烏魯木齊10號泉水體細菌群落的映震分析

陳 張，林 青，唐 鳳，胡 蓉，殷亞蘭，高 雁

(1.新疆師范大學生命科學學院，烏魯木齊　830054；2. 新疆農業科學院微生物應用研究所，烏魯木齊　830091)

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烏魯木齊10號泉水體細菌群落的映震分析

陳 張1,2，林 青2，唐 鳳2，胡 蓉2，殷亞蘭2，高 雁2

(1.新疆師范大學生命科學學院，烏魯木齊830054；2. 新疆農業科學院微生物應用研究所，烏魯木齊830091)

【目的】對烏魯木齊10號泉定期采樣，并監測水體中細菌總DNA含量變化，結合水文地球化學數據，探究細菌群落與地震的關系。【方法】采用克隆子轉化法，制作檢測10號泉水體細菌總DNA含量變化的絕對定量PCR標準曲線，采用實時熒光定量PCR技術進行精確定量、定性地監測烏魯木齊10號泉水體細菌總DNA含量的變化。【結果】烏魯木齊10號泉水體細菌總DNA含量的標準曲線為Cp= -3.262 4 LgC+25.075，相關系數為r= 0.999 8；監測期內10號泉水體細菌群落密度與CO2呈顯著正相關，與HCO3-呈顯著負相關。【結論】烏魯木齊10號泉水體細菌總DNA含量與地震的發生確實存在一定的響應規律：泉水細菌總DNA含量變化基本符合震前高于震后，且隨震級的增加其最大恢復值也隨之而遞增；此外，在地震發生后的5～17 d內，泉水體細菌總DNA含量變化出現極大值；烏魯木齊10號泉水體細菌群落與該泉水文地球化學因子HCO3-與CO2的含量變化關聯緊密，可作為后期重點觀測研究對象；10號泉水體細菌總DNA含量變化規律可作為地震預測的參考因素之一。

烏魯木齊10號泉；地震；實時熒光定量PCR；細菌總DNA含量；水文地球化學

0　引 言

【研究意義】地震災害是主要自然災害之一，其孕育過程十分復雜，其形成機制也是多種多樣的。有研究表明地震來臨前，一些動物會產生異常反應[1]，然而，基于斷裂帶上泉水中的微生物與地震的關系未見報道。生物圈中的微生物占整個原核生物的6%～40%[2,3]，是整個生態系統的主要生命力[4]，地震發生前，地球內部流體由于板塊遷移會隨板塊裂縫排出，釋放出大量的地球化學物質及元素，處于地震斷裂帶上泉水中的微生物群體會對其生存的環境做出靈敏地反應[5]。研究選取的10號冷泉位于烏魯木齊南部柳樹溝-紅雁池斷裂帶，該泉常年水溫變化甚微，且流徑相對封閉，幾乎不受外界干擾[6]，為此次實驗研究水體細菌群落密度與水文地球化學和地震之間的關系提供理想條件。【前人研究進展】目前，對于泉水中的微生物群落的變化與地震的響應關系的研究，國內外報道較少，且大多數集中于環境水體的微生物對于某些化學元素關系的研究，例如Mostafa S. Elshahed等[7]研究了含硫泉水中細菌群落的多樣性；J.P.Toutain 和Franck Poitrasson等[8]發現在一次里氏5.2的地震前后，泉水中的氯離子含量以及鉛濃度均發生突升驟降。國內對于冷泉水的研究多集中于地下流體對于地震的響應模式[9]，采用T-RFLP技術[10]檢測了10號泉水體細菌在時間尺度上的動態變化及其對地球化學元素的響應，發現細菌類群表現為隨機性動態變化。【本研究切入點】以上檢測手段耗時較長，無法快速、精確檢測泉水中細菌群落的變化。實驗采用實時熒光定量PCR技術，操作簡便、快速，能精確定性、定量樣本，為實驗提供準確、可靠的實驗數據[11]，該技術常見于醫學檢驗等研究[12]，運用于微生物的環境群落分析較為罕見。通過檢測泉水細菌群落密度，探究其與水文地球化學的關系，進而分析10號泉水體細菌群落的映震特征。【擬解決的關鍵問題】采用熒光定量PCR分子生物學技術，分析10號泉水體細菌總DNA含量變化與地震發生的相關性，探究該泉水中細菌群落與地震的響應關系。

1　材料與方法

1.1材 料

1.1.1儀器

實時熒光定量PCR儀：LightCyclerR480Ⅱ 羅氏公司。

1.1.2相關主要試劑

T-載體PCR產物克隆試劑盒 (Sangon)；SYBR Green I Master熒光染料試劑盒(Roche)。

1.1.3樣品采集

自2014年9月23日～2015年3月31日期間，每5 d從烏魯木齊10號泉站點采集泉水樣品。測定HS-、Ar、Rn、HCO3-、F-、CO2、N2、Hg、流量、室壓，共10項理化指標。表1

1.2方 法

1.2.1檢測期內地震發生情況

表1地震發生時刻記錄
Table 1 Records of earthquake occurrence

時間(北京時間)Time(BeiJing)震級Earthquakemagnitude緯度Latitude經度Longitude深度Depth/km震源Seismiccentre2015/03/1811:13Ms343.8°N86.4°E11.5昌吉回族自治州呼圖壁縣2015/03/1307:41Ms343.8°N87.9°E10.0烏魯木齊市米東區2015/02/0116:06Ms3.243.9°N88.2°E2.0昌吉回族自治州阜康市2014/12/2816:46Ms344.3°N87.5°E2.9五家渠市2014/12/0200:10Ms2.943.3°N87.8°E2.4烏魯木齊市烏魯木齊縣2014/10/2011:57Ms4.543.9°N88.5°E4.3昌吉回族自治州阜康市

1.2.2泉水細菌總DNA的提取、標準曲線的制備及樣本RT-qPCR檢測1.2.2.1 泉水細菌總DNA 的提取

泉水細菌總DNA的提取主要參照Shaheen等[13]的方法，稍作改動。

1.2.2 2 標準曲線的制備

隨機選取無震時期的樣品2015-1-1為標準樣品制作材料，采用細菌通用引物338f (5’- ACTCCTACGGGAGGCAG -3’)和518r(5’- ATTACCGCGGCTGCTGG -3’)擴增細菌保守區，將PCR產物用瓊脂糖凝膠試劑盒回收，取其中10 μL測序；取10 μL進行克隆子轉化，用質粒試劑盒提取轉化克隆子的質粒，并將其稀釋為10-1，10-2，10-3，10-4，10-5共5個不同濃度梯度的標準品。

1.2.2.3樣本Real-Time PCR檢測

將泉水樣本進行Real- Time PCR檢測，每個樣本做3組平行，Real- Time PCR檢測體系為20 μL，反應程序為：預變性95℃，5min；擴增步驟：變性94℃，20 s；退火60℃，45 s；延伸72℃，1 min；35個循環，在延伸步驟時收集熒光信號。溶解曲線溫度設置在65～95℃，每0.11℃讀數，其間停留5 s。最后反應程序冷卻至40℃。Real-Time PCR檢測體系控制軟件采用LightCyclerR480Ⅱ Software release1.5.0 (Version1.5.0.39) 。

2　結果與分析

2.1 標準樣品的測序結果

經篩選，確定將細菌16 S rDNA序列的A-6號克隆子作為制作標準曲線的標準樣品，其16 S rDNA片段序列長度為180 bp。該序列與NCBI 數據庫中Sulfurospirillum barnesii SES-3( KM410847 ) 相似性為97% ，屬于10號泉的土著菌屬[14]，可用于實驗制作標準曲線的標準品。

測序結果為：-GGGGTCGTTCATGCGAGGT

AACTCTGATGTAGCACGCCGCGTGGAGGATGAC

ACATCTCGGTGCGTAAACTCCTTTTATTAGGGAAGATAATGACGGTACCTAATGAATAAGC

ACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATAGTCCGTG-

2. 2 Real-Time PCR 標準樣品與樣本測定結果及可信度

2.2.1Real-Time PCR 標準曲線的制備

分別以10 倍濃度梯度的標準樣品中DNA 模板濃度與Cp值為橫縱坐標繪制標準曲線。為保證樣本定量有穩定可重復的試驗結果，標準曲線參數需滿足以下特點：一致的重復反應、高的線性和高的擴增效率及斜率[15]。該標準曲線擴增效率E=2.038，r= 0.999 8，S= -3.262 4，且重復性好，說明以此標準樣品構建的標準曲線是合格的。圖1

圖1Real-Time PCR標準曲線
Fig. 1 Real-Time PCR standard curve

2.2.2Real-Time PCR 溶解曲線

以10 倍濃度梯度的標準樣品PCR 過程中溶解溫度(84℃)的測定值做溶解曲線，結果表明，可見單一峰值且無雜峰，表明擴增片段長度一致。圖2

圖2Real-time PCR 溶解曲線
Fig. 2 Real-time PCR melting curve

2.2.3Real-Time PCR 樣本檢測結果

樣本Real-Time PCR 擴增曲線顯示，每一組樣本的擴增曲線均勻而平滑，且每個平行樣本間所測的Cp值之差均在要求范圍之內，表明樣本的擴增曲線平行關系良好，說明實驗數據可信度較高[16]。試驗檢測經過35個循環后樣品均到達平臺期，擴增效果較好，在第15個循環時進入熒光PCR指數擴增階段，在此階段，PCR 產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，實驗一般選擇在這個階段進行定量分析。圖3

圖3Real-time PCR 擴增曲線
Fig.3 Real-time PCR amplification curve

2.310號泉水文地球化學變化趨勢

每日測定泉水10項理化性質，測量數據導入基于GIS的地震分析預報系統(Mapsis 2.8.5)繪制理化參數波動折線圖，結果表明，檢測期內，HS-、N2、流量的變化出現了顯著高于其背景值的情況，但與地震發生時刻無響應關系，其他指標均在其背景值內波動。圖4

2.410號泉水體細菌總DNA含量變化

經實時熒光定量PCR檢測體系，系統自動生成檢測結果，數據導入Excel 2010中可得對應細菌總DNA含量變化趨勢，可知該泉水細菌總DNA含量變化基本符合震前高于震后的規律，只有2015年3月13日樣品震前低于震后；此外，2014年12月2日、2015年2月1日三次地震隨著震級依次遞增，DNA含量的極大值也隨之而依次遞增。且在地震發生后的5～17 d內，泉水細菌總DNA含量變化出現極大值。圖5

圖4檢測期內泉水10項水文地球化學變化
Fig.4 Hydrogen chemical changes in monitoring period of the No.10 spring

2. 5泉水細菌總DNA含量與水文地球化學的相關性

采用 SPSS19.0 對試驗所得泉水細菌總DNA含量與10項水文地球化學結果做相關性分析，分析結果表明，泉水細菌總DNA含量與泉水中溶解CO2氣體存在顯著正相關性，而與HCO3-存在顯著負相關性，顯著相關性P< 0.05。表 2

注：圖中虛線處表示地震發生時刻

Note：The dotted tine in the figure represents the earthquake occurrence time

圖5檢測期內10號泉水細菌總DNA含量變化
Fig.5 DNA concentration of bacteria changes in monitoring period of the No.10 spring
表 2泉水細菌總DNA含量與水文化學相關性
Table 2The correlation analysis between No.10 spring bacteria total DNA concentration and hydrochemistry

F-HCO3-HS-HgRnArN2CO2泉水細菌總DNA濃度Pearson相關性-0.298-0.376*-0.1100.251-0.1150.0210.0290.358*ThetotalDNAconcentration顯著性(雙側)0.0650.0180.5050.1240.4860.9010.8590.025

注：*. 在0.05水平(雙側)上顯著相關

Note：*. Significant correlation at 0.05 levels (bilateral)

3　討 論

有研究表明，微生物對環境變化做出生物應答與生物防御的反應十分敏銳，地震所引起的如地下流體、地磁、電離輻射、射線波、地震波等理化因子的環境變化會引起某些對地震敏感的微生物種群急劇變化，而這些敏感微生物可能會比對地震前兆反應敏感的動物更敏感，這也就是說在地震帶存在著對地震很敏感的天然敏感菌[17]。項目組對10號泉水體微生物與地震關系的監測持續多年，項目組成員張強等[18]于2010年12月至2011年4月，研究10號泉泉水細菌群落對有感地震的響應時發現部分細菌群落在地震后的豐富度均高于地震前，且都高于無地震時期; 羅嬌等[19]在2012年1月至2012年12月的研究表明有感地震發生后可培養細菌菌落數目高于震前。楊紅梅等[20]研究發現地震前可培養細菌菌落數目顯著高于地震后；誘導泉水微生物系統中細菌群落變化的因素諸多，泉水中細菌群落為了應對由地震帶來的環境改變會采取不同的生存策略，從而適應變化的環境。研究繼張強、羅嬌等持續監測，參考以往研究的結果及結論發現，除2015年3月13日，其余5次地震泉水細菌總DNA含量均為震前高于震后，且在地震發生后的5～17 d內，泉水細菌總DNA含量變化出現極大值；這說明該泉水中微生物對地震帶來的環境改變會做出適應性的應答反應。研究還發現在2014年12月2日、2015年2月1日三次地震的震級依次遞增，細菌總DNA含量的極大值也隨之依次遞增。

泉水細菌總DNA含量與CO2有顯著的正相關性，分析其原因可能是泉水中的一些水文地球化學元素能夠作為電子受體(CO2)和電子供體(H2,CH4)為自養和異養微生物的代謝提供能量[21]，例如在自然界中有些細菌能以CO2為碳源，將CO2合成有機物儲藏備用，這種代謝方式在碳循環的生物地球化學代謝中起了重要作用[22]，這與前人所研究的該泉水中古菌群落的豐度值與CO2含量呈現正相關性相吻合。朱成英等[23]的研究顯示來自深、淺源的溶解氣體CO2多表現為趨勢性高值中短期異常，在恢復背景值的過程中有地震發生，即水中溶解的CO2含量變化可對地震做短期預測。泉水細菌總DNA含量與HCO3-有顯著的負相關性，分析其原因可能為CO2在水中溶解，根據化學電離平衡方程可知，若CO2含量增加，HCO3-離子的含量就會減少，故就會呈現顯著負相關性。

4　結 論

烏魯木齊10號泉水體細菌總DNA含量與地震的發生確實存在一定的響應規律：泉水細菌總DNA含量變化基本符合震前高于震后，且隨震級的增加其最大恢復值也隨之而遞增；此外，在地震發生后的5～17 d內，泉水體細菌總DNA含量變化出現極大值。

烏魯木齊10號泉水體細菌群落與該泉水文地球化學因子HCO3-與CO2的含量變化關聯緊密，可作為后期重點觀測研究對象。

烏魯木齊10號泉水體細菌總DNA含量變化規律可作為地震預測的參考因素之一。

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Fund project:Supported by Hi-tech development project of Xinjiang Uygur Autonomous Region(201216145)

Analysis of the Seismic Response of Bacterial Community in Urumqi No. 10 Spring

CHEN Zhang1, 2, LIN Qing2, TANG Feng2, HU Rong2, YIN Ya-lan2, GAO Yan2

(1.CollegeofLifeScience,XinjiangNormalUniversity,Urumqi830054,China; 2.ResearchInstituteofAppliedMicrobiology,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi, 830091,China)

【Objective】 To sample No.10 spring water in Urumqi regularly, monitore the changes of total DNA concentration, and combine them with hydro geological data to explore the relationship between bacterial communities and earthquakes.【Method】Transformation clone method was used to establish the standard curve of absolute quantitative PCR. The density of bacterial communities in No.10 spring water was monitored by real-time fluorescence quantitative PCR.【Result】 The standard curve wasCp=-3.262 4LgC+25.075, Correlation coefficient wasr= 0.999，8; The density of bacterial community of No.10 spring in the monitoring period had a significant positive correlation with CO2, and a significant negative correlation with HCO3-.【Conclusion】 It is true that bacterial communities of the No.10 spring in Urumqi were sensitive to the seismic response. The total DNA concentration and the earthquake had a certain response: The change of total DNA concentration of No.10 spring was higher than that of the post earthquake, and the maximum recovery value increased with the increase of magnitude; The total DNA concentration of the spring water in the 5-17 days after the earthquake occurred, which had a great value, and this change is closely associated with hydrogen chemical factor HCO3-and CO2content change, so it can be used regard as the latter part of the focus of observation and research object. In a word, this might be one of the reference factors for earthquake prediction.

No.10 Spring in Urumqi; earthquake; real-time fluorescence quantitative PCR; bacterial community density; hydro geochemical

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.04.019

2015-12-07

新疆維吾爾自治區高新技術發展項目(201216145)

陳張(1989- )，女，新疆人，碩士研究生，研究方向為新疆特色生物分子資源可持續性應用，(E-mail) zihanchenxj@163.com

高雁(1979- )，女，新疆人，副研究員，研究方向為微生物生態學，(E-mail) 47795411@qq.com

S182

A

1001-4330(2016)04-0730-07