基于iTRAQ 技術的脂多糖刺激下奶牛乳腺上皮細胞的蛋白組學分析

李　蓮，唐　娟，吳　潔，王根林

(南京農業大學動物科技學院，南京 210095)

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基于iTRAQ 技術的脂多糖刺激下奶牛乳腺上皮細胞的蛋白組學分析

李蓮，唐娟，吳潔，王根林*

(南京農業大學動物科技學院，南京 210095)

基于iTRAQ多重標記串聯質譜技術系統研究脂多糖刺激下乳腺上皮細胞蛋白的差異表達，并對與乳蛋白、乳脂肪相關差異表達基因進行驗證。培養純化后的乳腺上皮細胞，經脂多糖(LPS)處理后提取細胞蛋白，采用 iTRAQ 標記和聯合二維液相色譜-串聯質譜(2D-LC-MS/MS)檢測分析得到各組間細胞差異表達蛋白，并采用蛋白印跡和酶聯免疫法(ELISA)對差異蛋白進行驗證，然后對與乳蛋白、乳脂肪相關基因的相互作用蛋白進行PPI(Protein protein interaction)預測。乳腺上皮細胞共鑒定出 2 487個蛋白，其中差異蛋白共341個，與對照組相比，163個蛋白表達上調，178個蛋白表達下調。iTRAQ測定結果顯示，LPS處理組與對照組相比，αs1-酪蛋白(CSN1S1)、κ-酪蛋白(CSN3)和脂肪酸合酶(FASN)基因蛋白表達水平有統計學意義；經蛋白印跡試驗結果表明，LPS誘導組αs1-酪蛋白表達水平同對照組比較，明顯降低(P<0.05)；應用ELISA方法測定細胞培養液中αs1-酪蛋白、κ-酪蛋白和脂肪酸合酶的濃度結果顯示，LPS誘導組細胞培養液中上述蛋白的濃度明顯低于對照組(P<0.05)。綜上表明，LPS誘導的炎癥反應可影響乳腺上皮細胞的乳蛋白和乳脂肪的合成。

牛；乳腺上皮細胞；iTRAQ 技術；蛋白質組學；脂多糖

乳腺炎是奶牛養殖行業中造成經濟損失最大的疾病之一。從乳腺結構來看，乳腺上皮細胞是乳腺防御病原菌入侵的第一線[1]，在免疫應答、局部抵御、合成及分泌乳汁中發揮重要作用[2-4]。對于奶牛臨床乳腺炎來說，其中大腸桿菌是奶牛感染臨床型乳腺炎的主要病原菌，乳腺中大腸桿菌數量增加越快，乳腺中存在的脂多糖(LPS)越多，就可能更快導致臨床型炎癥的發生。LPS是革蘭陰性菌細胞壁上一種成份[5]，廣泛存在于自然界致病原。研究表明，LPS 是一種高效的促炎反應因子[6]，能夠促進動物機體產生急性期反應蛋白和大量的細胞因子，引起機體炎癥反應，致使乳腺泌乳營養代謝模式、內分泌調控模式等隨之改變，對乳脂肪、乳蛋白的合成和含量有較大的影響[2-4]。本研究通過iTRAQ (Isobaric tag for relative and absolute quantification)技術從蛋白水平研究脂多糖對奶牛乳腺上皮細胞基因表達的影響，并且進一步篩選分析與乳腺上皮細胞泌乳功能相關基因，為揭示LPS對乳腺分泌功能影響的作用機制提供理論支持。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

生長培養基(DMEM) 、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)均購自美國 Gibco公司。FASN抗體購于Santa Cruz 公司。αs1-酪蛋白、κ-酪蛋白抗體、脂多糖(Escherichiacoli0111：B4)購于Sigma公司。αs1-酪蛋白、κ-酪蛋白和脂肪酸合成酶(FASN)ELISA試劑盒購于上海勁馬生物技術公司。電熱恒溫 CO2培養箱(美國 Thermo) 、倒置顯微鏡(CKX41，日本 Olympus) 、超低溫冰箱 (美國 Thermo) 、冷凍離心機(5415R 型，德國 Eppendorf)等。

1.2方法

1.2.1乳腺上皮細胞的獲取自南京市附近的屠宰場采集3頭屠宰后的健康泌乳期奶牛的乳腺組織，所采集3頭奶牛情況：1頭泌乳中期(因吞食了鐵釘，鐵釘刺穿胃壁刺到心包膜)，2頭泌乳后期(由于產量低而被淘汰)。所采集的乳腺組織，均有乳汁分泌。奶牛屠宰后立即采用無菌術采集奶牛乳腺組織，并將其置于無菌的PBS中，帶回實驗室備用。將采集的乳腺組織采用酶消化法獲取乳腺上皮細胞，根據成纖維細胞與上皮細胞對胰蛋白酶耐受時間的不同及 2 種細胞貼壁速度的差異分離和純化乳腺上皮細胞。對細胞中角蛋白-18 進行鑒定[10]。純化的奶牛乳腺上皮細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，在5% CO2和37 ℃的條件下貼壁生長，每隔24 h更換培養基。用 0.25%胰蛋白酶消化進行傳代，倒置顯微鏡觀察細胞生長狀況。

1.2.2脂多糖處理乳腺上皮細胞待細胞鋪滿培養板90%時，更換為無血清培養液，并加入試劑處理。試驗分為對照組( Con)和脂多糖處理組(10 μg·mL-1)，處理細胞24 h后，收集細胞上清液，刮取細胞，置于-80 ℃冰箱保存。脂多糖處理組濃度參照文獻[7]確定。然后將來自于3頭奶牛的乳腺上皮細胞混合備用。

1.2.3蛋白質提取消化將3頭奶牛的細胞樣品用液氮磨成干粉；用 200 μL 的 TEAB 溶解上述干粉，然后加入 4 倍體積的冷丙酮(含終濃度為 10 mmol·L-1DTT)沉淀2 h；13 000 r·min-1離心 20 min，收集沉淀；加入800 μL 的冷丙酮(含終濃度為 10 mmol·L-1DTT)重懸沉淀；13 000 r·min-1離心 20 min，收集沉淀，然后風干沉淀；加入 100 μL TEAB 溶解蛋白。采用選擇常規的 Bradford 定量方法定量總蛋白質。混合3頭奶牛中對照組和試驗組的細胞蛋白，然后對照組和試驗組分別作2個技術重復，共4份樣品。

1.2.4iTRAQ標記及高效液相色譜法分離肽段提取的總蛋白質進行酶切和除鹽后，采用4-plex進行標記(武漢金開瑞生物工程有限公司)。iTRAQ 試劑標記蛋白按操作手冊的步驟進行：取出 iTRAQ試劑，使其恢復至室溫，每份 iTRAQ 試劑加 70 μL 乙醇，渦旋，離心；在4份樣品內分別加入113、114、117和118 iTRAQTM試劑，渦旋，離心，室溫孵育1 h；混合 iTRAQ 試劑標記的蛋白，加入同一試管，混勻渦旋，離心。混合標記蛋白前，需確認所消化的蛋白是否已成功標記 iTRAQ 標記物：所標記樣品經純化后用ABI 4700 進行標記驗證，如果標記成功，可見到所標記的報告部分( 本研究中選用113-114為對照組報告部分，117-118 為處理組報告部分)；若未檢測到相應的峰值則需要重新標記)。標記后等量混合，反相柱分離。

1.2.5LC-MS/MS 質譜檢測與數據處理將樣品通過LC-MS-MS進行蛋白質檢測。對質譜數據用ProteinPilotTM軟件進行檢索和篩選。 對于proteinpilot的鑒定結果，需進一步過濾，對于鑒定到的蛋白，unused score≥1.3(即可信度水平在95%以上)，每個蛋白至少包含一個unique肽段的蛋白為可信蛋白，不符合該條件的蛋白不包括在結果中；對于鑒定的肽段，可信度在95%以上認為可信肽段，對于蛋白質定量，為了得到更全面的關于某蛋白的定量信息，Proteinpilot軟件使用了conf≥15的所有肽段，不符合該條件的肽段不包含在結果中。

使用Proteinpilot軟件對蛋白質組 iTRAQ定量。當差異倍數達到 1.3倍及以上(即上調≥1.3倍和下調≤0.77倍)，且經過顯著性統計檢驗其P-value值≤0.05時，視為顯著差異蛋白。運用富集分析算法對初步鑒定的蛋白數據進行分組，鑒定的蛋白與數據庫進行比對，選擇GO(Gene Ontology) 的生物過程、細胞成分和分子功能注釋對蛋白進行分類。1.2.6ELISA檢測細胞培養液中αs1-酪蛋白、κ-酪蛋白及脂肪酸合成酶(FSAN)濃度檢測細胞培養液中αs1-酪蛋白、κ-酪蛋白和脂肪酸合成酶(FSAN)水平，按照試劑盒(上海勁馬生物有限公司)說明書進行測定。1.2.7乳腺上皮細胞αs1-酪蛋白表達提取乳腺上皮細胞蛋白，測定濃度后，將樣品在5%～10% SDS-PAG中電泳(濃縮膠80 V；分離膠120 V)2 h后，轉印于硝酸纖維素膜上(100 mA 45 min)。硝酸纖維素膜經封閉液(5%脫脂乳)封閉1.5 h后，TBS洗滌3次，每次10 min，于αs1-酪蛋白一抗工作液(稀釋比例1∶1 000)中孵育過夜。TBS洗滌3次，用辣根過氧化物酶標記的二抗工作液(稀釋比例1∶2 000)孵育1.5 h。TBS洗滌3次，超敏發光液顯光，感光X光片后，顯影定影。β-tublin蛋白作為內參蛋白。1.2.8相互作用蛋白質組預測蛋白質很少單獨發揮作用，本研究選擇了與乳腺脂肪和蛋白合成相關的5個目標蛋白質，對檢測到的蛋白進行PPI(Protein-protein interaction)預測，繪制出互作關系網絡圖。

1.3統計分析

使用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。所

有數據用“平均數±標準差(x±s)”表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05 表示差異顯著。

2　結　果

2.1差異蛋白及GO 功能分類

乳腺上皮細胞總共鑒定出 2 487個蛋白；蛋白芯片所獲得的數據使用絕對值≥1.3檢出，其中檢出差異蛋白共341個，與對照組相比163個蛋白表達上調，178個蛋白表達下調。其中與炎癥和免疫相關的有代表性的上調差異蛋白是增殖細胞核抗原(PCNA)、前列素內環氧化物合成酶2(PTGS2/COX2)、血紅素加氧酶1(HO-1，Heme oxygenase 1)和免疫共刺激分子CD276等。與乳脂肪和乳蛋白合成相關的有代表性的下調差異蛋白如αs1-酪蛋白(CSN1S1)、κ-酪蛋白(CSN3)和FASN。其中上調的基因還有與熱休克相關的熱休克蛋白70(HSPA13)。將341個差異蛋白質按照蛋白質分子功能、生物過程和信號通路分別進行分析。其中P<0.05的生物學過程共177條，篩選其中與炎癥以及合成代謝相關的過程 (圖1和圖2)。與炎癥相關的8條生物學過程中，其中炎性反應過程2條，防御反應過程1條，其余5條均與免疫反應相關。與合成和代謝相關的18條生物學過程中，其中14條與代謝過程有關，4條與生物合成有關。

A.炎癥反應；B.急性炎癥反應；C.防御反應；D.免疫系統過程；E.免疫系統過程調控；F.免疫應答的調控；G.體液免疫應答；H.免疫系統過程正調控A.Inflammatory response;B.Acute inflammatory response;C.Defense response;D.Immune system PROCRSS;E.Regulation of immune system proecss;F.Regulation of immune response;G.Humoral immune response圖1　與炎癥相關的生物學過程Fig.1　Biological processes associated with inflammation

A.類固醇代謝進程的調控；B.甘油脂代謝過程；C.含硫氨基酸的代謝過程；D.細胞蛋白質代謝過程的正調控；E.多糖代謝過程；F.蛋白質代謝過程的正調控；G.不飽和脂肪酸的代謝過程；H.脂代謝過程；I.核苷磷酸代謝過程；J.磷脂代謝過程；K.有機磷代謝過程；L.氨基聚糖分解代謝過程；M.細胞脂質代謝過程；N.肪酸生物合成過程；O.細胞因子生物合成過程；P.黏多糖的生物合成過程；Q.核苷磷酸生物合成過程；R.糖胺聚糖的生物合成過程A.Regulation of sterid metabolic process;B.Glycerolipid metabolic process;C.Sulfur amino acid metbolic process;D.Positive regulation of celluar protein metabolic process;E.Polysaccharide metabolic process;F.Positive regulation of protein metabolic process;G.Unsaturated fatty acid metabolic process;H.Lipid metabolic process;I.Nucleosiede monophosphate metabolic process;J.Phospholipid metabolic process;K.Organophosphate metabolic process;L.Aminoglcan catabolic process;M.Cellular lipid metabolic process;N.Fatty acid biosynthetic process;O.Cytokine biosynthetic process;P.Glycosaminoglycan biosynthetic;Q.Nucleside monophosphate process;R.Aminoglycan biosynthetic process圖2　與合成和代謝相關的生物學過程Fig.2　Biological processes related to synthesis and metabolism

2.2乳腺上皮細胞中αs1-酪蛋白的表達

LPS處理組乳腺上皮細胞αs1-酪蛋白表達水平較對照組降低，兩組比較差異顯著(P<0.05)，與 MS鑒定試驗中αs1-酪蛋白下調的結果一致。

2.3乳腺上皮細胞培養上清中αs1-酪蛋白、κ-酪蛋白和脂肪酸合成酶(FASN)的濃度

LPS處理組乳腺上皮細胞培養上清中αs1-酪蛋白、κ-酪蛋白的含量較對照組明顯降低，兩組比較差異極顯著(P<0.01，圖4A和B)，與質譜鑒定試驗中αs1-酪蛋白和κ-酪蛋白下調的結果一致。LPS處理組乳腺上皮細胞脂肪酸合成酶的活性顯著低于對照組(P<0.05，圖4c)，且與質譜鑒定試驗結果一致。

圖3　乳腺上皮細胞αs1-酪蛋白的表達Fig.3　The expression of αs1-casein in BMEC

圖4　培養上清中αs1-酪蛋白、κ-酪蛋白和脂肪酸合成酶的濃度Fig.4　The concentration of αs1-casein,κ-casein and fatty acid synthase in culture medium

2.4與乳蛋白和乳脂肪合成相關蛋白的互作網絡

蛋白質很少單獨發生作用，在所有生物功能中，通常以蛋白質復合物的功能占主導地位。為了進一步了解蛋白質的功能，以與乳蛋白(CSN、LTA、EIF4E)和乳脂肪合成(FASN、CD36)相關的5個蛋白為目標蛋白質(圖中藍色邊框V點代表目標蛋白質)進行了PPI預測。如圖5為其中3個蛋白的質譜圖。另如圖6所示，圖中共有271個點，形成的兩兩互作關系有966個。其中下調基因用綠色表示，上調基因用紅色表示。在此網絡圖的5個目標蛋白中連接度(Degree)和壓力向心性最高的基因是“EIF4E”，隨后為CD36、LTF、FASN和CSN3。由于連接度值越大，反映此節點在網絡中的重要性越大，而壓力向心性值越大，說明此節點越可能成為網絡壓力響應中的關鍵點，所以EIF4E在5個目標蛋白質中重要性最大。另外與脂肪相關的CD36和

A.用于鑒定CD36的肽段EVVLEEGTIAFK的MS/MS圖譜；B.用于鑒定FASN的肽段ACVDTALENMTSLK的MS/MS圖譜；C.用于鑒定EIF4E的肽段WLITLNK的MS/MS圖譜。對照組細胞用iTRAQ 試劑113和114標記，LPS處理組細胞用iTRAQ reagent 117和118標記A.Mass spectra for identification the EVVLEEGTIAFK peptide fragment of CD36；B.Mass spectra for identification the ACVDTALENMTSLK peptide fragment of FASN；C.Mass spectra for identification the WLITLNK peptide fragment of EIF4E .The control groups were labeled by iTRAQ reagent 113 and 114，LPS-treated groups were labeled by iTRAQ reagent 117 and 118.圖5　用于鑒定和定量CD36、FASN和EIF4E的MS/MS質譜圖Fig.5　Mass spectra for identification and quantification of CD36，FASN和EIF4E

圖中共有271個點(基因)，966個互作關系，點的顏色隨差異基因變化倍數的增大由綠色(下調)-白色-紅色(上調)漸近變化，即顏色越深代表變化倍數越大；中心節點(degree最大)的點最大；基因之間的互作關系可信度越高，節點間的連線越粗；藍色邊框V點代表目標蛋白質There were 271 points(gene)and 966 interactions between these genes in figure 6. The color of points was asymptotic change from green(down-regulated)-white-red(up-regulated) according to the fold change of different genes，darker represents a higher fold change; the central node(maximum degree) was the maximum point; the higher credibility of interaction between genes was, the thicker lines between the nodes was; the blue border point V represents the target protein圖6　互作關系圖Fig.6　Protein-protein interaction network

FASN之間具有一定的互作關系(可信度得分404)，而CSN3與其他兩個候選蛋白LTF和EIF4E則無互作關系。

3　討　論

近年來，蛋白組學提供了一個有效的方法來發現乳腺炎中不同蛋白的表達以及為發現生物標記物和藥物靶點的基礎理論[8]。運用iTRAQ技術并結合液相質譜分析健康和乳房炎乳腺組織在炎癥反應后期的蛋白表達情況，通過該研究揭示與宿主組織損傷的有關機制[9]。使用大腸桿菌內毒素(LPS)處理乳腺組織導致乳腺快速炎癥來作為模型研究奶牛乳房的炎癥反應[6]。但從乳腺的結構來看，乳腺上皮細胞是乳腺防御病原菌入侵的第一道防線，所以本研究是通過LPS處理乳腺上皮細胞后觀察其蛋白質表達譜的變化，從而從細胞水平揭示大腸桿菌引發乳腺炎后期對乳蛋白及乳脂肪合成的影響機制。

LPS處理乳腺上皮細胞后，引起了細胞的炎癥反應。從GO分析中可以看出，LPS激活了與炎癥相關的8條生物學過程，且其中炎性反應過程2條，防御反應過程1條，其余5條均與免疫反應相關。所以本研究中10 μg·mL-1的脂多糖處理組可引發乳腺上皮細胞的炎癥反應[7]。在奶牛乳腺組織分泌的乳汁中，常見的酪蛋白4 種分別為αs、β、κ 和 γ，其中αs酪蛋白占總酪蛋白的40%以上，β-酪蛋白占總酪蛋白的25%，κ-酪蛋白占總酪蛋白的9%，γ-酪蛋白占總酪蛋白的1%[10]。本研究質譜結果表明，其中αs1-酪蛋白(0.74倍)、κ-酪蛋白(0.47倍)和β-酪蛋白(0.8倍)表達水平降低，而αs2-酪蛋白(1.0倍)表達水平無顯著變化，通過蛋白印跡和ELISA也對結果加以驗證。S.Schmitz等對奶牛乳腺組織LPS處理后9 h后，發現αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白和β-酪蛋白基因 mRNA表達水平下降，但差異不顯著，而κ-酪蛋白基因mRNA表達顯著下降(P<0.05)[6]。本研究結果與上述研究結果不完全一致，這可能是由于LPS直接處理乳腺上皮細胞對上皮細胞作用更直接的緣故導致。

LPS 可通過調控乳腺組織中乳脂肪合成的關鍵酶，如脂肪酸合成酶和乙酰輔酶羧化酶等[11]，下調脂蛋白脂肪酶的活性[12]。誘導反芻動物發生瘤胃酸中毒，發現釋放的LPS改變了乳脂肪的生產和能量的利用效率[13-14]。本研究發現經LPS處理后，乳腺上皮細胞脂肪酸合成關鍵酶脂肪酸合成酶(FASN)蛋白表達水平下降。另外在脂肪酸的攝取轉運過程中，其中主要是脂肪酸轉位酶(CD36)和質膜蛋白脂肪酸結合蛋白(FABP)來調控[15]。本研究質譜的結果表明脂肪酸轉位酶(CD36)和質膜蛋白脂肪酸結合蛋白5(FABP5)表達水平均下降，分別為0.74倍和0.58倍。綜上表明，LPS不僅影響脂肪酸的合成，而且對脂肪酸的攝取和轉運過程產生影響。這與GO分析得出的差異基因參與合成和代謝的生物學過程結果相一致。

本研究在篩選了與乳蛋白和乳脂肪相關的基因后，以目標基因為中心進一步對相互作用蛋白質組進行PPI(Protein-Protein Interaction)預測，從而找出這些基因之間的互作關系網絡。從本研究的互作關系圖來看，所選的5個與乳脂肪和乳蛋白相關的目標蛋白質中，只有兩個CD36和FASN有直接的互作關系，而其他3個蛋白間無直接的互作關系(CSN3、LTF和EIF4E)，但EIF4E的連接度(Degree)和壓力向心性最高。由于EIF4E是mTOR信號通路中重要的翻譯起始因子，其磷酸化水平決定該通路介導的蛋白合成過程，故可以對該基因做進一步研究[16]。

4　結　論

本研究結果表明，LPS誘導的炎癥反應可影響乳腺上皮細胞的乳蛋白和乳脂肪的合成。與脂肪轉運和合成相關的CD36和FASN蛋白之間有直接的互作關系，而且EIF4E是mTOR信號通路介導的蛋白合成過程中重要的翻譯起始因子，其與多種蛋白具有互作關系。本研究為乳腺炎影響乳腺分泌的機制提供了新的證據。

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(編輯程金華)

Analysis of Expression Protein Profiles of Bovine Mammary Epithelial Cell Based on Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantification Proteomics and Bioinformatics Technique

LI Lian，TANG Juan，WU Jie，WANG Gen-lin*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China)

The aim of the present study was to screen differential expression proteins associated with inflammatory model of bovine mammary epithelial cells (BMECs) induced by lipopolysaccharide (LPS) using isobaric tags for relative and absolute quantification (iTRAQ) combined with 2-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry (2D-LC-MS/MS).Normal and LPS-treated bovine mammary epithelial cells were analyzed using iTRAQ combined with 2D-LC-MS/MS.Bioinformatics analyses of differentially expressed proteins were performed by means of Gene Ontology and PPI (Protein protein interaction)analysis.According to iTRAQ results，a total of 2 487 proteins were identified.Compared with normal BMECs，163 proteins were significantly up-regulated while 178 proteins were significantly down-regulated in response to LPS treatment.The bioinformatics analyses highlighted the effects of LPS treatment on milk proteins and fat synthesis such as αs1-casein，κ-casein and fatty acid synthase.Down-regulation of αs1-casein (CSN1S1) in BMECs was confirmed by Western blotting；αs1-casein，κ-casein (CSN3) and fatty acid synthase (FASN) in culture medium were confirmed by ELISA.The results showed that LPS treatment significantly decreased the expression of αs1-casein in BMECs (P<0.05)，and also decreased the concentration of αs1-caseins，κ-casein and fatty acid synthase in culture medium (P<0.05).In conclusion，LPS treatment could affect the synthesis of protein and fat in BMECs.

bovine；mammary epithelial cell；iTRAQ technique；proteomics；LPS

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.09.014

2016-04-18

國家自然科學基金(31372290)；中央高校基本科研業務費專項資金(KJQN201607)

李蓮(1979-)，女，內蒙古人，講師，碩士，主要從事奶牛以及動物生殖生理方面的研究，E-mail：lilian@njau.edu.cn

王根林，教授，主要從事動物生殖生理及調控研究，E-mail：glwang@njau.edu.cn

S823.2

A

0366-6964(2016)09-1853-08