福建省番茄黃化曲葉病毒的分子鑒定分析

張前榮，溫慶放，李大忠，劉建汀，李永平,代春蘭，薛珠政，康建坂，王　彬，朱海生 *

(1.福建省農業科學院作物研究所，福建　福州　350013；2.福建省農業科學院蔬菜研究中心，福建　福州　350013； 3.福建省蔬菜工程技術研究中心，福建　福州　350013)

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福建省番茄黃化曲葉病毒的分子鑒定分析

張前榮1,2,3，溫慶放1,2,3，李大忠1,2,3，劉建汀1,2,3，李永平1,2,3,代春蘭1，薛珠政1,2,3，康建坂1,2,3，王彬1,2,3，朱海生1,2,3*

(1.福建省農業科學院作物研究所，福建福州350013；2.福建省農業科學院蔬菜研究中心，福建福州350013； 3.福建省蔬菜工程技術研究中心，福建福州350013)

為了對福建省發生的番茄黃化曲葉病毒病的病原進行分子鑒定，并對其病原分子的變異和進化情況進行分析。根據已知的番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)基因組序列設計特異引物進行PCR擴增，對獲得的特異性片段回收、克隆并測序，結果表明，PCR分子標記反應擴增到541 bp的特異性條帶，將該特異性產物經回收和純化并進行克隆與測序，測序結果經BLAST比對后，表明該分離物的序列與國內外的病毒序列相似度為97%～99%。試驗結果表明福建省的5個地市的番茄均已被番茄黃化曲葉病毒病危害，應當加強防治。

番茄；番茄黃化曲葉病毒；鑒定

番茄黃化曲葉病毒病(tomato yellow leaf curl virus disease, TYLCD)，系由雙生病毒科菜豆金色花葉病毒屬的番茄黃化曲葉病毒引起的，依靠煙粉虱持續傳播，因此該病毒又稱為粉虱傳雙生病毒[1-3]。該病毒的核酸主要由DNA-A和DNA-B組成，其大小約為2.5～3.0 kb，少數病毒為單組份[4]，不僅侵害番茄，還能夠寄宿在辣椒、馬鈴薯、棉花、木薯等農作物[5]。

20世紀30年代末，番茄黃化曲葉病毒病首次在約旦-以色列一帶被發現。1964年，才被正式命名為番茄黃化曲葉病毒病(TYLCD)[6]。該病毒病是一種毀滅性的病害，已在約旦、以色列、日本、美國、澳大利亞等國家地區均有大面積的發生，已造成嚴重損失[7-10]。1995年該病傳入我國[11]，該病已在我國的浙江、上海、山東、河南、重慶、廣西、廣東、云南等多個省市自治區發生[12-16]。

福建省龍巖市、莆田市、福州市等地市均有大面積的番茄栽培，因此開展番茄黃化曲葉病毒發生情況調查分析研究，并提出防治方法具有重要的意義。分子標記技術能夠快速準確鑒定出該病毒，在植物樣品檢疫鑒定起到重要的作用。本研究利用分子標記技術鑒定分析福建省的采集的番茄病株樣品，并對特異性分離物進行純化、克隆、測序、比對、分析該分離物與世界各地分離物的同源性，確定病毒類型，并提出防治該病毒的方法。

1　材料和方法

1.1病毒樣品采集

2015年在福建省的福州、莆田、廈門、漳州、龍巖地市等5個地區采集番茄黃化曲葉病毒病病樣。

1.2病毒DNA提取及PCR檢測

病毒DNA的提取方法采用經典CTAB法[17]。引物設計參考謝艷等[5]的簡并引物：CTYPA:TAATATTACC(G或T)G(A或T)(G或T)G(A，C或G)CC(C或G)C；JCTYPB:TGGAC(C或T)TT(A或G)CA(A或T)GG(C,T或G)CCTTCACA。

25 μL反應體系：番茄葉片總DNA 2 μL(100 ng)；Mix 12.5 μL；ddH2O 9.5 μL；PA 0.5 μL，PB 0.5 μL。

PCR反應條件：94℃變性5 min ；94℃變性30 s， 55℃復性45 s， 72℃延伸30 s，35 個循環；72℃延伸10 min，4℃保存。

1.3克隆和測序分析

利用回收試劑盒對PCR擴增產物中約540 bp的特異性條帶進行回收、純化、克隆到載體pMD18-T(TaKaRa公司)，取陽性菌落，經培養后進行測序。測序結果登錄NCBI 網站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)的BLAST進行比對分析。

2　結果與分析

2.1番茄黃化曲葉病毒的田間調查癥狀

從福建省內各地采集的番茄植株病樣，其田間表現為植株生長緩慢甚至停滯，節間變短，嚴重矮化，上部新葉新芽增厚且變小、葉質變硬和脆、葉片退綠變黃，葉片邊緣至葉脈區域發黃、具有凹凸不平的皺褶或變形，后期褶皺簇狀葉片緣向上卷曲；新葉有黃綠不均，葉片嚴重變形且焦枯，番茄果實畸形、變小，或不能正常開花結果，坐果困難，果實僵化不膨大，或膨大速度極慢著色不均勻，不能正常轉色，成熟慢，結果數減少，商品價值減低，產量大幅下降。其田間表現性狀與國內外報道的番茄黃化曲葉病毒病性狀相似度很高。

2.2番茄黃化曲葉病毒的特異性片段分析

以感病葉片的病毒DNA為模板進行PCR擴增反應，其產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測。以健康的番茄植株葉片為對照，病樣通過擴增獲得大小約為540 bp左右的特異性條帶(圖1)，而健康植株未出現特異性條帶。對特異性條帶進行回收、純化、克隆到載體pMD18-T及測序。通過測序得到541 bp的片段序列，其序列見圖2。同時對測序結果進行BLAST比對，確認其為番茄黃化曲葉病毒的AV1的相關基因。

2.3福建地區分離物與國內外分離物分析

從福建省內采集的病毒病樣的分離物的部分序列與已在GenBank登錄的國內山東、浙江、上海、北京、新疆、遼寧等省市的分離物序列相似性最高，均為99%，與美國夏威夷、墨西哥、以色列韓國濟州島、日本沖繩等國家地區的相似度為99%。與江蘇、山西、河北、河南、約旦的病毒相似度為98%，而與墨西哥危害馬鈴薯的番茄黃化曲葉病的相似度為97%(表1)。

3　討論與結論

TYLCVD是一種世界滅頂性災害，是亞熱帶和熱帶番茄的重要病害之一，分布極為廣泛，嚴重威脅了番茄產業的發展[18]。TYLCV的傳播介體為煙粉虱，寄主廣泛，近年來全球氣候變暖，煙粉虱的適應力不斷增強使其大量繁殖傳播，加快了TYLCV的傳播，使得TYLCVD對番茄的為害越來越嚴重[19]。分子標記是一種快速準確檢測鑒定番茄黃化曲葉病毒病的方法，本研究對福建省的5個地市的番茄病毒進行PCR檢測，均擴增檢測到番茄黃化曲葉病毒，再次驗證了分子標記技術能夠運用于病毒診斷鑒定。

番茄黃化曲葉病毒病的 DNA-A 全長約為2.8 k個核苷酸，共編碼 6 個開放閱讀框架(ORF)，分別是AV1(CP)(308～1 084 nt)編碼外殼蛋白，AV2(148～498 nt)以及位于互補鏈的AC1(Rep)(1 542～2 615 nt)編碼病毒復制所必需的復制相關蛋白，AC2(Ren)(1 226～1 633 nt)編碼復制增強蛋白，AC3 (TrAP)(1 081～1 485 nt)編碼控制晚期基因表達的轉錄激活蛋白和 AC1 內還編碼一個AC4 蛋白(2 171～2 464 nt)[20-22]。從福建省番茄黃化曲葉病毒分離的分離物的大小為541 bp，經比對確定該分離是編碼病毒外殼蛋白的AV1基因的序列，為克隆分析福建省番茄黃化曲葉病毒DNA-A全長奠定了基礎。

根據國際病毒分類委員會的規定，雙生病毒科的基因組核苷酸序列相似度不小于89%為同一種病毒的不同株系或分離物[23]。番茄黃化曲葉病毒是一種單鏈環狀DNA病毒，存在基因重組變異現象，雖然各地報道病毒名相同，其序列可能相差較大，而與同屬病毒的相似度很低[20,24]。據全國各地研究人員報道我國的番茄黃化曲葉病毒分離物的核苷酸序列相似度較高，與世界其他國家地區的相似相對較低，而與同屬菜豆金色花葉病毒屬的其他病毒相似度低89%。據田守波[22]報道山東莘縣的番茄黃化曲葉病毒分離物(TYLCV-IL)與上海、河北等地區的同源性為98.2%～98.8%，與歐洲地區的同源性達到91.0%，而與其他菜豆金色花葉病毒屬病毒同源性為 66.1%～70.1%。劉玉樂等[25]在分離到廣西番茄黃化曲葉病毒(TYLCV-CHI)，與TYLCV-ISR(以色列分離物)、TYLCV-THA(泰國分離物)、TYLCV-SAR(撒丁分離物)、TYLCV-SI(意大利西西里分離物)的共同區 DNA 序列相比對，其同源性僅為 53.2%～57.7%，而AV1 基因編碼的氨基酸序列同源性僅為 72.7%～77.9%。本研究從福建省的5個地市采集的番茄植株樣品，都檢測到番茄黃化曲葉病毒，該分離物的部分序列與從墨西哥錫那羅亞危害馬鈴薯的番茄黃化曲葉病毒TYLCV-REP(C1)(登錄號EU224315.1)的相似度最低，僅為97%，與國內其他省份的番茄曲葉病毒分離的相似度為98%～99%。福建省的番茄黃化曲葉病毒病與已報道的分離物相似度較高。由此可知番茄黃化曲葉病毒已在福建省的5個地市番茄生產區發生危害。

該病是一種檢疫性病害，因此在生產要注意防止該病害的發生。①選擇抗番茄黃化曲葉病毒品種。培育和選擇抗黃化曲葉病毒且適合福建地區栽培的番茄品種是最有效科學的防治方法。已報道的抗番茄黃化曲葉病毒基因有5個，Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-4及Ty-5[26-29]。育種學家們通過傳統育種方法結合分子輔助育種方法選育出了一系列的番茄抗病品種。目前在福建省推廣的適合福建地區栽培且抗TY病毒的品種有倍盈(先正達)、鐵球3號(萬農高科)、中廈A318 (中廈種籽)等。②培育健壯無病蟲幼苗。于力等[30]研究結果表明番茄黃化曲葉病毒會通過嫁接的方式傳播。福建省的番茄苗多為嫁接苗，因此在嫁接應當選擇健康無病的接穗和砧木，注意嫁接刀的消毒。③加強田間管理。要注意整枝打杈等農事操作不可使用剪刀等工具，應當徒手進行，以避免人為傳染病毒。如發現個別病株或疑似病株, 務必及時拔除深埋或焚燒，及時清除殘枝落葉以減少蟲源和毒源。該病毒主要是依靠煙粉虱持續傳毒的，由此防治煙粉虱的傳播是防治該病毒病的重中之重。化學防治：藥劑可選用啶蟲脒、撲虱靈或阿維菌素+噻嗪酮等。物理方法：黃板等。

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(責任編輯：林海清)

Identification of Yellow Leaf Curl Virus on Tomato Plants in Fujian

ZHANG Qian-rong1,2,3, WEN Qing-fang1,2,3,LI Da-zhong1,2,3，LIU Jian-ting1,2,3，LI Yong-ping1,2,3,DAI Chun-lan1,2,3,XUE Zhu-zheng1,2,3,KANG Jian-ban1,2,3,WANG Bin1,2,3,ZHU Hai-sheng1,2,3*

(1.CropsResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350013,China;2.VegetableResearchCenter,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350013，China;3.FujianEngineeringResearchCenterforVegetables,Fuzhou,Fujian350013,China)

Molecular identification,variation, and phylogeneticity of the yellow leaf curl virus (TYLCV) on tomato plants in Fujian were investigated. For the study, specific primers were designed according to the known genome sequence of TYLCV for PCR detection. Then, the generated specific segments were collected, cloned and sequenced. A 541 bp fragment was obtained and its nucleotide sequence showed a high homogeneity, i.e., 97%-99%, with that of the tomato yellow curl leaf virus isolated from the domestic as well as international origins. It confirmed the presence of TYLCV infection on tomato plants in 5 cities in the province, and disease prevention and control measure should soon be implemented.

tomato;yellow leaf curl virus; identification

張前榮，溫慶放，李大忠，等.福建省番茄黃化曲葉病毒的分子鑒定分析[J].福建農業學報，2016，31(6)：611-615.

ZHANG Q-R，WEN Q-F，LI D-Z，et al.Identification of Yellow Leaf Curl Virus on Tomato Plants in Fujian[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(6)：611-615.

2016-01-07初稿；2016-04-28修改稿

張前榮(1987-)，男，碩士，研究實習員，主要從事蔬菜栽培與育種研究(E-mail：zhqrong@163.com)

朱海生(1978-)，博士，副研究員，主要從事園藝植物生理生化與分子生物學研究(E-mail:zhs0246@163.com)

福建省科技計劃項目——省屬公益類科研院所基本科研專項(2014R1026-8)；國家大宗蔬菜產業體系項目(CARS-25-G-20);福建省科技重大專項(2013NZ0002-3)

S 436

A

1008-0384(2016)06-611-05