份材料為K1K2基因型，即這些材料可能在Pik位點含有抗稻瘟病功能基因。進一步以對應Pik功能位點的分子標記dCAPS-2953、對應Pikp-k2功能位點的分子標記dCAPS-1879以及對應Pi1-k1功能位點的分子標記Pi1-5C，結合Pik功能位點、Pikp-k1功能位點以及Pi1-k2功能位點序列分析，鑒定了黑稻、京虎B為Pi-k基因型，軟米谷為Pi-kp基因型，恩恢99-64為Pi1基因型。Pik位點上已被克隆的抗病基因包括Pi-km、Pi-kp、Pi-k、Pi1和Pi-kh等基因。鑒于標記擴增穩定性問題，本研究未針對Pi-km和Pi-kh基因型進行分析，未來仍有待鑒定哪些K1K2型材料為Pi-km或Pi-kh基因型。

K/N-單元型分子標記分析結果表明，閩恢3301為K1K2基因型。進一步對閩恢3301 K1K2片段的序列分析結果表明，閩恢3301基因型不同于已克隆的Pi-k、Pi-km、Pi-kp、Pi1和Pi-kh等抗性基因(圖3)，說明閩恢3301的Pik位點可能存在一個新的等位基因，但其是否具有抗稻瘟病功能，需要進一步的遺傳、抗病性實驗予以證明。

總體上，本研究鑒定了229份中國水稻品種及重要育種材料抗稻瘟病Pik位點的K/N-基因型，研究結果對開展水稻抗稻瘟病分子育種以及合理利用抗病品種具有指導意義。

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(責任編輯：柯文輝)

Characterization of the Genotypes at the Rice Blast ResistancePikLocus in 229 Rice Cultivars and Important Breeding Materials

CHEN Zi-qiang1, TIAN Da-gang1, LIANG Ting-min1,2, CHEN Zai-jie1, HU Chang-quan1,WANG Feng1, CHEN Song-biao1*

(1.BiotechnologyResearchInstitute,FujianKeyLaboratoryofGeneticEngineeringforAgriculture,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350003,China; 2.CollegeofLifeScience,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002,China)

The ricePiklocus that contains multiple blast resistance genes, such asPi-k,Pi-km,Pi-kp,Pi1 andPi-kh, has great utilization value in rice breeding for blast resistance in China. In the present study, we investigated the genotypes at thePiklocus in 229 rice cultivars and important breeding materials. Based on PCR amplification using K- and N-type specific primer sets, 80 accessions were identified harboring the K1K2 haplotypes. The 80 K1K2 accessions were further accessed for the presence ofPi-k,Pi-kpandPi1 using allele-specific markers in combination with sequencing identification of allele-specific SNPs. Heidao and Jinghu B were identified harboring thePi-kresistance allele, and Ruanmigu and Enhui 99-64 were identified harboringPi-kpandPi1, respectively. In addition, an eliteindicarestorer line Minhui 3301 was identified harboring the K1K2 haplotypes. Allele-specific marker analysis and sequencing data revealed that the sequence of Minhui 3301 atPiklocus differs from the sequences ofPi-k,Pi-km,Pi-kp,Pi1 andPi-kh, suggesting that Minhui 3301 might possess a new allelic gene at thePiklocus. In summary, we validated the distribution of the K1K2 haplotypes at thePikloucs in 229 rice accessions. Our results provide a wealthy of information for developing and deploying resistant cultivars to control rice blast disease.

rice; rice blast;Piklocus; Minhui 3301; genotyping

CHEN Z-Q，TIAN D-G，LIANG T-M，et al.Characterization of the Genotypes at the Rice Blast ResistancePikLocus in 229 Rice Cultivars and Important Breeding Materials[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(6)：553-559.

2016-03-12初稿；2016-05-14修改稿

陳子強(1988-)，男，碩士，研究實習員，主要從事植物分子生物學與分子免疫研究

陳松彪(1973-)，男，博士，研究員，主要從事植物分子免疫及植物功能基因研究(E-mail: songbiao_chen@hotmail.com)

福建省自然科學基金杰出青年基金滾動項目(2014J07004)；國家自然科學基金委員會-福建省人民政府促進海峽兩岸科技合作聯合基金重點支持項目(U1405212)；福建省科技計劃項目——省屬公益類科研院所基本科研專項(2014R1019-10)

Q 78

A

1008-0384(2016)06-553-07

陳子強，田大剛，梁廷敏，等.229份水稻品種及重要育種材料抗稻瘟病Pik位點基因型鑒定[J].福建農業學報，2016，31(6)：.553-559