BDE-47脅迫對雙齒圍沙蠶抗氧化防御系統的影響

宿麗麗，閻希柱

(集美大學水產學院，福建　廈門　361021)

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BDE-47脅迫對雙齒圍沙蠶抗氧化防御系統的影響

宿麗麗，閻希柱*

(集美大學水產學院，福建廈門361021)

將雙齒圍沙蠶Perinereisaibuhitensis暴露在BDE-47下進行急性毒性試驗，測定 96 h-LC50。在此基礎上，研究了暴露在0、2 、4、8 mg·L-1的BDE-47污染物下，雙齒圍沙蠶的谷胱甘肽(GSH)含量、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活力、超氧化物歧化酶(SOD)活力、過氧化氫酶(CAT)活力以及丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽硫轉移酶(GST)活力的變化情況。結果表明BDE-47對雙齒圍沙蠶的96 h-LC50為31.24 mg·L-1。在暴露期間，與對照組比較，各處理組的GSH含量、GST活力、CAT活力總體上無顯著變化，僅8 mg·L-1組的GST活力在14 d極顯著性升高(P<0.01)。暴露 1 d時，4 mg·L-1處理組 GPx 活力顯著升高(P<0.05)，在第 7～14 d 時，2 mg·L-1處理組的 GPx活性呈上升趨勢； 在暴露1 d時，4 mg·L-1、8 mg·L-1兩組的SOD活力顯著下降(P<0.05)，整體上看，在1～7 d時，SOD活力被誘導升高。14 d時，與對照組的比較，4、8 mg·L-1處理組的SOD活力分別被顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)抑制。在暴露1 d時，MDA含量被誘導升高(P<0.05)，且4 mg·L-1極顯著升高(P<0.01)。在暴露4～14 d MDA含量總體上無明顯變化，僅第7 d的8 mg·L-1處理組顯著升高(P<0.05)。結論：在雙齒圍沙蠶抗氧化防御系統中，MDA含量和SOD活力均在脅迫初期有顯著變化，因此MDA含量和SOD活力可以作為潛在的生物標志物。

雙齒圍沙蠶；BDE-47；抗氧化酶；GSH；MDA；生物標志物

多溴聯苯醚polybrominateddiphenylethers，PBDEs是一類新型的持久性有機污染物，2009年被正式列入《斯德哥爾摩公約》[1]。PBDEs阻燃效率高，熱穩定性好，常被應用于電力行業家用電器等領域[2]，這些電子產品使用及廢舊電子設備的拆卸處理過程，是PBDEs進入環境的主要途徑[3]。歐壽銘等[4]對廈門地區沉積物進行了監測，發現沉積物中總PBDE最高值為廈門第一碼頭，含量2.06 ng·g-1。PBDEs主要以低溴代聯苯醚的形式大量蓄積在生物體內。2，2′，4，4′-四溴聯苯醚(2，2′，4，4′-tetra-bromodiphenylether，BDE-47)是PBDEs中主要存在的一種低溴代聯苯醚[5]。周明瑩等[6]對青島膠州灣養殖水體中的PBDEs進行了調查，主要檢測出BDE-47、BDE-17、BDE-85、BDE-99等4種，并且BDE-47為主要的污染物，含量達到183.5 pg·L-1。

PBDEs具有親脂性和生物累積等特點[7]，可以通過食物鏈放大，對高營養級的生物造成影響。Verslycke 等[8]檢測出Scheldt 河河口的沉積物中PBDEs的含量為14～22 ng·g-1，棲息在河里的蝦體內PBDEs為1 765～2 962 ng·g-1(脂肪)，PBDEs在魚蝦體內大量的蓄積，含量遠遠超過該地區環境中的含量。當PBDEs的蓄積量達到一定程度時，會引發生物體的生殖發育毒性，甲狀腺毒性，神經毒性，免疫毒性等，對生物造成損害。

雙齒圍沙蠶Perinereisaibuhitensis，屬灘涂生物中的優勢種，喜穴居于風浪平靜、營養豐富的潮間帶泥沙灘，數量多[9-10]，豐富度高，穩定性好，地理分布廣，并且對海洋環境中持久性有機污染物反應敏感，同時具有極強耐受性，具有重要的生態學研究價值[11]。因此常常選用雙齒圍沙蠶來評估灘涂及海洋沉積物的污染情況[8，12-13]。

許超群等[14]用0.25、1.25 、6.25 μg·L-1的BDE- 47對菲律賓蛤仔Ruditapesphilippinarum進行處理，鰓絲和消化盲囊GSH含量分別被顯著誘導和抑制(P<0.05)。徐湘博[15]將赤子愛勝蚓Eiseniafetida暴露于10、50、100、200 mg·kg-1的BDE-47中，在暴露階段，GST活力變化不存在顯著差異(P>0.05)。趙歡等[16]將雙齒圍沙蠶暴露在5 μg·L-1和50 μg·L-1B(a)P中，GPx酶活性與B(a)P質量濃度和暴露時間成正相關(P<0.01)。周科[17]將銅銹環棱螺Bellamyaaeruginosa的肝胰臟暴露在40 ng·g-1、160 ng·g-1和640 ng·g-1BDE-47污染沉積物中，SOD活性和CAT活性有較顯著的變化趨勢。范燦鵬等[18]將雌性劍尾魚Xiphophorushelleri暴露在BDE-47下，MDA含量先下降后逐漸上升。

本研究擬通過測定在BDE-47脅迫下谷胱甘肽硫轉移酶(GST)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)的活力以及谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)的含量在雙齒圍沙蠶體內的變化，根據其含量和活性變化的敏感性，從而為判定這些指標是否可以用作BDE-47污染的生物標志物提供依據。

1　材料與方法

1.1試驗材料

供試雙齒圍沙蠶購于寧德市霞浦縣下土鼻海蜈蚣養殖場，暫養于裝有灘涂沉積物的塑料箱(100 cm×40 cm×10 cm)內5～10 d，箱內沉積物的高度為7～8 cm，期間及時挑出死亡個體。暫養采用過濾的海水，海水鹽度為(30±2)，pH為7～8，溫度為(25.00 ± 0.50)℃，日換水1～2次，投喂廣東海大集團股份有限公司的凡納濱對蝦的1號配合飼料1～2次。在試驗前1 d停止投喂餌料，挑取形態完整、健康活潑、規格相近的沙蠶[體長(5.0±0.5)cm、體重(0.5±0.2)g]進行試驗。

BDE-47購自武漢凱美克化學科技有限公司，純度為98%；DMSO分析純；TP、GPX、GSH、GST、CAT、MDA、SOD試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2試驗方法

采用DMSO分析純作為BDE-47的助溶劑，配制質量濃度為10 mg·L-1的DMSO儲備液，試驗時分別用自然海水稀釋所需的濃度，且各處理組DMSO的體積分數均為0.001% 。

1.2.1急性毒性試驗根據預試驗的處理結果，設置了5、10、20、60、100 mg·L-14個處理組(此濃度由BDE-47直接配制)，另外設置1個空白對照組和DMSO對照組，1個100 mL燒杯中加20 mL BDE-47溶液，放入1條沙蠶，每個處理組設置30條沙蠶。試驗期間不投喂，8:00和20:00各全部更新1次污染物溶液，觀察并記錄24、48、72、96 h沙蠶的死亡個體數。計算96h-LC50和95%置信區間。

1.2.2暴露試驗及抗氧化防御系統測定BDE-47的濃度梯度設置為雙齒圍沙蠶96h-LC50 的 1/4、1/8、1/16，另外設置DMSO 對照組和空白對照組，每個處理組共30條沙蠶，每個燒杯1尾沙蠶，分別在 1、4、7、14 d取樣，各處理組在脅迫14 d后，再進行5 d的凈水恢復(recovery 5，r 5)，于第19 d取樣。 在每個時間節點，從每個處理組之中隨機挑選取3條沙蠶作為3個重復，分別進行測定，每條沙蠶取組織0.2～1.0 g，加入0.86%生理鹽水，生理鹽水的體積總量是組織塊重量的9倍，低溫勻漿。將勻漿液于4℃、2 000 r·min-1條件下離心15 min。取上清液，嚴格按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書進行抗氧化酶抗氧化防御酶系統指標的測定。蛋白含量采用考馬斯亮藍法，以試劑盒蛋白標準液為標準蛋白， 同樣按照試劑盒說明進行測定。

1.3數據統計分析

運用Excel對數據進行初步處理，采用SPSS 19.0 單因素方差分析(ANOVA)對數據進行LSD多重分析。“*”表示處理組與對照組差異顯著(P<0.05)；“**”表示處理組與對照組差異極顯著(P<0.01)。采用Origin 8.0軟件作圖。

2　結果與分析

2.1BDE-47對雙齒圍沙蠶的急性毒性的影響

方差分析結果表明，0.001%的DMSO助溶劑對照組與空白對照組中的雙齒圍沙蠶各指標的響應無顯著差異(P>0.05)，因此，選取助溶劑作為對照組。

雙齒圍沙蠶暴露在BDE-47溶液中，開始時游動緩慢，逐漸會有斷尾的現象，吻部會出現腫脹，后期表皮破裂，蟲體泛白腐爛直至死亡。BDE-47對雙齒圍沙蠶的 96h-LC50為31.24 mg·L-1，95%置信度為 15.73～45.12 mg·L-1。

2.2BDE-47對雙齒圍沙蠶抗氧化酶活性的影響

如圖1所示，在暴露期間GSH含量與對照組比較均無顯著變化。凈水恢復期時，GSH含量反而被誘導顯著升高，2、4 mg·L-1處理組極顯著性升高(P<0.01)，8 mg·L-1組顯著性升高(P<0.05)。

如圖2所示，與對照組比較GST活力總體上沒有顯著變化，僅8 mg·L-1組在14 d極顯著性升高(P<0.01)，凈水恢復期，4 mg·L-1被誘導極顯著性升高(P<0.01)。

如圖3所示，暴露1 d時，4 mg·L-1處理組GPx活力顯著性升高(P<0.05)，2 mg·L-1的GPx活性在脅迫第7～14 d呈上升趨勢(P<0.05)，在凈水恢復階段，2、4 mg·L-1處理組顯著性升高(P<0.05)，8 mg·L-1組極顯著性升高(P<0.01)。

SOD活力隨時間的變化如圖4所示：暴露1 d時，4、8 mg·L-1兩組SOD酶活力顯著性下降(P<0.05)，暴露4 d時，2 mg·L-1處理組，SOD活力繼續下降，而4、8 mg·L-1處理組SOD活力升高至與對照組一致，無顯著變化；暴露7 d時， 8 mg·L-1組活力顯著升高(P<0.05)，而2、4 mg·L-1兩組SOD活力均無顯著性變化。總體上看，在脅迫前期(1～7 d)SOD活力被誘導升高。14 d時， 4 mg·L-1、8 mg·L-1處理組的SOD活力與對照組的比較，分別被顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)地抑制。凈水恢復期，各處理組SOD活力與對照組基本一致，且差異不顯著(P>0.05)。

MDA含量隨時間的變化如圖5所示。暴露1 d時，MDA含量與對照組相比，均被誘導升高(P<0.05)，且4 mg·L-1極顯著升高(P<0.01)。暴露4、7 d時，2 mg·L-1、4 mg·L-1兩組均無顯著變化，8 mg·L-1顯著升高(P<0.05)。總體上看，在暴露4～14 d期間， MDA含量無顯著變化(P>0.05)，僅7 d的 8 mg·L-1組活力顯著升高(P<0.05)。在凈水恢復期，2 mg·L-1處理組MDA含量極顯著性升高(P<0.01)，4 mg·L-1處理組MDA含量顯著升高(P<0.05)。

如圖6所示，在暴露期間，各處理組的CAT活力與對照組的相比，均差異不顯著(P>0.05)，在凈水恢復期，2、4 mg·L-1極顯著高于對照組(P<0.01)，8 mg·L-1處理組無顯著變化(P>0.05)。

3　討論與結論

3.1BDE-47 對雙齒圍沙蠶急性毒性試驗的影響

在急性毒性試驗中，隨著暴露時間的延長，沙蠶會出現斷尾現象。Lucan-Bouché等[19]研究表明：沙蠶的斷尾現象是一種自我保護機制，來消除體內不斷積累的有害物質。BDE-47對太平洋真寬水蚤Eurytemorapacifica的96 h-LC50為57 μg·L-1，對日本虎斑猛水蚤Tigriopusjaponicus的96 h-LC50為851 μg·L-1[20]；而BDE-47對劍尾魚Xiphophorushelleri的96h-LC50為2.75 mg·L-1[18]。本研究結果表明，BDE-47對雙齒圍沙蠶的96 h-LC50為31.24 mg·L-1，這說明不同種類的水生生物對BDE-47的敏感性有很大差異，而沙蠶的96 h-LC50之所以達到這么高，可能是因為沙蠶對 BDE-47 的耐受性較強；沙蠶自身會分泌黏液形成一個保護膜，從而減少環境中 BDE-47 對沙蠶產生毒性，還有可能是機體自身代謝，會使部分的毒物排除體外。

3.2BDE-47對雙齒圍沙蠶GSH含量和GST、GPx活性的影響

GSH是水溶性抗氧化劑，具有重要的抗氧化作用，其結構中的活性基團-巰基，易與體內自由基、重金屬等毒素結合，參與生物體內的生物轉化過程，具有整合解毒、保護生物體內膜系統的作用。可以清除細胞內被誘導產生的過量H2O2；能直接與ROS發生非酶促反應；同時還是GST的底物。GST是生物體內重要的II相代謝酶之一，GST在清除體內自由基的同時還可以調控GSH發揮作用，GST的活性能夠反映出生物機體抗氧化能力[21]。GPx可以催化GSH，把H2O2還原為H2O，其自身被氧化成為氧化型谷胱甘肽(GSSG)，GSSG受到谷胱甘肽還原酶(GR)的催化作用，被還原成GSH，使體內自由基的清除反應能夠持續進行。

在本研究中，GSH含量和GST活力總體上沒有顯著變化，僅GST活力的8 mg·L-1組在第14 d極顯著性升高(P<0.01)。說明在1～14 d的受脅迫期間雙齒圍沙蠶GSH和GST未發揮作用。隨著脅迫時間的延長，ROS在體內不斷的積累，可能在凈水恢復期GSH和GST才發揮作用清除體內ROS，因此GSH含量顯著性升高，8 mg·L-1組的GST活力顯著性升高。2 mg·L-1組的GPx活性在脅迫第7～14 d呈上升趨勢，在脅迫后期發揮作用，同樣凈水恢復期，GPx活性顯著升高來清除體內積累的ROS。

在暴露期間，各處理組的GSH含量和GST、GPx活力與對照組的相比較，總體上均差異不大，但在恢復期，此3個指標總體上被顯著誘導，這可能是由于脅迫時間較短，它們尚未對BDE-47做出響應的緣故，所以，不宜將它們作為BDE-47污染的早期預警生物標志物。

3.3BDE-47對雙齒圍沙蠶SOD、CAT活性和MDA含量的影響

本研究在暴露1 d時，沙蠶細胞受到脅迫，產生大量的ROS，使抗氧化防御系統受到損傷，4、8 mg·L-1兩組SOD酶活力下降，總體上看，4、8 mg·L-1在脅迫前期(1～7 d)SOD活力呈升高趨勢，說明此時抗氧化防御系統發揮作用，清除了沙蠶受到脅迫產生的ROS，第7 d的8 mg·L-1濃度可能過高，需要產生大量的SOD清除體內ROS，因此顯著性升高。隨著暴露時間的繼續延長，持續脅迫14 d時，ROS在沙蠶體內累積，需要消耗大量的SOD酶來清除。因此，4、8 mg·L-1兩組SOD活力受到顯著抑制(P<0.05)。沙蠶在受到脅迫時SOD活力會受到影響，但自身具有恢復能力，在外界刺激消失時恢復到了自然水平[25]。SOD活力的變化主要是在前期和后期，而脅迫中期，總體上無顯著差異。

在本研究之中，與SOD活力相對應，MDA含量暴露1 d時被誘導升高，可能是因為ROS使機體發生脂質過氧化反應，導致MDA大量的產生。隨后，可能是抗氧化防御系統發揮作用清除了過量的ROS，MDA含量降低，并且在脅迫4～14 d機體所產生的 ROS不夠引起脂質過氧化反應，因此MDA含量無顯著性變化。但第7 d的8 mg·L-1可能是因為濃度過高，才會導致脂質過氧化產物短時間內不能完全清除，因此顯著升高。在凈水恢復期，BDE-47脅迫消失，MDA含量持續升高，可能是由于細胞脂質過氧化反應，導致細胞膜受到嚴重破壞，可能已經無法維持生物膜功能的完整性。MDA含量對BDE-47的響應主要是在脅迫初期(1 d)，后期總體上無顯著變化。

CAT酶是以鐵卟啉為輔基，能分解羥自由基和H2O2，從而減輕活性氧對機體細胞的氧化損傷[26]。在暴露期間，CAT 活力處理組與對照組相比較均沒有顯著變化(P>0.05)，只在凈水恢復期CAT活力整體上呈現升高的趨勢，可能是沙蠶體內積累的過量ROS需要CAT發揮作用清除，因此CAT活力升高。

從總體結果看，除了SOD活力外，其他指標都是在恢復期顯著誘導，這可能是由于脅迫期間產生的ROS需要經歷一定時間，并在體內累積達到了一定的量，才需要抗氧化防御系統來清除，其他指標在脅迫后期才逐漸發揮作用所致。

抗氧化防御系統指標是防御型生物標志物，對機體氧化應激比較敏感。通過本研究可以得出以下結論：① GSH含量與GST、GPx、CAT活力對照組相比，總體上差異不顯著(P>0.05)，所以不宜作為監測環境污染的早期預警的生物標志物；②MDA含量和SOD活力的顯著性變化主要是在脅迫初期(1 d)，因此MDA含量和SOD活力可以作為潛在的生物標志物。

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(責任編輯：林海清)

Effect of the Antioxidant Dfense Sstem ofPerinereisaibuhitensisExposed to Tetrabromodiphenyl Ether

SU Li-li, YAN Xi-zhu*

(FisheriesCollegeofJimeiUniversity,Xiamen,Fujian361012,China)

Perinereisaibuhitensisis used as biological subject in acute toxicity test, for determining the 96 h-LC50of tetrabromodiphenyl ether(BDE-47).On this basis, the activities of SOD,CAT,GST,GPx and the contents of GSH, MDA of the antioxidant defense system ofPerinereisaibuhitensisexposed to 0,2,4,8 mg·L-1of BDE-47 pollutants were determined. The results were as follows: the 96h-LC50of BDE-47 toPerinereisaibuhitensiswas 31.24 mg·L-1.Compared with the control group, the content of GSH and activities of GST and CAT had basically no significant change, only the GST activity of 8 mg·L-1group was significantly higher (P<0.01) on 14 th day.The GPx activity of 4 mg·L-1group was significantly higher (P<0.05) on 1 th day, and 2 mg·L-1group showed the increasing trend during the 7 th to 14 th day.On 1 th day, the SOD activity of the 4 mg·L-1and 8 mg·L-1groups significantly decreased (P<0.05).Overall, during the period of 1-7 d, SOD activity of the 2 mg·L-1, 4 mg·L-1groups were induced to rise. On 14 th day, SOD activity in 4 mg·L-1, 8 mg·L-1groups were significant (P<0.05) and significantly (P<0.01) inhibited respectively. The MDA content of all the treatment groups were induced to increase (P<0.05), and 4 mg·L-1group significantly increased (P<0.01) on 1 th day. There was no significant change in the content of MDA of the treatment groups during the exposure period of 4-14 th day, only 8 mg·L-1group was significantly higher (P<0.05) on 7 th day.In conclusion: the content of MDA and activity of SOD of the antioxidant defense system ofPerinereisaibuhitensishad significant changes at the early exposure stage (P<0.05), which could be used as potential biomarkers.

Perinereisaibuhitensis; BDE-47; antioxidant enzyme; GSH; MDA; biomarker

宿麗麗，閻希柱.BDE-47脅迫對雙齒圍沙蠶抗氧化防御系統的影響[J].福建農業學報，2016，31(6)：560-565.

SU L-L,YAN X-Z.Effect of the Antioxidant Dfense Sstem ofPerinereisaibuhitensisExposed to Tetrabromodiphenyl Ether[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(6)：560-565.

2016-02-12初稿；2016-04-10修改稿

宿麗麗(1989-)，女，碩士生，主要從事分子生物學和海洋生物修復研究(E-mail：1090011725@qq.com)

閻希柱(1965-)，男，教授，博士，主要從事水生生物生態毒理學和養殖水域生境修復研究(E-mail:yanxizhu@tom.com)

國家海洋公益性行業科研專項子課題(201205009-4)

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A

1008-0384(2016)06-560-06