重組質(zhì)粒pEGFP-C3-HCVc的構(gòu)建及在RBE細(xì)胞中的表達(dá)

曾　兵　蔡燦鋒　辛海洋　周泉波　周佳佳　程　帝　曾　軍　唐超明

1　廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院普外科(清遠(yuǎn) 511518) 2　中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院膽胰外科(廣州 510120)

Zeng Bing, Cai Canfeng, Xin Haiyang, et al.

Department of General Surgery, The sixth affiliated hospital of Guangzhou Medical University, Qinyuan 511518, China

Zeng Bing, Zhou Quanbo, Zhou Jiajia, et al.

Department of pancreatobiliary Surgery, Sun Yat-sen Memorial Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510120, China

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重組質(zhì)粒pEGFP-C3-HCVc的構(gòu)建及在RBE細(xì)胞中的表達(dá)

曾兵1，2蔡燦鋒1辛海洋1周泉波2周佳佳2程帝2曾軍1唐超明1

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院普外科(清遠(yuǎn) 511518) 2中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院膽胰外科(廣州 510120)

目的構(gòu)建重組pEGFP-C3-HCVc真核表達(dá)載體，并建立穩(wěn)定表達(dá)HCVc基因的肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞株RBE-core。方法采用PCR釣取目的基因HCVc，并克隆入pEGFP-C3的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建pEGFP-C3-HCVc重組質(zhì)粒。經(jīng)過(guò)雙酶切及測(cè)序驗(yàn)證后，采用脂質(zhì)體將pEGFP-C3-HCVc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到RBE細(xì)胞中，經(jīng)2周G418 (200 μg/mL) 篩選后進(jìn)行單克隆挑選及擴(kuò)大培養(yǎng)，建立穩(wěn)定表達(dá)HCVc的膽管癌細(xì)胞株RBE-core。采用RT-PCR和Western blot驗(yàn)證HCVc在RBE-core中的表達(dá)情況。結(jié)果PCR成功釣取HCVc基因，大小約573 bp，并插入pEGFP-C3載體HindⅢ和BamHⅠ多克隆位點(diǎn)；雙酶切及測(cè)序證實(shí)目的基因HCVc正確連接到pEGFP-C3的多克隆位點(diǎn)。RT-PCR和Western blot分別在573 bp處和34 KD左右檢測(cè)到相應(yīng)的陽(yáng)性條帶。結(jié)論成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-C3-HCVc，并在膽管癌細(xì)胞RBE中獲得穩(wěn)定表達(dá)。

HCVc肝內(nèi)膽管癌RBE

ZengBing,CaiCanfeng,XinHaiyang,etal.

DepartmentofGeneralSurgery,ThesixthaffiliatedhospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Qinyuan511518,China

ZengBing,ZhouQuanbo,ZhouJiajia,etal.

DepartmentofpancreatobiliarySurgery,SunYat-senMemorialHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China

慢性丙型肝炎病毒感染是HCV相關(guān)肝臟腫瘤發(fā)生的重要病因之一[1-2]。丙型肝炎病毒核心蛋白(Hepatitis C virus core protein, HCVc)作為HCV基因組編碼的結(jié)構(gòu)蛋白之一，在有關(guān)HCV眾多研究領(lǐng)域中受到廣泛的關(guān)注[3-5]。本研究旨在構(gòu)建HCVc真核表達(dá)載體，并在RBE細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，為探討HCV 致癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制以及藥物的開發(fā)和臨床應(yīng)用等提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料HCV陽(yáng)性血清取自中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院丙型肝炎患者，血清分離后保存于-80℃?zhèn)溆谩！?br>