生防菌TB2對甘蔗葉片抗病相關酶活的誘導作用

梁艷瓊，唐　文，吳偉懷，3，習金根，鄭肖蘭，李　銳，鄭金龍，賀春萍*，易克賢*

(1.中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所/農業部熱帶農林有害生物入侵檢測與控制重點開放實驗室/海南省熱帶農業有害生物檢測監控重點實驗室，海南　海口　571101；2.海南大學環境與植物保護學院，海南　海口　570228；3.農業部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室/省部共建國家重點實驗室培育基地/海南省熱帶作物栽培生理學重點實驗室/農業部儋州熱帶作物科學觀測實驗站，海南　儋州　571737)

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生防菌TB2對甘蔗葉片抗病相關酶活的誘導作用

梁艷瓊1，唐文2，吳偉懷1，3，習金根1，鄭肖蘭1，李銳1，鄭金龍1，賀春萍1*，易克賢1*

(1.中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所/農業部熱帶農林有害生物入侵檢測與控制重點開放實驗室/海南省熱帶農業有害生物檢測監控重點實驗室，海南海口571101；2.海南大學環境與植物保護學院，海南海口570228；3.農業部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室/省部共建國家重點實驗室培育基地/海南省熱帶作物栽培生理學重點實驗室/農業部儋州熱帶作物科學觀測實驗站，海南儋州571737)

以多酚氧化酶 (PPO)、過氧化物酶 (POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和過氧化氫酶(CAT)等5種防御酶作為植物抗病性反應指標，研究生防菌TB2和甘蔗赤腐病病菌對甘蔗植株抗病相關酶的影響。結果表明，先接病原菌后噴施生防菌TB2、先噴施生防菌后接病原菌、病原菌處理、生防菌處理等處理后，與植物防御抗病相關的PPO、POD、SOD、PAL、CAT防御酶活性均比對照組高，表明TB2和赤腐病菌均能誘導甘蔗葉片中的防御酶活性增強; 先噴施生防菌后接病原菌的防御酶活性比同期先接病原菌后噴施生防菌的高，說明TB2誘導能力強于赤腐病菌。兩者共同處理的甘蔗葉片中 5種防御酶活性高于單獨處理。可見 TB2和赤腐病菌共同誘導具有協同增效作用。

甘蔗，生防菌，防御酶系，誘導抗性

甘蔗SaccharumofficinarumL.是禾本科甘蔗屬Saccharum植物，盛產于熱帶及亞熱帶，是世界和我國最為重要的糖料作物[1]。甘蔗赤腐病(鐮型炭疽菌ColletotrichumfalcatumWent)是世界甘蔗生產過程中重要的病害之一。該病害不僅使產量減產，而且其病原菌還能促使蔗糖轉化，從而降低蔗汁純度和減少蔗糖糖分[2]。目前，國內外防治該病主要依賴抗病育種和化學防治，然而抗病品種培育不僅耗費時間長，而且易受病原菌小種變異而喪失抗病性[3-6]；化學藥劑長期使用或使用不當，易導致病原菌抗藥性，環境污染及農藥殘留等問題。近年來，生物防治由于其安全、低毒等特點已成為國內外的熱點。誘導抗病性、溶菌作用、重寄生作用、競爭作用、抗生作用、交互保護作用等是生防菌防治植物病害的主要作用機制。植物對病害及其他逆境的抗性與多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)等多種酶的活性變化有關[7-9]。近年來，很多學者對噴施生防菌后植物某些酶類及其代謝產物的變化與植物抗病性關系進行了廣泛的研究。周登博[7]等利用6種餅肥基質拮抗菌發酵液通過灌根的方式施用于盆栽香蕉苗，以PAL、POD、SOD、PPO作為抗病性反應指標，檢測不同基質的拮抗菌發酵液對香蕉枯萎病防病效果及抗病相關酶活性的影響。周林等[10]選擇苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD)等作為植物抗病性反應指標，采用灌根接種法，測定枯草芽孢桿菌TR21菌株發酵液不同組分對香蕉根系內3種酶活的影響。田昕[11]等定期采集田間對縮果病抗性不同棗樹品種果實樣本，測定POD、SOD、CAT、PAL等4種酶活性，分析其在棗果實發育過程中的變化規律與品種抗病性之間的關系。

有報道稱Bacillus類細菌能夠誘導寄主產生抗性，抵抗植物病害的侵染[12]。TB2是實驗前期分離到的一株廣譜抗真菌解淀粉芽孢桿菌，試驗證明具有良好的定殖能力，盆栽條件下對甘蔗赤腐病具有一定的防控效果(另文發表)。目前，國內有關生防菌對甘蔗赤腐病防效的研究較少，關于生防菌對甘蔗植株抗病防御反應酶影響的研究尚未見報道，為此本研究選擇PAL、POD、SOD、PPO、CAT作為抗病性反應指標，研究了生防菌TB2和甘蔗赤腐病對甘蔗植株抗病相關酶的影響，以明確 TB2對抗病防御酶的誘導機制，為甘蔗生產中合理利用TB2防治赤腐病和深入研究TB2的生防機制奠定理論基礎。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌株解淀粉芽孢桿菌菌株(TB2)和甘蔗赤腐病菌菌株(SL121)均由中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所分離、鑒定和保存。供試甘蔗種苗為桂蔗，選用大小基本一致的健康苗進行試驗。

1.1.2培養基LB培養基：蛋白胨 10.0 g，酵母膏 5.0 g，NaCl 8.0 g，瓊脂 20 g，補充ddH2O至1 000 mL，pH 7.0(LB液體培養基則不加瓊脂)。

PDA培養基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖15～20 g，瓊脂 15～20 g，補充ddH2O至1 000 mL。

1.2試驗方法

1.2.1菌株的制備及接種將 TB2 菌株在 LB 平板中劃線活化， 37℃恒溫培養 24 h，得到活化的 TB2菌株單菌落，然后挑取單菌落接種于LB培養基中，37℃、200 r·min-1條件下振蕩培養16 h即得 TB2種子液。按7%的接種量將解淀粉芽孢桿菌TB2 種子液接入 LB 培養基中，34℃，200 r·min-1，搖床培養48 h獲得解淀粉芽孢桿菌TB2發酵液。活菌計數后用無菌水稀釋至108cfu·mL-1的菌懸液備用。

將斜面保存的SL121菌株接入PDA平板上，置于28℃培養箱培養5 d，用5 mm打孔器打取菌餅，備用。

1.2.2TB2和SL121對甘蔗葉片抗性相關酶的誘導選擇長勢一致的植株，保持適宜溫度和濕度，加強栽培管理。試驗設5個處理，每個處理20株，重復3次。①先接病原菌后噴施生防菌(S+T)：將赤腐病菌SL121菌餅接入甘蔗葉片葉脈24 h后再噴施TB2；②先噴施生防菌后接病原菌(T+S)：將甘蔗葉片均勻噴施TB2 24 h后于葉脈處再接赤腐病菌SL121菌餅；③病原菌處理(S)：在甘蔗葉片葉脈上接入赤腐病菌SL121菌餅；④生防菌處理(T)：將生防菌TB2菌液均勻噴施甘蔗葉片；⑤空白對照(CK)：只噴施清水。分別于處理后24、48、72、96、120 h取甘蔗幼葉提取粗酶液。檢測不同時間甘蔗體內相關防御酶的活性變化。

1.2.3葉片誘導抗性測定 取0.2 g甘蔗葉片用于提取粗酶，PAL、POD、SOD、PPO、CAT等酶活均按照酶活試劑盒(蘇州科銘生物技術有限公司)步驟測定。

2　結果與分析

2.1對苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影響

PAL活性測定結果表明(圖1)，S+T、T+S、S和T等4個處理組的甘蔗葉片PAL活性均比對照處理高，空白對照甘蔗葉片的PAL活性活力最低，在24 ～120 h沒有明顯變化。T+S處理組甘蔗葉片中PAL活性明顯高于其他4組處理，并在接種后的第48 h達到峰值，峰值達到81.49 U·g-1，隨后下降并趨于平緩。S+T處理組的植株葉片PAL活力出現快速的增高，在第48 h達到高峰，隨后活性逐漸降低。T處理組的PAL活性在96 h時達到峰值58.30 U·g-1。S處理組甘蔗葉片的PAL活性也有顯著變化，在24～72 h時酶活性不斷上升，在72 h時酶的活性為49.72 U·g-1，達到峰值。因此，TB2發酵液和赤腐病菌均能誘導甘蔗葉片中PAL的活性增強，且TB2發酵液誘導能力強于赤腐病菌，TB2發酵液和赤腐病菌共同處理的活性高于單獨處理，可見 TB2和赤腐病菌共同誘導對PAL具有協同增效作用。

2.2對過氧化氫酶(CAT)活性的影響

測定生防菌及病原菌共同處理后甘蔗葉片中抗性防御酶CAT酶活性，結果如圖2所示，T+S處理組中的CAT活性在24～120 h均顯著高于其他4組處理，且在72 h時達到高峰，峰值為3 532.83 U·g-1。TB2發酵液單獨處理甘蔗葉片CAT活性迅速增高，并在第72 h達到2 011.693 U·g-1峰值；S+T處理組CAT酶活在第96 h達到最高，峰值為2 767.96 U·g-1；S處理組中甘蔗葉片的CAT活性變化規律與S+T處理組CAT活性變化相似，在第96h達到高峰。4組處理組的CAT活性均高于空白對照，且兩者同時處理比單獨處理的CAT活性高。沒有進行任何處理的空白對照CAT活性在120 h內變化不大。

2.3對過氧化物酶(POD)活性的影響

解淀粉芽孢桿菌TB2和甘蔗赤腐病菌SL121誘導甘蔗葉片過氧化物酶(POD)活性變化結果見圖3，由圖可知，各處理組呈先升高、后降低的變化規律，POD活性在24～48 h時急劇上升。T+S處理組的POD活性在第48h達到920.36 U·g-1峰值，S+T處理組、S處理組以及T處理組甘蔗葉片POD活性在第72h分別達到837.32、621.77、642.38 U·g-1峰值。與對照組相比POD活性顯著增高，峰值高達對照組的2倍以上。對照組POD活性變化范圍較小。比較5個處理組POD活性變化，結果發現，T+S處理組的酶活性顯著高于其他3個處理組，誘導效果最佳。

2.4對超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

SOD活性測定結果表明(圖4)，T+S、S+T、S等3個處理組SOD活性變化明顯，均表現為下降趨勢，且在誘導后24h到達峰值，其中T+S處理組和S+T 2個處理組酶活分別為對照組的2.03倍和2.29倍，達到586.59、659.70 U·g-1，差異極顯著。S處理組的酶活在峰值時為對照組的1.64倍，兩者間差異顯著。 T處理組的酶活在第96 h時達到388.10 U·g-1峰值，是對照組的1.35倍，差異顯著。S處理組與T處理組在第96 h時兩者差異不顯著，但兩者與其他處理組SOD酶活差異達到極顯著。對照組的酶活變化不大，與其他4組處理SOD酶活差異極顯著。

2.5對多酚氧化酶(PPO)活性的影響

測定解淀粉芽孢桿菌TB2和甘蔗赤腐病菌SL121對甘蔗葉片PPO活性的影響結果見圖5，由圖5可知，4組處理組PPO活性均呈現先增高后降低的趨勢。對照組的PPO活力基本沒有變化。接種病原菌后，PPO活力有明顯提高，在第96 h達到高峰，峰值為91.33 U·g-1，S+T處理組的甘蔗葉片PPO活性先增加，在第96 h時達到峰值116.13 U·g-1，隨后下降。噴施TB2的處理組PPO活性在第48 h達到峰值93.07 U·g-1，隨后呈下降趨勢，T+S處理組PPO活性出現峰值的時間與T處理組的時間一致，均是第48 h達到高峰。甘蔗葉片同時接種SL121和TB2的PPO活性比單獨接種的PPO活性高，這些結果表明赤腐病菌侵染后, 施用TB2發酵液能誘導植物 PPO 酶活力進一步提高, 進而增強植物的抗病能力。

3　討論與結論

劉朝輝等[13]利用哈茨木霉T23處理不同抗黃萎病類型的茄子苗，不同品種葉片內與抗病性物質合成相關的PAL、PPO、POD 和SOD 活性提高，說明茄子植株經過哈茨木霉T23誘導后，可以產生植保素、木質素等相關物質抵御黃萎病。劉淑宇等[16]通過測定綠色木霉發酵液對杧果果實炭疽病菌胞內抗性活性酶的影響證實，綠色木莓發酵液可抑制病原菌生長，并且會提高作物抗氧化酶的活性。張雨竹等[17]研究發現，桃色頂孢霉發酵液明顯抑制鐮刀菌的生長，大豆種子經濃度 10%至 80%桃色頂孢霉發酵液處理后，種子CAT 、POD、SOD 酶活性均明顯增加。王淑霞等[20]等研究發現，哈茨木霉Tr-92處理黃瓜根部，黃瓜葉片的過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶活性顯著提高。本研究設計先接種SL121后噴施TB2、先噴施TB2后接SL121、僅接種SL121、僅噴施TB2等4個處理，測定其對甘蔗葉片的PAL、PPO、SOD、POD、CAT等活性的影響，結果發現，甘蔗葉片PAL、PPO、SOD、POD、CAT活性均顯著提高，這與其他文獻報道生防菌能夠誘導植物抗病相關酶活的結果一致[14-20]。不僅驗證了這些酶與植物抗病性密切相關，而且說明了盆栽接種TB2菌株對提高甘蔗多種防御酶活性，增強其抗病性具有良好的效果。

赤腐病菌從苗期到成熟期均可侵染甘蔗植株。目前防治該病主要以化學防治為主，但長期大量使用化學藥劑使得抗藥性不斷增強，尤為嚴重的是，大量使用化學農藥，農藥殘留易造成食品安全問題，同時會加劇環境污染。生物農藥以其對人畜及生態環境無害的特點越來越受到人們的關注，而天然生防微生物以其獨特的作用機理一躍成為生物農藥發展熱點。TB2是從植物葉片分離，安全可靠且不會對植物和環境造成污染的拮抗菌，本試驗發現其能誘導甘蔗植株對赤腐病產生抗病性，因此，TB2是一株很有開發前途的生防菌。

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(責任編輯：黃愛萍)

Induction of Disease-resisting Enzymesin Sugarcane by Biocontrol Bacterium, TB2

LIANG Yan-qiong1,TANG Wen2,WU Wei-huai1,3,XI Jin-gen1,ZHENG Xiao-lan1, LI Rui1,ZHENG Jin-long1,HE Chun-ping1*,YI Ke-xian1*

(1.EnvironmentandPlantProtectionInstitute,CATAS/MinistryofAgricultureKeyLaboratoryforMonitoringandControlofTropicalAgriculturalandForestInvasiveAlienPests/HainanKeyLaboratoryforDetectionandControlofTropicalAgriculturalPests,Haikou,Hainan571101,China;2.CollegeofEnvironmentandPlantProtection,HainanUniversity,Haikou,Hainan5702283,China;3.OpeningProjectFundofKeyLaboratoryofRubberBiologyandGeneticResourceUtilization,MinistryofAgriculture/StateKeyLaboratoryBreedingBaseofCultivation&PhysiologyforTropicalCrops/DanzhouInvestigation&ExperimentStationofTropicalCrops,MinistryofAgriculture,Danzhou,Hainan571737,China)

Activities of polyphenol oxidase (PPO), peroxidase (POD), superoxide dismutase (SOD), phenylalanine ammonia lyase (PAL), and catalase (CAT) in sugarcane leaves were determined to evaluate the efficiency of a biocontrol bacterium, TB2, in inducing these disease-resisting enzymes, as well as the correlation between the enzymes and the disease resistance of sugarcane toward red rot pathogens. Treatments, including pathogen inoculation,TB2 spraying, and TB2 sprayings before and after pathogen inoculation, were applied to examine the variations on the enzymatic activities in the leaves of the treated sugarcane plants.It was found that the enzymatic activities in the treated plants were significantly higher than those in control, indicating an induction effect byeither TB2 or the red rot pathogens. The effect was greater when TB2 was applied along with the pathogenic inoculation, especiallyif the leaves were pre-sprayed with TB2.Although the biocontrol bacterium showed a stronger induction ability than the pathogens, a synergism seemed evidentwhen both were present on sugarcane.

sugarcane; biocontrol bacteria; defensive enzymes; induced resistance

梁艷瓊，唐文，吳偉懷，等.生防菌TB2對甘蔗葉片抗病相關酶活的誘導作用[J].福建農業學報，2016，31(6)：620-625.

LIANG Y-Q，TANG W，WU W-H，et al.Induction of Disease-resisting Enzymesin Sugarcane by Biocontrol Bacterium, TB2[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(6)：620-625.

2016-03-07初稿；2016-04-25修改稿

梁艷瓊(1985-), 女，助理研究員，研究方向：植物病理(E-mail: yanqiongliang@126.com)

賀春萍(1974-)，女，碩士，研究員，研究方向:植物病理(E-mail: hechunppp@163.com)；

易克賢(1964-)，男，博士，研究員，研究方向：分子抗性育種(E-mail: yikexian@126.com)

中央級公益性科研院所基本科研業務費專項(2015hzs1J014、2012hzs1J012、2014hzs1J012)； 中國熱帶農業科學院橡膠研究所省部重點實驗室、科學觀測實驗站開放課題(RRI-KLOF201506)

S 476.1

A

1008-0384(2016)06-620-06