熒光原位雜交技術在尿路上皮癌輔助診斷中的應用價值

趙言廷，郭曉慧，白　晶，朱德淳，王金國

(吉林大學第一醫院，吉林 長春130021)

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熒光原位雜交技術在尿路上皮癌輔助診斷中的應用價值

趙言廷，郭曉慧，白晶，朱德淳*，王金國*

(吉林大學第一醫院，吉林 長春130021)

尿路上皮癌是起源于尿路上皮的一種惡性腫瘤，包括腎盂尿路上皮癌、輸尿管尿路上皮癌及膀胱尿路上皮癌，其中以膀胱尿路上皮癌的發病率最高，輸尿管鏡下或膀胱鏡下取病理活檢是目前確診尿路上皮癌的金標準。然而，輸尿管鏡或膀胱鏡為有創性檢查，患者耐受性差，且易出現血尿、排尿疼痛等并發癥。因此，尋找一種無創、有效的檢查方法，對于可疑尿路上皮癌患者無論是早期篩查、輔助診斷、復發監測，還是減少有創性檢查的次數，都具有重要意義。目前尿脫落細胞學為尿路上皮癌的常規無創檢查方法，其特異度較高，但敏感度不盡如人意。隨著人們對尿路上皮癌遺傳學的不斷深入研究，目前已經證實尿液中的脫落細胞3號、7號、17號及9號染色體p21位點異常與尿路上皮癌的發生密切相關[1]。現已有較多的文獻報道，應用FISH技術檢測尿路上皮癌的特異性與尿脫落細胞學相當，而敏感性明顯高于尿脫落細胞學[2-5]。本項研究擬用FISH技術檢測可疑尿路上皮癌患者尿液中脫落細胞3號、7號、17號及9號染色體p21位點的畸變情況，并與尿脫落細胞學進行比較，探討FISH技術檢測尿路上皮癌的臨床應用價值。

1　資料和方法

1.1標本采集

收集自2014年10月到2016年1月就診于吉林大學第一醫院疑似尿路上皮癌患者的尿液，共111例，其中有6例無病理證據(拒絕鏡檢及手術)，故未納入本項研究，其余105例患者中，男78例，女27例，中位年齡65歲(30-85歲)，均行FISH及尿脫落細胞學檢查。留取患者的尿液標本取得了患者或其家屬的知情同意，并簽署了知情同意書，同時經過了本醫院倫理委員會的批準。

1.2主要試劑與儀器

探針及前處理試劑均購置于美國Abbott公司生產的UroVysion膀胱癌檢測試劑盒(內含膀胱癌檢測探針、DAPI、PBS、NP-40、20×SSC、胃蛋白酶干粉及其緩沖液等)、 封片膠、微型離心機、渦旋混勻器、水浴鍋(溫度準確)、離心機(可容納50 ml離心管，15 ml離心管)、 ThermoBrite雜交儀、 OLYMPUS-BX51熒光顯微鏡(100瓦水銀燈，200小時以內)及相應的濾光片(DAPI Single Filter，Green/Red Dual Filter，Aqua Single Filter，Yellow Single Filter)等。

1.3FISH檢測

將收集的尿液進行多次離心、加固定液、滴片、烤片、胃蛋白酶消化、加探針、變性、雜交等處理后，在熒光顯微鏡下分析結果。

1.4FISH結果判定

整個玻片中至少應有25個形態異常的細胞，否則需重新制片或重新留取尿液標本，具有單一染色體多體(3,7,17中的一種)的異常細胞核不被評估為陽性。在形態異常的細胞中≥4個細胞可觀察到兩種以上的染色體多體信號(3,7 或 17)或≥12個細胞中都無法觀察到9p21位點信號(純合缺失)則視為FISH陽性，否則評估結果為陰性。

1.5尿脫落細胞學檢查

同時留取患者的尿液送我院檢驗科行細胞學檢查，每個患者連查3天晨尿，至少有1次結果回報為找到癌細胞視為尿脫落細胞學陽性，找到可疑癌細胞及未找到癌細胞視為尿脫落細胞學陰性。

1.6統計學分析

FISH的敏感性和特異性與尿脫落細胞學的比較采用SPSS21.0軟件進行分析,計數資料用χ2檢驗，P<0.05認為差異有統計學意義。

2　結果

實際研究的105例中經病理證實為尿路上皮癌者80例，包括腎盂尿路上皮癌9例，輸尿管尿路上皮癌3例，膀胱尿路上皮癌68例，其中FISH檢測

陽性者62例，陰性者18例，尿脫落細胞陽性者19例，陰性者61例。其余25例為非尿路上皮癌，包括前列腺增生7例，泌尿系結石8例，泌尿系感染5例，內翻性乳頭狀瘤2例，鱗癌1例，腺癌1例，移行上皮不典型增生1例，其中FISH檢測陽性者3例，陰性者22例，尿脫落細胞陽性者0例，陰性者25例。FISH檢測技術的敏感性為77.5%，特異性為88.0%。尿脫落細胞學檢查的敏感性為23.8%，特異性為100.0%。FISH與尿脫落細胞學相比，兩者的特異性相當，差異無統計學意義(P>0.05)，但敏感性明顯高于尿脫落細胞學，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1正常細胞

圖2異常細胞

在80例尿路上皮癌患者中，病理分期為肌層浸潤性尿路上皮癌48例，FISH陽性者42例，陽性率為87.5%，陰性者6例，尿脫落細胞學陽性者18例，陽性率為37.5%，陰性者30例；非肌層浸潤性尿路上皮癌32例，FISH陽性者20例，陽性率為62.5%，陰性者12例，尿脫落細胞學陽性者1例，陽性率為3.1%，陰性者31例。病理分級為高級別尿路上皮癌42例，FISH陽性者37例，陽性率為88.1%，陰性者5例，尿脫落細胞學陽性者16例，陽性率為38.1%，陰性者26例；低級別尿路上皮癌38例，FISH陽性者25例，陽性率為65.8%，陰性者13例，尿脫落細胞學陽性者3例，陽性率為7.9%，陰性者35例。具體見表1。

表1　FISH和尿脫落細胞學在病理不同分期、分級中的檢查結果及敏感性與特異性分析

3　討論

泌尿系統從腎盞、腎盂、輸尿管、膀胱及后尿道均被覆尿路上皮(又稱移行上皮)，起源于此部位的惡性腫瘤稱尿路上皮癌，是泌尿外科常見的惡性腫瘤，其特點是發病率高且術后極易復發，其中起源于腎盂和輸尿管的尿路上皮癌多屬于高分期、低分化[6]，惡性程度高，容易發生遠處轉移，失去手術指征。因此如何能對尿路上皮癌做出早期診斷及術后及時地監測復發顯得尤為重要。FISH技術是一項分子細胞遺傳學技術，它是在放射性原位雜交的基礎上發展起來的一種非放射性原位雜交技術。其基本原理是用已知標記的單鏈核酸為探針，按照堿基互補配對的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進行特異性結合，形成可被熒光顯微鏡檢測到的雜交雙鏈核酸[7]。近年來，FISH技術已廣泛用于血液腫瘤、宮頸癌、乳腺癌、膀胱癌和前列腺癌等疾病的診斷。2001年7月FISH檢測技術被美國FDA批準可以用于尿路上皮癌的診斷。Fadl-Elmula等人研究發現，起源于上尿路與膀胱的尿路上皮癌在遺傳學上基本是一致的[8]，換言之，FISH適用于膀胱和上尿路尿路上皮癌的診斷。

惡性腫瘤組織常發生染色體或基因等遺傳學的改變，其中尿路上皮癌易發生3號、7號和17號染色體數目的異常及9號染色體p21位點的缺失，其他如1、4、8、10、11、13、14、20及X、Y等染色體亦可能發生遺傳學改變，但概率相對較小。眾多研究資料證明CSP3、CSP7、CSP17及GLPp21探針組合診斷尿路上皮癌具有較高的敏感性和特異性[9-11]。本實驗就用此方法進行尿路上皮癌診斷。

由本實驗結果可知，FISH檢測和尿脫落細胞學檢查敏感性分別為77.5%、23.8%，差異有統計學意義(P<0.05)，特異性分別為88.0%、100.0%，差異無統計學意義(P>0.05)，且FISH檢測技術在肌層浸潤性、非肌層浸潤性、低級別和高級別的尿路上皮癌的診斷中均明顯高于尿脫落細胞學檢查。FISH技術在診斷尿路上皮癌中與尿脫落細胞學相比，具有較高的敏感性和相似的特異性。

臨床中常遇到腎癌侵犯腎盂或腎盂尿路上皮癌侵犯腎實質的患者，這兩種腫瘤在影像學上難以區分，但兩者的手術方式完全不同，故術前對這種患者做出正確診斷至關重要。從遺傳學的角度來講，FISH檢測技術可以用于兩者的區分，因為腎癌和腎盂尿路上皮癌的組織來源不同，發生的遺傳學改變也不相同。本實驗中未對腎癌患者行FISH檢測，這一結論尚需大量的實驗來驗證。

綜上所述，作為一種無創、快捷簡便、敏感度和特異度均較高、受其他因素影響小、標本易獲取等優點，且可以從基因水平并早于細胞形態學診斷尿路上皮癌，FISH檢測技術在臨床上的使用越來越廣泛。但是由于檢測費用昂貴及實驗室技術人員要求較高，且只是定性診斷，不能對病變組織進行定位，只能起協助診斷作用。目前，該項檢查不能大范圍的推廣。盡管如此，鑒于FISH檢測技術的眾多優點，相信將來會有比較好的應用前景。

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吳階平醫學基金會臨床科研專項資助基金(3R215P203428)

1007-4287(2016)09-1522-03

2016-03-26)