果皮酵素的制備及抗氧化活性研究

張淑華，葉柳健，張振鑫，竇偉浩，李洋

（長春理工大學生命科學技術學院，長春　130022）

果皮酵素的制備及抗氧化活性研究

張淑華，葉柳健，張振鑫，竇偉浩，李洋

（長春理工大學生命科學技術學院，長春130022）

本文研究以新鮮果皮為原料，采用市面常用菌種來發酵制備果皮酵素。為進一步優化果皮酵素的發酵工藝參數，以超氧化物歧化酶（SOD）活力為測定指標，通過正交試驗確定果皮酵素的最優發酵條件。結果表明，糖濃度為25%，發酵時間為36h，接種量為6%，發酵溫度為30℃時發酵效果最好。該條件下果皮酵素的超氧化物歧化酶（SOD）活力平均值為46.84U/ml。該研究為果皮酵素的制備和抗氧化活性研究奠定了基礎。

果皮酵素；抗氧化活性；超氧化物歧化酶

酵素是一種由氨基酸組成的具有特殊生物活性的物質，在維持機體正常功能，分解代謝、修復組織、抗氧化等方面具有不可替代的功效。

生物體內的各種生理生化反應，幾乎都要在酵素的催化作用下進行，人體的新陳代謝、能量攝取、成長和繁殖等生命現象，都必須通過酵素的幫助才能完成。身體中酵素的多少與其活性高低和人體的衰老及疾病息息相關［1］。在我們一生中有大量的酵素被隨意地浪費掉了，烹飪食物、精加工食物以及食用酒精、藥物及垃圾食品等行為都會消耗我們體內的酵素，無酵素的食物就會過多的消耗我們體內的酵素，經常感冒，發燒也會消耗我們的酵素補給。目前，現代社會競爭激烈，生活節奏加快，環境污染以及年齡增長，都會導致人體內的酵素大大減少。研究表明人類的動脈硬化、炎癥、糖尿病、癌癥等多種疾病和衰老等都與活性氧和自由基有關［2-4］。由于機體中過量的自由基會引起蛋白質變性、DNA損傷、細胞死亡乃至機體的病變［5］，因此，國內外的很多研究都在尋找富含天然抗氧化性成分的食品來防治自由基引起的疾病。

酵素源于日本，主要以稻米為原料發酵生產。截至目前，其研發和生產工藝均是世界先進水平，且尚屬保密階段［6］。目前，國內市場上也出現了一些添加酵素的保健食品，但在其它食品領域中，酵素的應用還很少，仍然有廣闊的發展空間。鑒于此，酵素產品無論是發酵過程還是酵素生產工藝都有進一步發展的必要性［7］。本文是利用微生物的發酵作用獲得酵素，通過對酵素發酵條件的探討與優化，找出最優的酵素發酵條件，替代傳統自然發酵所制備的酵素，具有實際應用價值。研究果皮酵素具有的超氧化物歧化酶的活力，為進一步探明果皮酵素中的抗氧化活性提供一定的數據資料，為新型抗氧劑的開發提供了新的思路。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

橘子皮；火龍果皮；香蕉皮；市售紅糖；市售安琪高活性干酵母和雙歧桿菌發酵劑；鄰苯三酚（分析純）。

1.2儀器與設備

恒溫培養箱；UV2250型紫外可見分光光度計；高速冷凍離心機；電子天平；超凈工作臺；滅菌鍋。

1.3實驗方法

1.3.1酵素指標的檢測

超氧化物歧化酶（SOD）活力的測定：采用鄰苯三酚自氧化法［8-10］。超氧化物歧化酶活力定義：在1ml反應液中，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達50%時的酶量定為一個活力單位（U），即在325nm波長處測定時，每分鐘光吸收值為一個活性單位［11］。1.3.2菌種的選擇

（1）用安琪酵母菌進行發酵

用蒸餾水清洗果皮，將果皮表面的沙子和灰塵洗掉，然后將果皮切碎，稱取50g果皮裝到玻璃瓶中，加入糖濃度為15%的紅糖水98ml后，放入滅菌鍋，115℃下滅菌30min。將滅菌后冷卻至室溫的玻璃瓶在超凈工作臺中按接種量為2%接種安琪高活性干酵母，放入30℃恒溫箱中進行發酵，24h后獲得酵素并通過鄰苯三酚自氧化法測定所得酵素的超氧化物歧化酶（SOD）的活性來間接確定酵素的抗氧化活性。

（2）用雙歧桿菌發酵劑進行發酵

用蒸餾水清洗果皮，將果皮表面的沙子和灰塵洗掉，然后將果皮切碎，稱取50g果皮裝到玻璃瓶中，加入糖濃度為15%的紅糖水98ml后，放入滅菌鍋，115℃下滅菌30min。將滅菌后冷卻至室溫的玻璃瓶在超凈工作臺中按接種量為2%接種雙歧桿菌，放入30℃恒溫箱中進行發酵，24h后獲得酵素并通過鄰苯三酚自氧化法測定所得酵素的超氧化物歧化酶（SOD）的活性來間接確定酵素的抗氧化活性。

比較這兩種市面上常見的菌種發酵得到酵素的抗氧化活性，得出發酵效果好的菌種。

1.3.3不同果皮來進行發酵

（1）用火龍果皮發酵

用蒸餾水清洗火龍果皮，將果皮表面的沙子和灰塵洗掉，然后將果皮切碎，稱取50g果皮裝到玻璃瓶中，加入糖濃度為15%的紅糖水98ml后，放入滅菌鍋，115℃下滅菌30min。將滅菌后冷卻至室溫的玻璃瓶在超凈工作臺中按接種量為2%接種上個實驗所得出的發酵效果好的菌種，放入30℃恒溫箱中進行發酵，24h后獲得酵素并通過鄰苯三酚自氧化法測定所得酵素的超氧化物歧化酶（SOD）的活性來間接確定酵素的抗氧化活性。

（2）用香蕉皮進行發酵

用蒸餾水清洗香蕉皮，將果皮表面的沙子和灰塵洗掉，然后將果皮切碎，稱取50g果皮裝到玻璃瓶中，加入糖濃度為15%的紅糖水98ml后，放入滅菌鍋，115℃下滅菌30min。將滅菌后冷卻至室溫的玻璃瓶在超凈工作臺中按接種量為2%接種上個實驗所得出的發酵效果好的菌種，放入30℃恒溫箱中進行發酵，24h后獲得酵素并通過鄰苯三酚自氧化法測定所得酵素的超氧化物歧化酶（SOD）的活性來間接確定酵素的抗氧化活性。

（3）用橘子皮進行發酵

用蒸餾水清洗橘子皮，將果皮表面的沙子和灰塵洗掉，然后將果皮切碎，稱取50g果皮裝到玻璃瓶中，加入糖濃度為15%的紅糖水98ml后，放入滅菌鍋，115℃下滅菌30min。將滅菌后冷卻至室溫的玻璃瓶在超凈工作臺中按接種量為2%接種上個實驗所得出的發酵效果好的菌種，放入30℃恒溫箱中進行發酵，24h后獲得酵素并通過鄰苯三酚自氧化法測定所得酵素的超氧化物歧化酶（SOD）的活性來間接確定酵素的抗氧化活性。

比較不同果皮發酵生產酵素的效果。

1.3.4改變不同的發酵條件進行發酵

（1）糖濃度對果皮酵素發酵的影響

用蒸餾水清洗果皮，將果皮表面的沙子和灰塵洗掉，然后將果皮切碎，分別稱取50g果皮裝到5個玻璃瓶中，糖濃度分別為設置為10%、15%、20%、25%、30%，放入滅菌鍋，115℃下滅菌30min。在超凈工作臺中將滅菌后冷卻至室溫的玻璃瓶中按接種量為2%接入菌種，放入30℃恒溫箱中進行發酵，24h后獲得酵素并通過鄰苯三酚自氧化法測定所得酵素的超氧化物歧化酶（SOD）的活性來間接確定酵素的抗氧化活性。

（2）接種量對果皮酵素發酵的影響

用蒸餾水清洗果皮，將果皮表面的沙子和灰塵洗掉，然后將果皮切碎，分別稱取50g果皮裝到5個玻璃瓶中，糖濃度設置為20%，放入滅菌鍋，115℃下滅菌30min。在超凈工作臺中將滅菌后冷卻至室溫的玻璃瓶中按接種量分別為2%、4%、6%、8%、10%接入菌種，放入30℃恒溫箱中進行發酵，24h后獲得酵素并通過鄰苯三酚自氧化法測定所得酵素的超氧化物歧化酶（SOD）的活性來間接確定酵素的抗氧化活性。

1.3.5發酵條件優化正交試驗

根據以往的單因素試驗研究結果，以超氧化物歧化酶（SOD）活力為考察指標，選取糖濃度、接種量、發酵時間和發酵溫度等因素，采用L9（34）正交方法進行試驗設計［12］，優化酵母接種量、發酵時間及溫度等工藝參數，正交試驗因素與水平見表1。該優化研究中每次試驗果皮原料用量為50g，用于確定發酵的工藝參數。

表1　正交試驗因素水平表

1.3.6驗證試驗

用蒸餾水清洗果皮，將果皮表面的沙子和灰塵洗掉，然后將果皮切碎，稱取50g果皮裝到玻璃瓶中，按照正交實驗所確定的最優發酵工藝進行重復性試驗［13］。

2　結果與分析

2.1菌種的選擇

表2　不同菌種發酵抗氧化活性結果

通過用安琪高活性干酵母和雙歧桿菌發酵劑分別對果皮進行發酵，得到兩瓶果皮酵素。測定這兩瓶酵素的抗氧化活性，結果如表2所示。結果表明用安琪高活性干酵母來發酵所得到的酵素抗氧化活性要比用雙歧桿菌發酵劑發酵所得酵素要高。因此，用安琪高活性干酵母作為菌種發酵生產酵素效果好。

2.2不同果皮來進行發酵

通過用安琪高活性干酵母分別對火龍果皮、香蕉皮以及橘子皮進行發酵，得到三瓶果皮酵素。測定這三瓶酵素的抗氧化活性，結果如表3所示。結果表明橘子皮酵素的抗氧化活性＞香蕉皮酵素＞火龍果皮酵素。

表3　不同果皮發酵抗氧化活性結果

2.3糖濃度對果皮酵素發酵的影響

通過改變不同的糖濃度對果皮進行發酵得到果皮酵素。測定所得酵素的抗氧化活性，其結果如圖1所示。結果顯示在一定范圍內果皮酵素的抗氧化活性隨糖濃度的增大而變大；當達到一定程度后，隨糖濃度的增加果皮酵素的抗氧化活性反而減小。

圖1　不同糖濃度發酵抗氧化活性結果

2.4接種量對果皮酵素發酵的影響

通過改變菌種的接種量對果皮進行發酵得到果皮酵素。測定所得酵素的抗氧化活性，其結果如圖2所示。結果顯示不同的接種量對發酵有很大的影響，得到的果皮酵素抗氧化活性各不相同，其中接種量為2%時抗氧化活性最大。

圖2　不同接種量發酵抗氧化活性結果

2.5發酵條件優化正交試驗

由表可知，通過對各因素的K、k及R的大小進行計算，可以得出，A因素以A3水平最佳；B因素以B3水平最佳；C因素以C3水平最佳；D因素以D2水平最佳。從R值可以判斷出各因素對超氧化物歧化酶活力指標影響的主次順序為A（糖濃度）＞C（發酵時間）＞B（接種量）＞D（發酵溫度）。故果皮酵素發酵的最佳工藝條件為A3C3B3D2，即糖濃度為25%，發酵時間36h，接種量為6%，發酵溫度30℃。

表4　正交試驗實施表

2.6驗證試驗

以正交試驗所得出的最優發酵工藝進行發酵得到酵素，進行重復性試驗，測其抗氧化活性。結果如表5所示。從表5可以看出，各重復的超氧化物歧化酶活力穩定，平均值為46.84U/ml，重復性好，變異系數1.868%，說明該發酵工藝穩定可行。

表5　驗證試驗結果

3　結論

以新鮮果皮為原料、安琪高活性干酵母作為菌種來發酵制備果皮酵素。通過用不同果皮來進行發酵制備酵素，結果表明橘子皮酵素的抗氧化活性＞香蕉皮酵素＞火龍果皮酵素。改變不同的發酵條件進行發酵，得出在一定范圍內果皮酵素的抗氧化活性隨糖濃度的增大而變大，在達到一定程度后，隨糖濃度的增加果皮酵素的抗氧化活性反而減小；不同的接種量發酵所得到的果皮酵素抗氧化活性各不相同，其中接種量為2%時活性最大。為進一步優化果皮酵素的發酵工藝參數，以超氧化物歧化酶（SOD）活力為測定指標，通過正交試驗確定果皮酵素的最優發酵條件。結果表明，每50g果皮原料，糖濃度為25%，發酵時間為36h，接種量為6%，發酵溫度為30℃時發酵效果最好。該條件下果皮酵素的超氧化物歧化酶（SOD）活力平均值為46.84U/ml。驗證試驗結果表明該工藝條件穩定可行，重復性好，為果皮酵素的制備奠定了基礎。超氧化物歧化酶活力測定結果表明果皮酵素的抗氧化活性很高，為其在抗氧化活性制劑開發方面提供了借鑒。

［1］于曉艷，任清，盧舒嫻，等.微生物酵素主要功效酶活力的測定［J］.食品科技，2008（7）：193-196.

［2］Chen HY，Yen GC.Antioxidant activity and free radical-scavenging capacity of extracts from guava（Psidium guaja-va L.）leaves［J］.Food Chemistry，2007，101（2）：686-694.

［3］Rattan SIS.Theories of biological aging：genes，proteins，andfreeradicals［J］.FreeRadicalResearch，2006，40（12）：1230-1238.

［4］LeeJS.Effectofsoyproteinandgenisteinon blood glucose，antioxidant enzyme activities，and lipid profileinstreptozotocin-induceddiabeticrats［J］.Life Sciences，2006，79（16）：1578-1584.

［5］蔣增良，毛建衛，等.葡萄酵素在天然發酵過程中體外抗氧化性能的變化［J］.中國食品學報，2014，14（10）：29-34.

［6］郭艷萍，趙金安.大麥天然酵素抗氧化性能的初步探究［J］.山西化工，2014，34（4）：4-6.

［7］毛建衛，吳元鋒，方晟.微生物酵素研究進展［J］.發酵科技通訊，2010，39（3）：42-44.

［8］許雅娟，趙艷景，胡虹.鄰苯三酚自氧化法測定超氧化物歧化酶活性的研究［J］.西南民族大學學報：自然科學版，2006，32（6）：1207-1212.

［9］曲敏，秦麗楠，劉羽佳，等.兩種檢測SOD酶活性方法的比較［J］.食品安全質量檢測學報，2014，5（10）：3318-3323.

［10］楊明琰，張曉琦，沈儉，等.超氧化物歧化酶兩種鄰苯三酚自氧化測定活力方法的比較［J］。微生物學雜志，2006，26（3）：40-42.

［11］楊婧娟，李娜，趙聲蘭.一種酵素的配方優化研究［J］.中國釀造，2016，35（1）：95-99.

［12］李志江，牛廣財，鹿保鑫，等.糙米酵素發酵工藝條件的研究［J］.中國釀造，2008，27（22）：65-67.

［13］牛廣財，朱丹，左鋒，等.糙米酵素發酵工藝的中試研究［J］.中國釀造，2014，33（6）：96-98.

Preparation and Antioxidant Activity of Peel Enzyme

ZHANG Shuhua，YE Liujian，ZHANG Zhenxin，DOU Weihao，LI Yang
（School of Life Science and Technology，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022）

We used some common strains to prepare peel enzyme with fresh fruit as raw material.In order to optimize the peel enzyme fermentation process parameters，superoxide dismutase（SOD）activity was determined in orthogonal test.The results showed that the optimum conditions for fermentation were as follow：Sugar concentration of is 25%，fermentation time is 36h，Inoculation is 6%，fermentation temperature is30℃，SOD activity is 46.84 U/ml in average.It lays the foundation for further research on preparation and antioxidant activity of peel enzyme

peel enzyme；antioxidant activity；superoxide dismutase

TS255.1

A

1672-9870（2016）04-0063-04

2016-03-15

博士后經費（40301/870）

張淑華（1972-），女，副教授，碩士生導師，E-mail：zhangsh1018@126.com