SgP5CS基因克隆和生物信息學分析

金杭霞，董德坤，王　偉，楊清華，朱丹華，*

(1.浙江省農業科學院 作物與核技術利用研究所，浙江 杭州 310021；2.蕭山區種子管理站，浙江 杭州 311201)

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SgP5CS基因克隆和生物信息學分析

金杭霞1，董德坤1，王偉2，楊清華1，朱丹華1，*

(1.浙江省農業科學院 作物與核技術利用研究所，浙江 杭州 310021；2.蕭山區種子管理站，浙江 杭州 311201)

利用同源克隆的方法，獲得了堿蓬P5CS基因全長ORF，命名為SgP5CS。SgP5CS ORF全長2 151 bp，生物信息學軟件預測其編碼716個氨基酸組成的多肽，相對分子量為77 431.8 u，等電點為5.71，為穩定的親水性蛋白，無跨膜結構域。ClustalX多重序列比對發現SgP5CS編碼的氨基酸序列與鹽角草P5CS相似性為93%，與鹽角草P5CS的親緣關系最近，其次是甜菜。脯氨酸是生物體內重要的滲透調節劑，而Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶則是植物合成脯氨酸的關鍵酶之一，SgP5CS的克隆將為進一步的功能分析鑒定基礎。

堿蓬；P5CS；脯氨酸

脯氨酸在植物體內起重要作用，不僅作為一種氨基酸構成了蛋白結構，還能以滲透調節劑身份起到維持細胞內水分、穩定亞細胞結構等作用。在植物體中，目前已知的脯氨酸合成途徑有谷氨酸和鳥氨酸兩條途徑，而在植物遭受逆境環境時，谷氨酸途徑是脯氨酸合成的主要途徑[1-2]。Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS，EC 2.7.2.11/ 1.2.1.41)是谷氨酸合成途徑中的限速酶，當植物受到脅迫誘導時，P5CS的反饋調節在控制植物脯氨酸的水平中起著重要作用[3-4]。目前已從煙草[5]、羊草[6]、桑樹[7]、苜蓿[8]、苧麻[9]、高粱[10]等多種植物中克隆到編碼該酶的基因，并且在擬南芥[11]、苜蓿[12]、小麥[13]、煙草[5]等植物中發現，過量表達P5CS基因能提高轉基因植物體內脯氨酸含量，進而提高植物抗旱耐鹽性能。堿蓬是一種能生長于海邊灘涂的鹽生植物，是研究植物耐鹽機制、挖掘耐鹽抗旱基因極好的材料。本研究利用同源克隆方法首次從堿蓬中獲得了SgP5CS基因的完整ORF序列，并對該基因進行了生物信息分析，這將為后期該基因的功能驗證奠定基礎，有利于更清晰地認識P5CS基因功能和調控機制，最終為植物基因工程提供有效耐逆基因。

1　材料與方法

1.1材料與處理

堿蓬植株收集于浙江慈溪沿海灘涂，Hoagland營養液水培至植株高為20 cm左右時，采用200 mmol·L-1氯化鈉(NaCl)處理1 d。

1.2方法

1.2.1堿蓬總RNA提取

采集200 mmol·L-1氯化鈉(NaCl)處理1 d后的堿蓬嫩葉，采用Trizol(Solomon Biotechnology)法[14]提取總RNA，-70℃保存。

1.2.2堿蓬P5CS ORF全長序列的克隆

GenBank 數據庫查找已發表的擬南芥等物種的Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶序列，Clustalw2多序列比對后設計包含完整ORF的簡并引物SgP5CS-F和SgP5CS-R(表1)。反轉錄試劑盒(TOYOBO公司)對總RNA進行反轉錄，合成cDNA第一條鏈。Pfu酶(TRANSGEN BIOTECH公司)進行PCR 擴增。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶并割膠回收，AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，回收目的片段連接到pEASY-Blunt載體(TRANSGEN BIOTECH公司)上。連接產物轉化大腸埃希菌 DH5α感受態細胞，IPTG和X-gal藍白斑篩選，挑取白斑接種于5 mL LB(含 50 μg·mL-1氨芐青霉素)培養基中，37℃，200 r·min-1振蕩培養過夜。PCR檢測陽性克隆送至上海英駿公司測序。

表1堿蓬P5CS克隆所用引物序列

Table 1Primer sequences used in gene cloning of Suaeda glauca P5CS gene

引物名稱引物序列(5'→3')作用SgP5CS-FATGGACGCKWCTAGAGYYTTCGTcDNA全長克隆SgP5CS-RAGGCAGCGGGAGAGAGGACAAGAAcDNA全長克隆

1.2.3堿蓬P5CS的生物信息學分析

利用NCBI的ORF Finder在線工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找 P5CS的開放式閱讀框，并翻譯成氨基酸。在NCBI網站上進行BLASTp同源性分析；用ClustalX2 進行氨基酸序列的多重比對分析，用MEGA5軟件構建系統進化樹。Expasy軟件包中的 ProtParam 工具(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質的基本理化性質；TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預測跨膜結構域；CFSSP(http://cho-fas.sourceforge.net/index.php#)預測蛋白質二級結構;SWISS-MODEL工具(http://swissmodel.expasy.org/)同源建模蛋白質三級結構。

2　結果與分析

2.1堿蓬P5CS完整ORF的擴增

簡并引物PCR 擴增產物的電泳結果顯示(圖1) ，在大約2 100 bp 位置有一條清晰的條帶，與預計目的條帶大小相符，經測序獲得2 151 bp的核苷酸序列，BLAST對比其他植物P5CS基因序列相似度較高，ORF Finder軟件確定其為完整ORF。堿基序列翻譯后與鹽角草、甜菜、雷蒙德氏棉等P5CS蛋白的氨基酸相似性達到80%以上，且氨基酸數量相同，確定克隆到的為堿蓬P5CS基因的完整ORF。

1:DNA Marker； 2:SgP5CS 基因cDNA擴增產物。圖1　SgP5CS PCR產物凝膠電泳圖Fig.1　Electrophoresis of PCR amplification products of SgP5CS

2.2堿蓬P5CS基因編碼產物的相似性和進化樹分析

將堿蓬P5CS和鹽角草、甜菜、葡萄和可可樹氨基酸相似性達到79%以上的植物的P5CS蛋白進行相似性比對(圖2)，結果表明：在氨基酸水平上堿蓬P5CS與藜科植物鹽角草高度相似，相似性達到93%，與其他植物的相似性也很高(79%～82%)。

用MEGA 5軟件構建氨基酸序列的系統進化樹，從中可以發現，在氨基酸水平上，堿蓬P5CS與鹽角草P5CS的親緣關系最近，其次是甜菜，而與水稻、棉花等關系較遠(圖3)，這與植物分類學上的親緣關系一致，堿蓬與鹽角草、甜菜同屬藜科植物。

2.3堿蓬P5CS基因編碼蛋白質的結構與功能預測

NCBI的ORF Finder分析堿蓬P5CS基因的ORF序列發現其編碼716個氨基酸，ProtParam軟件預測其分子式為 C3407H5561N959O1046S23，原子總數為10 996，相對分子量為77 431.8 u，等電點為5.71，不穩定系數為35.36。因此，該蛋白分類為穩定蛋白。脂肪系數104.61，親水性評估為-0.044，依據氨基酸分值越低親水性越強的規律，該蛋白應為親水性蛋白。

圖2　堿蓬P5CS氨基酸序列與其他物種氨基酸序列的多重序列比對Fig.2　Multialignment of amino acid sequences of SgP5CS and other P5CSs

圖3　堿蓬SgP5CS蛋白的進化樹Fig.3　Phylogenetic tree of the SgP5CS of Suaeda glauca

堿蓬SgP5CS三級結構的預測結果如圖4所示。TMHMM軟件檢索發現SgP5CS蛋白無跨膜結構域，意味著SgP5CS不是跨膜蛋白。通過CFSSP在線工具預測蛋白二級結構顯示，SgP5CS編碼的氨基酸殘基有 80.3%構成α-螺旋，33.8%構成β-折疊 ，12.8%構成無規則卷曲。

圖4　堿蓬P5CS的三級結構Fig.4　Three-dimensional constitution of the P5CS of Suaeda glauca

3　討論

脯氨酸是植物對抗逆境時有效的滲透調節劑，因此P5CS酶作為脯氨酸合成的關鍵酶之一，其編碼基因被認為是植物重要的抗逆基因。在植物基因組內插入外源P5CS基因能提高植物非生物逆境下的抗性。徐博[14]從朝鮮堿茅(Puccinellia chinampoensis)中分離到PuP5CS基因，將其轉化煙草后發現，在受到高鹽和低溫脅迫時，能夠顯著提高轉基因煙草脯氨酸含量，以及葉綠素含量和可溶性糖含量。李鴻雁等[15]在羽衣甘藍中過表達擬南芥AtP5CS1基因，明顯改善了轉基因植株的耐旱性。張霞等[16]在煙草中過表達OsP5CS基因，顯著增加了轉基因煙草脯氨酸含量及其非生物脅迫抗性。Zheng等[5]將AtP5CS和NtP5CS基因在大腸埃希菌中過來表達，均能提高大腸埃希菌對高鹽、堿性、干旱、高溫與冷害環境下的抗性。Chen等[17]將菜豆PvP5CS1和PvP5CS2基因分別轉入擬南芥中，在鹽脅迫下，轉基因植株比野生型積累更多的脯氨酸，并表現出更強的耐鹽性。Verdoy等[12]將豇豆的P5CS基因轉入苜蓿基因組中，發現轉基因植株組織中脯氨酸含量明顯，轉基因植株的抗旱性顯著優于非轉基因植株。目前已發表的文獻表明，已克隆的P5CS基因在多種植物中都能發揮其增強植物非生物抗性的作用。這些研究結果將為轉P5CS基因的抗旱耐鹽植物真正運用于大田生產奠定堅實的基礎。

本試驗克隆了堿蓬P5CS酶的編碼基因ORF片段，并獲得了SgP5CS基因的重要的生物學信息。在今后的研究工作中，將通過對轉基因擬南芥進行耐鹽抗旱的生理生化分析，為進一步研究SgP5CS基因功能和作用機制，以及能否應用于改良高等植物的耐鹽性方面提供理論依據。

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(責任編輯張韻)

Molecular cloning and bioinformatics analysis ofSgP5CS gene in Suaeda glauca

JIN Hang-xia1，DONG De-kun1，WANG Wei2，YANG Qing-hua1，ZHU Dan-hua1，*

(1.Institute of Crops and Nuclear Technology Utilization，Zhejiang Academy of Agricultural Science，Hangzhou 310021，China；2.Seed Management Station of Xiaoshan District，Hangzhou 311201，China)

A new gene，named asSgP5CS，was cloned by homologous cloning method from Suaeda glauca.Bioinformatics analysis showed that the open reading frame ofSgP5CS gene was 2 151 bp，encoding 716 amino acids.The isoelectric point and the relative molecular weight of coded protein were 5.71 and 77 431.8 u，respectively.Hydrophobic analysis indicated thatSgP5CS was a hydrophilic protein and had no transmembrane domain.Nucleotide sequence Blast by ClustalX indicated that the coded protein ofSgP5CS shared an identity of 93% with P5CS of Salicornia europaea.Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS) is a key enzyme in the synthesis of proline which is one of the important osmotic regulators in plants.Our research laid a foundation to further study the P5CS function in Suaeda glauca.

Suaeda glauca；P5CS；proline

浙江農業學報Acta Agriculturae Zhejiangensis，2016，28(3):395-399http://www.zjnyxb.cn

金杭霞，董德坤，王偉，等.SgP5CS基因克隆和生物信息學分析[J].浙江農業學報，2016，28(3)： 395-399.

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.03.06

2015-06-29

中國博士后科學基金面上項目 (2014M551772)；國家轉基因生物新品種培育重大專項 (2014ZX0800403B)

金杭霞(1983—)，女，浙江杭州人，博士研究生，助理研究員，從事基因功能研究。E-mail：jinhangxia@126.com

，朱丹華，E-mail：dhzhu@mail.zaas.ac.cn

Q943.2

A

1004-1524(2016)03-0395-05