CRISPR/Cas9介導RB1基因敲除及其在雞前脂肪細胞分化、增殖中的功能研究

張　琦，黃嬌嬌，楊彩俠，王宇祥，張　慧，趙建國，李　輝*

(1.東北農業(yè)大學動物科學技術學院，哈爾濱 150030； 2.農業(yè)部雞遺傳育種重點實驗室，哈爾濱150030；3.中國科學院動物研究所 干細胞與生殖生物學國家重點實驗室，北京 100101)

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CRISPR/Cas9介導RB1基因敲除及其在雞前脂肪細胞分化、增殖中的功能研究

張琦1，2，黃嬌嬌3，楊彩俠1，王宇祥1，2，張慧1，2，趙建國3，李輝1，2*

(1.東北農業(yè)大學動物科學技術學院，哈爾濱 150030； 2.農業(yè)部雞遺傳育種重點實驗室，哈爾濱150030；3.中國科學院動物研究所 干細胞與生殖生物學國家重點實驗室，北京 100101)

旨在研究RB1基因在雞前脂肪細胞分化和增殖過程中的功能，本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在雞前脂肪細胞中敲除RB1基因，檢測雞前脂肪細胞的分化和增殖能力及相關標志基因的表達水平。結果表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠有效介導RB1基因的敲除并引起RB1基因翻譯的提前終止，敲除效率可以達到10%。油紅O提取比色和CCK-8的結果顯示，敲除RB1基因后，雞前脂肪細胞的分化能力減弱、增殖能力增強；qRT-PCR結果顯示，RB1基因敲除之后脂肪細胞分化標志基因G0S2、FAS、A-FABP的mRNA表達水平下降，尤其是G0S2基因的表達水平在前脂肪細胞分化的各個階段都表現(xiàn)為顯著的下降。同時RB1基因敲除還引起細胞周期相關基因CyclinD1、E2F1、Ki67、PCNA的mRNA表達水平升高。初步推斷，RB1基因可能是調控雞前脂肪細胞分化和增殖的關鍵調節(jié)因子。

CRISPR/Cas9；RB1；雞；脂肪沉積；分化；增殖

肉雞是全世界廣泛飼養(yǎng)并具有重要經濟價值的禽類。由于高強度選擇，肉雞的生長速度和肉產量得以明顯提高。然而肉雞體內脂肪(尤其是腹脂)蓄積過多一直是困擾世界范圍內肉雞育種工作者的重大問題。脂肪組織中脂肪細胞的過度增殖和分化會造成脂肪形成加劇從而引發(fā)機體脂肪的過度蓄積。因此，研究脂肪沉積的分子遺傳機制對防止動物體內脂肪過度沉積，提高肉雞的飼料轉化效率具有重要的意義。脂肪細胞的分化和增殖是一個由眾多因子共同調控的復雜過程，本課題組前期對雞1號染色體上影響腹脂性狀的QTL(數(shù)量性狀基因座)進行了初步定位，在雞1號染色體上發(fā)現(xiàn)了多個影響雞腹脂重和腹脂率的QTL；進一步通過加大標記密度和擴大群體規(guī)模的方法將影響雞腹脂率的QTL精細定位在雞1號染色體上3.7 Mb的區(qū)域內；對該區(qū)域內的基因進行分析，結果鑒定出了RB1(視網膜母細胞瘤基因)等與雞體脂性狀相關的重要基因[1-3]。因此，本課題組選擇RB1基因作為影響雞腹脂沉積的重要基因進行后續(xù)研究。在哺乳動物上針對RB1基因的研究較多，它參與機體內許多生長發(fā)育調節(jié)過程比如細胞周期調控、細胞凋亡和細胞衰老[3]，但在家禽上尤其是對雞脂肪細胞分化和增殖的影響的研究比較少。

自2013年CRISPR/Cas9系統(tǒng)的出現(xiàn)為基因組編輯提供了很好的解決方案。CRISPR系統(tǒng)是許多細菌的一種免疫防御機制，可用來抵抗外源核酸(如病毒或質粒)的入侵[4]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)利用人工設計的向導RNA(Single-guide RNA，sgRNA)介導外源表達的Cas9蛋白與基因組的靶點特異性地結合，從而實現(xiàn)對基因組DNA特異性地切割。該系統(tǒng)已經在多種模式生物、細胞以及家畜中得到大量研究與應用，具有非常廣闊的應用前景[5-7]。但是迄今為止，Cas9介導的基因組編輯在家禽上尚未見報道。

本研究的主要目的有兩個：一是探討CRISPR/Cas9技術對雞細胞基因組編輯的可行性；二是以雞前脂肪細胞為模型，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構建RB1基因敲除的雞前脂肪細胞，檢測敲除RB1基因后細胞的分化和增殖能力，研究RB1對雞脂肪細胞分化和增殖的作用機制。

1　材料與方法

1.1材料

試驗所用的細胞為實驗室前期構建的雞前脂肪細胞系(命名為ICPA-II)，Cas9載體為pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 載體。

1.2方法

1.2.1gRNA的設計和載體構建利用MIT張峰實驗室提供的在線工具(http：//crispr.mit.edu/)進行gRNA的設計。根據(jù)雞RB1基因的序列(GenBank登錄號：NM_204419)，針對RB1基因的第5外顯子和第6外顯子共設計了3個gRNAs，構建gRNA的寡核苷酸序列分別為(下劃線標記的堿基為構建gRNA的寡核苷酸上引入的BbsI酶切位點)：RB1-5E-gRNA1-F：5′-CACCGCAAAGAGGTGGATGTTAACA-3′，RB1-5E-gRNA1-R：5′-A-AACTGTTAACATCCACCTCTTTGC-3′；RB1-6E-gRNA1-F：5′-CACCGGACTTGTGGCCTTATTT-ATC-3′，RB1-6E-gRNA1-R：5′-AAACGATAAAT-AAGGCCACAAGTCC-3′；RB1-6E-gRNA2-F：5′-CACCGTATTTATCTGGAGCAACCCA-3′，RB1-6E-gRNA2-R：5′-AAACTGGGTTGCTCCAGAT-AAATAC-3′。

利用限制性內切酶片段長度多態(tài)性(RFLP)技術對上述3條gRNAs打靶后細胞的基因型進行鑒定。RB1-5E-gRNA1目標打靶區(qū)域存在HpaI酶切位點，RB1-6E-gRNA1和RB1-6E-gRNA2目標打靶區(qū)域存在HaeIII酶切位點。打靶成功可能造成潛在打靶位置附近基因組堿基的突變、缺失或者插入，從而使擴增的包含打靶片段的PCR產物不能被HpaI或HaeIII內切酶切割開。根據(jù)限制性內切酶的切割與否可以初步斷定RB1是否發(fā)生了基因打靶并分析打靶效率。篩選為陽性的細胞克隆再通過測序確定RB1基因的突變類型。

針對RB1基因的gRNA-CRISPR/Cas9打靶載體的構建：1)pX330空載體的酶切：用BbsI酶(NEB，R0539)線性化pX330質粒，并進行切膠回收。2)gRNA寡核苷酸雙鏈的合成：將合成的兩條寡核苷酸以100 μmol·L-1的形式稀釋，取等量的上游鏈和下游鏈混合。反應程序：95 ℃ 210 s，降溫至室溫。3)gRNA寡核苷酸雙鏈與線性化的pX330載體連接：連接體系：線性化的pX330載體35 ng、退火形成的gRNA寡核苷酸雙鏈2 μL、T4 buffer 1 μL、T4連接酶1 μL、補水至10 μL。連接條件：室溫5 min。隨后將連接產物進行轉化，并挑取單克隆菌落進行測序，將測序結果正確的菌液進行質粒大提。構建的3個載體的名稱分別為RB1-g4、RB1-g5、RB1-g6。

1.2.2gRNA的體外轉錄及體外切割活性檢測根據(jù)InvitroTranscription T7 Kit(TaKaRa，6140)試劑盒的說明書進行gRNA的體外轉錄。將體外轉錄獲得的gRNA與包含潛在打靶區(qū)域的DNA片段按照Cas9酶(NEB，M0386)的說明書進行酶切。酶切體系：包含潛在打靶區(qū)域的DNA片段150 ng、gRNA 100 ng、Cas9酶1 μL、10×buffer 2 μL、補水至20 μL。反應條件：37 ℃ 酶切1 h。酶切后的產物利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，根據(jù)電泳結果分析3個gRNAs的體外切割活性。

1.2.3細胞轉染細胞培養(yǎng)條件：10%血清的DMEM(Gibco，12800017)無抗生素培養(yǎng)基，37 ℃ 5% CO2中培養(yǎng)。野生型的雞前脂肪細胞按照6×104個·孔-1的濃度傳到6孔板中，然后按照LipofectamineTM2000 Transfection Reagent(Invitrogen，11668019)操作說明書進行轉染。將前期構建的RB1-g4、RB1-g5、RB1-g6質粒和GFP質粒共轉。轉染后24 h利用流式細胞儀進行分選，將帶有綠色熒光的細胞分選到96孔板中，每孔1個細胞。

1.2.4CRISPR/Cas9介導的細胞打靶效率和突變模式檢測將分選好的細胞進行培養(yǎng)，適時傳代。當細胞傳到24孔板時，每個孔取一半細胞繼續(xù)培養(yǎng)，剩下的一半細胞提取基因組進行打靶效率鑒定和突變模式檢測。對提取的細胞基因組的打靶區(qū)域進行PCR擴增，PCR擴增引物：RB1-5e-F：5′-AGCCAAGGTATCAGTGTTGGG-3′，RB1-5e-R：5′-AAACGGGCACTTCTCAGACA-3′。

對擴增的PCR產物進行酶切鑒定，不能被HpaⅠ酶切開的產物連接到pMD18-T載體上進行測序，進一步分析雞RB1基因的突變模式。

1.2.5前脂肪細胞誘導分化和油紅O染色及提取比色利用油酸誘導前脂肪細胞分化，然后利用油紅O染色和提取比色的方法檢測細胞的脂滴沉積情況，從表觀上觀察細胞的分化情況。具體步驟：向貼壁細胞中加入油酸(終濃度320 μmol·L-1)誘導細胞分化，持續(xù)誘導24、48、72和96 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗3遍，10%甲醛固定30 min，PBS洗2遍。油紅O工作液染10 min，棄去多余的染色液，60%異丙醇分色10～20 s，蒸餾水沖洗3次，室溫干燥，100%異丙醇溶解被染細胞中的油紅O 15 min。用100%異丙醇作為空白對照，用酶標儀測定 510 nm波長的吸光度值，每組內設置3個重復。

1.2.6CCK-8法檢測細胞增殖將敲除組和野生型組的細胞分別計數(shù)。然后將細胞傳入96孔板中，每個孔放入4 800個細胞。分別在細胞增殖0、24、48、72和96 h時向細胞培養(yǎng)基中加入培養(yǎng)基體積10%的CCK-8溶液，將細胞放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，然后用酶標儀測定450 nm波長的吸光度值。每組內設置3個重復。

1.2.7基因表達檢測用qRT-PCR方法進行相關基因表達水平的定量分析。qRT-PCR反應按FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)(Roche)說明書操作。反應體系：FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)(2×) 5 μL，上游引物(10 μmol·L-1) 0.2 μL，下游引物(10 μmol·L-1) 0.2 μL，cDNA模板 1 μL，ddH2O 3.6 μL。反應條件：95 ℃預變性 10 min，95 ℃變性 15 s，60 ℃復性延伸 60 s，共40個循環(huán)。熔解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，每個樣品設3孔重復。以β-actin基因為內參，利用2-△Ct方法將原始Ct值轉換為相對的基因表達量。所用引物序列見表1。

2　結　果

2.1雞RB1基因打靶載體的構建以及gRNA打靶效率的體外酶切檢測

將設計好的3個gRNA載體RB1-g4、RB1-g5、RB1-g6進行體外轉錄，獲得mRNA(圖1A)，將上述得到的mRNA、包含潛在打靶區(qū)域的DNA片段和Cas9蛋白共孵育，通過比較DNA片段被酶切的比例來估計相應gRNA的打靶效率(酶切率=切開條帶/檢測條帶的吸光度值)。結果顯示，RB1-g4組的DNA片段全部被酶切，體外切割效率為100%，而RB1-g5和RB1-g6的體外切割效率分別為70%和60%(圖1B)。所以后續(xù)選取RB1-g4進行細胞轉染等試驗。

表1qRT-PCR的引物

Table 1Primers used for qRT-PCR

基因名稱NameGenBank登錄號GenBankaccessionNo.引物序列(5'-3')Primersequence產物長度/bpSize退火溫度/℃AnnealingtemperatureRB1NM_204419GCCTTATTTATCTGGAGCAACAAGACGCACAGCAACAACT16060CyclinD1NM_205381AGAAGTGCGAAGAGGAAGTTGATGGAGTTGTCGGTGTA18660PCNANM_204170GTGCTGGGACCTGGGTTCGTATCCGCATTGTCTTCT15960Ki67NM_205505AGGTCCGTTCCCTCGTTCATTGTCGTCTGGGTCATC27060G0S2NM_001190924CGGGGCGAAAGAGCTGAGAGCACGTACAGCTTCACCAT17160A-FABPAY675941ATGTGCGACCAGTTTGTTCACCATTGATGCTGATAG14360E2F1NM_205219GGAATGGGTGCTGTGGGAGATAGCCAGGGAGGAGGAAACAAAC25360FASNM_205155AAGGAGGAAGTCAACGGTTGATGGTGAGGAGTCG19660β-actinNM_205518TCTTGGGTATGGAGTCCTGTAGAAGCATTTGCGGTGG33160

A.RB1基因上gRNA的靶位點示意圖：黑色方框為外顯子，斜體字母是gRNA的打靶序列，加粗字母是PAM序列，帶有下劃線的部分是打靶區(qū)域的酶切位點。B.各個gRNA打靶效率的體外酶切檢測結果：1.包含RB1-g4潛在打靶區(qū)域的DNA片段，長度為403 bp；2.RB1-g4打靶效率的體外酶切檢測結果，將DNA片段切成213和190 bp；3.包含RB1-g5和RB1-g6潛在打靶區(qū)域的DNA片段，長度為499 bp；4、5.分別是RB1-g5和RB1-g6打靶效率的體外酶切檢測結果，將DNA片段切割成了346和153 bpA.gRNA target sites in RB1：Exons are shown as black boxes，the gRNA-targeting sequences are the labeled in italic letters，and the protospacer-adjacent motif (PAM) sequences are the labeled in bold letters，the restriction sites at the target regions are underlined.B.In vitro cleavage activity assay of gRNA:The 1st (403 bp) and 3rd lanes (499 bp) are positive control；The 2nd lane is the RFLP result of RB1-g4 targeting activity in vitro detection，which separates the amplification fragment into 213 and 190 bp；The 4th and 5th lanes indicate the results of RB1-g5 and RB1-g6 targeting activity in vitro detection，which separate the amplification fragment into 346 and 153 bp圖1　gRNA的設計和打靶效率檢測Fig.1　Design and in vitro cleavage activity assay of gRNA

2.2CRISPR/Cas9介導的雞前脂肪細胞中RB1基因的敲除

將RB1-g4質粒和GFP質粒共轉染ICPA-Ⅱ細胞。對篩選到的細胞提取DNA進行PCR擴增，然后用HpaⅠ內切酶對PCR產物進行切割。共鑒定了10個細胞克隆，其中有1個克隆(命名為RB1-KO-1-4)即第3泳道的PCR產物不能被HpaⅠ酶切開(圖2A)，初步推算CRISPR/Cas9系統(tǒng)在雞前脂肪細胞系中RB1基因的敲除效率為10%(1/10)。RB1-KO-1-4細胞克隆的PCR產物測序結果顯示，這個細胞克隆的兩條同源染色體的打靶類型分別為插入1個堿基和缺失5個堿基，造成了氨基酸的移碼突變(圖2B)，使氨基酸翻譯提前終止(圖2C)。對敲除RB1基因的雞前脂肪細胞和野生型的雞前脂肪細胞進行了qRT-PCR分析，結果發(fā)現(xiàn)敲除RB1基因的雞前脂肪細胞的RB1基因表達量極顯著(P<0.01)的低于野生型雞前脂肪細胞的RB1基因表達量(圖2D)。由于目前針對雞這個物種的Western blot的抗體較少，之前的試驗中也嘗試了一些商業(yè)化的針對哺乳動物RB1基因的抗體，但是都沒有特異性反應。所以本試驗沒有利用Western blot的方法驗證RB1基因的敲除。

A.HpaⅠ酶切鑒定；B.RB1敲除細胞的基因組類型；C.基因突變和氨基酸突變結果，1個堿基的插入和5個堿基的缺失導致了氨基酸翻譯提前終止；D.雞RB1基因在野生型的雞前脂肪細胞和敲除RB1基因的雞前脂肪細胞中的表達情況。*.P<0.05，**.P<0.01，下同A.gRNA mutagenesis efficiencies were assessed by HpaⅠ；B.Sequence results confirmed RB1 deletion；C.1 bp insertion and 5 bp deletion in RB1 gene results in premature translation termination condon；D.RB1 transcriptional expression was significantly reduced in RB1 knockout chicken preadipocyte when compared with wild-type cells.*.P<0.05，**.P<0.01，the same as below圖2　CRISPR/Cas9介導RB1基因在雞脂肪前體細胞中的敲除Fig.2　Identification of RB1 gene knockout mediated by CRISPR/Cas9 in chicken preadipocyte

2.3RB1基因促進雞前脂肪細胞的分化

為了檢測RB1基因對雞前脂肪細胞分化的影響，分別將敲除RB1基因的雞前脂肪細胞和野生型的雞前脂肪細胞以6×104個·孔-1的密度傳到6孔板中，待細胞穩(wěn)定貼壁后，加入油酸(終濃度為320 μmol·L-1)誘導細胞分化，此時記為試驗0 h。持續(xù)誘導24、48、72和96 h后進行油紅O染色(圖3A)并進行提取比色和細胞數(shù)目的校正。結果如圖3B所示，在誘導分化24、48、72和96 h時，敲除組的油紅O提取比色的OD值均極顯著低于野生型組(P<0.01)。敲除組RB1基因的表達量極顯著或顯著(P<0.01，P<0.05)低于野生型組RB1的表達量(圖3C)。

A.油紅O染色(100×)；B.油紅O提取比色表明RB1基因敲除阻礙雞前脂肪細胞分化過程中的脂滴形成；C.RB1基因在雞脂肪前體細胞分化過程中表達呈上升趨勢，同時RB1基因在敲除組細胞中顯著低于在野生型雞前脂肪細胞的表達；D.敲除RB1基因影響了脂肪細胞分化標志基因(G0S2、FAS、A-FABP)的表達A.Oil red O staining(100×)；B.Oil red O extraction results showed that RB1 knockout impairs lipid formation；C.Expression of RB1 was increased during the differentiation of chicken preadipocyte and decreased in the RB1 knockout cells when compared with wild type cells；D.RB1 knockout decreased expression of differentiation marker genes such as G0S2，F(xiàn)AS，A-FABP圖3　敲除RB1基因對雞前脂肪細胞分化的影響Fig.3　Effects of RB1 knockout on chicken preadipocyte differentiation

為了研究RB1基因對雞前脂肪細胞分化過程中成熟脂肪細胞標志基因表達的影響，在進行油紅O染色的同時收集了5個時間點的細胞，利用qRT-PCR的方法檢測雞前脂肪細胞分化過程中成熟脂肪細胞標志基因(G0S2、FAS、A-FABP基因)的表達水平。結果顯示，誘導分化0、24、48、72和96 h時，敲除組G0S2的表達量極顯著低于野生型組(P<0.01)；誘導分化48 h時，敲除組FAS的表達量顯著低于野生型組(P<0.05)；誘導分化48 h時，敲除組A-FABP的表達量極顯著低于野生型組(P<0.01)，誘導分化72 h時，敲除組A-FABP的表達量顯著低于野生型組(P<0.05)(圖3D)。

2.4RB1基因抑制雞前脂肪細胞的增殖

為了檢測RB1基因對雞前脂肪細胞增殖的影響，對敲除RB1基因的雞前脂肪細胞和野生型的細胞進行了CCK-8檢測，結果顯示在細胞增殖24和48 h時，敲除RB1基因的雞前脂肪細胞的增殖速度要極顯著高于野生型的雞前脂肪細胞的增殖速度(P<0.01)(圖4A)。CCK-8試驗證明RB1基因抑制細胞增殖，為了探究此抑制作用是否是由細胞周期變化引起的，隨后利用流式細胞儀進行了細胞周期檢測，結果如圖4B所示。敲除RB1基因引起雞前脂肪細胞中G1期細胞比例顯著降低(P<0.05)，G2期細胞比例顯著升高(P<0.05)。由此結果可以推測，雞RB1基因對雞前脂肪細胞的細胞周期進程具有一定的抑制作用。

為了在mRNA水平上研究RB1基因對雞前脂肪細胞增殖相關基因的影響，分別將敲除RB1基因的雞前脂肪細胞和野生型的雞前脂肪細胞以每孔3×104個·孔-1的密度傳到6孔板中，待細胞穩(wěn)定貼壁后記為0 h，然后分別在細胞增殖24、48、72和96 h收集細胞，以β-actin為內參，利用qRT-PCR的方法分析RB1基因敲除對雞前脂肪細胞增殖過程中重要基因(CyclinD1、E2F1、Ki67、PCNA)表達情況的影響。

A.敲除RB1基因促進雞前脂肪細胞數(shù)量的增加；B.敲除RB1基因降低雞前脂肪細胞細胞G1期細胞的比例，增加了G2期細胞的比例；C.敲除RB1基因影響了雞前脂肪細胞增殖過程中重要基因(Cyclin D1、E2F1、Ki67 and PCNA)的表達A.RB1 knockout increased chicken preadipocyte proliferation；B.RB1 knockout decreased the ratio of cells at G1 stage but increased the ratio of cells at G2 stage；C.RB1 knockout increased expression of cell proliferation associated genes such as Cyclin D1，E2F1，Ki67 and PCNA圖4　敲除RB1基因對雞前脂肪細胞增殖的影響Fig.4　Effects of RB1 knockout on chicken preadipocyte proliferation

如圖4C所示，增殖24 h時，敲除組CyclinD1的表達量極顯著高于野生型組(P<0.01)；增殖24 h時，敲除組E2F1的表達量顯著高于野生型組(P<0.05)，在96 h時達到極顯著水平(P<0.01)；增殖24 h時，敲除組Ki67的表達量顯著高于野生型組(P<0.05)；增殖24、48和72 h時，敲除組PCNA的表達量顯著高于野生型組(P<0.05)，在96 h時達到極顯著水平(P<0.01)。

3　討　論

基因編輯技術是研究基因功能的重要工具，早期的同源重組技術雖然能對目的基因進行有效編輯，但效率極低。人工核酸酶技術的出現(xiàn)極大地提高了基因組編輯的效率。目前比較常見的人工核酸酶系統(tǒng)主要有ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9 3種。但ZFNs和TALENs系統(tǒng)在質粒構建時費時費力[8-9]，而CRISPR/Cas9系統(tǒng)對靶點的識別依賴于gRNA與靶標DNA之間的堿基互補配對，使得質粒的構建更為簡單、高效[10]。因此，本研究選用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對雞前脂肪細胞進行基因打靶。結果顯示，CRISPR/Cas9系統(tǒng)對雞前脂肪細胞的敲除效率為10%。這與CRISPR/Cas9系統(tǒng)在其他物種細胞上的敲除效率相比要低一些[11]，造成打靶效率低的原因可能是由于這個系統(tǒng)在雞上的應用還不夠完善，還需要進一步優(yōu)化。

RB1 基因已經被證明參與了許多生長發(fā)育調節(jié)過程。對人和小鼠的研究表明，RB1促進肌細胞[12]、成骨細胞分化[13]以及紅細胞生成[14]。但是RB1基因對雞前脂肪細胞分化和增殖的調控機理仍不明確。本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功構建了敲除RB1基因的雞前脂肪細胞，為研究RB1基因的作用機制提供了有效的模型。為了確定雞RB1基因對雞前脂肪細胞分化的作用，本研究將RB1基因在雞前脂肪細胞中進行了敲除，并結合油紅O染色和提取比色的方法比較了敲除組和野生型組細胞的分化能力。結果顯示，敲除RB1基因之后，雞前脂肪細胞脂滴沉積能力減弱。先前有研究顯示，在體外培養(yǎng)條件下，RB1基因所編碼的蛋白pRb可促進小鼠胚胎成纖維細胞轉分化成脂肪細胞[15]，造成上述結果是因為在小鼠胚胎成纖維細胞中pRb能激活C/EBPs家族介導的轉錄途徑，進而誘發(fā)脂肪細胞分化。M.Classon等[16]也發(fā)現(xiàn),在3T3成纖維細胞中加入pRb，隨著pRb濃度的增加，C/EBPα介導的轉錄被激活，使細胞進行分化，反之缺失pRb時3T3成纖維細胞表現(xiàn)為分化受阻。這與本試驗的研究結果是一致的。本研究利用qRT-PCR的方法檢測了在誘導分化的過程中脂肪細胞分化標志基因的表達情況。結果顯示，誘導分化24、48、72和96 h時，敲除組G0S2基因的表達量極顯著低于野生型組(P<0.01)；誘導分化48 h時，敲除組的FAS基因的表達量顯著低于野生型組(P<0.05)；誘導分化48和72 h敲除組的A-FABP基因的表達量顯著低于野生型組(P<0.05，P<0.01)。T.Ma等[17]研究表明，在小鼠上敲除G0S2基因，小鼠的脂肪沉積能力要顯著的低于野生型的小鼠。H.X.Cui等[18]研究表明，F(xiàn)AS基因的表達決定著脂肪酸的合成能力，而脂肪酸又是脂肪的主要儲存形式甘油三酯合成所必須的原料。K.Motojima[19]研究表明，A-FABP基因在哺乳動物的脂肪酸運輸和脂肪細胞分化過程中發(fā)揮著重要的作用。因此A-FABP、G0S2、FAS對于脂肪的合成以及脂肪的沉積起著重要的作用，并且這3個基因也是前脂肪細胞分化成成熟脂肪細胞的重要標志基因。本研究結果顯示，在雞前脂肪細胞上敲除RB1基因之后，G0S2、FAS、A-FABP基因的表達量都呈現(xiàn)下降的趨勢。由此可以得出結論，在雞前脂肪細胞敲除RB1基因減弱了前脂肪細胞分化成脂肪細胞的能力，即RB1基因促進雞前脂肪細胞的分化。

為了檢測RB1基因對雞前脂肪細胞增殖的影響，通過CCK-8的方法發(fā)現(xiàn)敲除RB1基因促進雞前脂肪細胞增殖，這與對鼠坐骨神經膜細胞的研究中發(fā)現(xiàn)干擾RB促進細胞增長的結果[20]是一致的。在哺乳動物中，RB1主要通過與E2F作用，調控細胞周期進程，從而調節(jié)細胞的增殖[21]。由此猜測RB1基因對雞前脂肪細胞增殖的抑制作用可能與其調節(jié)細胞周期的進程有關。本研究對細胞周期的檢測結果表明，敲除RB1基因引起雞前脂肪細胞中G1期細胞比例顯著降低(P<0.05)，G2期細胞比例顯著升高(P<0.05)。由此可以推測，雞RB1基因對雞前脂肪細胞的細胞周期進程具有一定的抑制作用。利用qRT-PCR的方法檢測了細胞周期相關基因的表達情況。結果顯示，增殖24 h時，敲除組的CyclinD1的表達量極顯著高于野生型組(P<0.01)；增殖24 h時，敲除組的E2F1的表達量顯著高于野生型組(P<0.05)，在96 h時達到極顯著水平(P<0.01)；增殖24、48 和72 h時，敲除組的Ki67的表達量顯著高于野生型組(P<0.05)；增殖24、48和72 h時，敲除組的PCNA的表達量顯著高于野生型組(P<0.05)，在96 h時達到極顯著水平(P<0.01)。CyclinD1為細胞周期蛋白，是細胞G1期到S期的重要調控因子[22]，E2F轉錄因子在調控細胞周期中也具有重要角色[23-24]，CyclinD1與E2F共同參與以pRb 為主的細胞周期調控網絡[25]。Ki67和PCNA都是反映細胞增殖狀態(tài)的良好指標[26-27]。在雞前脂肪細胞上敲除RB1基因之后，CyclinD1、E2F1、Ki67、PCNA基因的表達量都呈現(xiàn)上升的趨勢。由此可以得出結論，雞RB1基因主要是通過抑制雞前脂肪細胞的細胞周期進程，進而抑制雞前脂肪細胞的增殖。

綜上所述，本研究首次驗證了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在雞這一物種上應用的可行性，即CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠有效介導雞細胞的基因敲除。另外，本研究發(fā)現(xiàn)RB1基因對雞前脂肪細胞的分化具有促進作用，而對雞前脂肪細胞的增殖具有抑制作用。本研究結果驗證了筆者之前的QTL定位分析結果，同時為更加深入的研究RB1基因在雞前脂肪細胞分化、增殖過程中所發(fā)揮的作用奠定了基礎。

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(編輯郭云雁)

CRISPR/Cas9 MediatedRB1 Knockout and Its Impact on Chicken Preadipocytes Differentiation and Proliferation

ZHANG Qi1，2，HUANG Jiao-jiao3，YANG Cai-xia1，WANG Yu-xiang1，2，ZHANG Hui1，2，ZHAO Jian-guo3，LI Hui1，2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China；2.KeyLaboratoryofChickenGeneticsandBreeding，MinistryofAgriculture，Harbin150030，China；3.StateKeyLaboratoryofStemCellandReproductiveBiology，InstituteofZoology，ChineseAcademyofSciences，Beijing100101，China)

In order to study the role ofRB1 gene on chicken preadipocyte differentiation and proliferation.CRISPR/Cas9 system was established and conducted to knockout theRB1 gene in the chicken preadipocyte.The proliferation and differentiation of chicken preadipocytes and the expression of related marker genes were detected.Results showed that the CRISPR/Cas9 system could effectively mediateRB1 knockout and cause truncated translation in chicken at the rate of 10%.Oil Red O and CCK-8 were used to evaluate the ability of differentiation and proliferation in chicken preadipocyte respectively.Knockout ofRB1 in chicken preadipocyte resulted in enhanced proliferation capability and decreased differentiation capability in chicken preadipocyte.RB1 knockout decreased the transcriptional expression of adipocyte differentiation associated genes such asG0S2，F(xiàn)ASandA-FABP.Especially，the expression ofG0S2 was significantly decreased at all stages of preadipocyte differentiation.Further，RB1 knockout increased the expression of cell proliferation associated genes such asCyclinD1，E2F1，Ki67 andPCNA, which was corresponded to the enhanced proliferation capability in theRB1 knockout cells.In summary，RB1 may be a key regulator on differentiation and proliferation of chicken preadipocyte.

CRISPR/Cas9；RB1；chicken；fat deposition；differentiation；proliferation

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.09.005

2016-03-22

國家自然科學基金(青年科學基金)(31301960)；國家863項目(2013AA102501)；現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項(CARS-42)

張琦(1990-)，女，黑龍江齊齊哈爾人，碩士生，主要從事家禽遺傳育種研究，E-mail：zhangxiaoqi0405@163.com

李輝，教授，E-mail：lihui@neau.edu.cn

S831.2

A

0366-6964(2016)09-1775-10