基于SSR標記的新疆野杏群體遺傳多樣性及遺傳結構

包文泉，烏云塔娜*，王　淋，趙　罕，杜紅巖

(1 國家林業局泡桐研究開發中心，鄭州450003；2 中國林業科學研究院經濟林研究開發中心，鄭州450003)

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基于SSR標記的新疆野杏群體遺傳多樣性及遺傳結構

包文泉1,2，烏云塔娜1,2*，王淋1,2，趙罕1,2，杜紅巖1,2

(1 國家林業局泡桐研究開發中心，鄭州450003；2 中國林業科學研究院經濟林研究開發中心，鄭州450003)

利用27對SSR分子標記對新疆4個野杏群體遺傳多樣性和遺傳結構進行分析，評價新疆野杏遺傳多樣性水平和分化程度，為新疆野杏合理保護與利用提供科學依據。結果顯示：(1)27對SSR引物共檢測到431個等位基因(Na)，各位點平均等位基因數(Na)和多態性信息含量(PIC)分別為15.96和0.84；物種水平上Shannon’s信息指數(I)和期望雜合度(He)分別為2.21和0.78。(2)群體水平上等位基因數(Na)、有效等位基因(Ne)、Shannon’s信息指數(I)、期望雜合度(He)和觀察雜合度(Ho)分別為10.98、5.85、1.92、0.79和0.55；其中新源縣野杏群體遺傳多樣性最豐富，鞏留縣群體遺傳多樣性最低。(3)基于F統計量分析的遺傳分化系數(Fst)為0.05，基因流(Nm)為5.26；分子方差分析顯示新疆野杏群體大部分遺傳變異來自群體內(95.4%)，群體間的遺傳變異僅占4.6%。(4)新疆野杏群體遺傳距離為0.06～0.49，平均為0.24；遺傳相似度為0.61～0.94，平均為0.80；遺傳相似度的聚類分析和遺傳距離的主坐標分析結果一致，均將供試4個群體劃分為兩組；Mantel檢測顯示，新疆野杏群體遺傳距離與地理距離無顯著相關(r=0.332，P=0.16)。研究表明，新疆野杏資源具有豐富的遺傳多樣性，群體遺傳分化程度較低，群體間遺傳距離較小，這與新疆野杏群體的大小和悠久的演化歷史以及群體間頻繁的基因交流相關。

野杏；SSR；遺傳多樣性；遺傳結構

新疆野杏(ArmeniacavulgarisLam.)屬于薔薇科(Rosaceae)杏屬(Armeniaca)植物[1]，是中國珍貴野生果樹資源之一，通常被認為是世界栽培杏的原種，對栽培杏的演化起過重要作用[2]。伊犁位于新疆維吾爾自治區北天山之中，具有廣闊的山間平原盆地和河谷地，日照充足、降雨量充沛，土壤肥沃，其獨特的自然地理環境為野杏的分布演化提供了極有利的生態條件，孕育著豐富的野杏資源，可為中國杏資源的改良及其新品種選育提供重要的遺傳基礎[3]。已有學者基于葉片、果實和核仁等重要性狀指標及ISSR分子標記，分析新疆野杏不同群體遺傳多樣性和變異特征[4-5]。但形態指標易受環境影響，而ISSR作為顯性分子標記，所能揭示的遺傳信息量有限。SSR(simple sequence repeat)分子標記技術具有共顯性、特異性強和多態性高等優點，能夠很好地滿足遺傳多樣性等研究要求[6]，是目前大家所用最多并且較為理想的分子標記，它能避免環境因素的干擾，也能夠有效克服AFLP標記的復雜性、RAPD標記的重復性差以及ISSR標記的顯性等缺點。近年來SSR技術在果樹遺傳分析中得到廣泛應用[7-9]，但在新疆野杏資源中的應用較少。本研究以80份新疆野杏種質為研究材料，利用SSR分子標記對其遺傳多樣性及遺傳結構進行分析，為新疆

野杏種質資源的合理保護與利用提供科學依據。

1　材料與方法

1.1材料來源

新疆野杏種質(表1)均采于2013年6月。包括新疆伊犁4個野杏群體的80個個體；每個群體采集20個單株，分別進行GPS定位，相鄰株間至少相距50 m左右，選取幼嫩葉片，迅速放入液氮，保存于-80 ℃低溫冷藏冰箱，備提取DNA。

1.2SSR分析

采用改良CTAB法[10]，提取基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳及分光光度計檢測含量及純度后，將濃度調至50 ng·μL-1，保存于-80 ℃度低溫冷藏冰箱備用。

根據已報導的桃屬植物SSR引物，篩選出多態性高、重復性好的27對用于本研究(表2)；PCR擴增反應體系為20 μL混合體系，由1 μL DNA模板(10～20 ng·μL-1)，0.2 μL 2×Tab Master Mix，2 μL 10×buffer，0.5 μL dNTP(2.5 mmol·L-1)、DMSO(10%)、熒光正向引物和反向引物(0.8 μmol·L-1)，14.8 μL無菌去離子水(ddH2O)；反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30次循環；95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，15次循環；72 ℃終延伸5 min。SSR擴增產物經由DNA分析儀(ABI 3500XL)進行檢測，利用Gene-Marker軟件(Soft Genetics LLC，USA)讀取結果，并記錄每個位點片段大小。

表1　新疆野杏種質資源信息Table 1　Information of wild apricot resources in Xinjiang

1.3數據分析

基于Data Formater 2.7.2軟件[11]將SSR熒光毛細管電泳原始數據轉化成后期數據分析軟件運行格式，利用GenAlEx軟件[12]計算等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、Shannon’s信息指數(I)、期望雜合度(He)、觀察雜合度(Ho)、遺傳距離(D)、遺傳相似度(I)、F-統計量(F-statistics)、基因流(Nm)和等位基因頻率。多態性信息含量(PIC)通過公式PIC=1-∑fij2計算(fij為第i個位點第j個等位基因出現的頻率)。利用Arlequin 3.5軟件[13]進行哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)檢測和分子方差分析(AMOVA)。由經緯度計算群體間的地理距離(km)，采用TFPGA軟件[14]進行Mantel檢測，分析地理距離和遺傳距離的相關性；聚類分析利用NTSYS pc version 2.10e軟件[15]，根據Nei’s遺傳相似系數，用UPGMA法完成。主坐標分析(PCoA)以遺傳距離做參數，應用GenAlEx軟件[12]完成。

2　結果與分析

2.1群體遺傳多樣性

基于27對SSR引物對供試80份新疆野杏種質進行毛細管電泳檢測，結果(圖1)表明，各引物目的片段清晰，結果準確可靠。27個SSR位點遺傳多樣性分析結果(表2)可知，27個位點共檢測到431個等位基因，各位點等位基因數從9個(MA020A)到27個(UDP98-021)，平均每個位點等位基因數為15.96個；27個SSR位點多態性信息含量(PIC)為0.48～0.92，均值為0.84，說明新疆野杏遺傳多樣性豐富，個體間遺傳變異較大。各群體遺傳多樣性分析結果(表3)可知，在物種水平，平均等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、期望雜合度(He)、觀察雜合度(Ho)和Shannon’s信息指數(I)分別為10.98、5.85、0.79、0.55和1.92。在群體水平上，新源縣遺傳多樣性最高(Ne=6.38，He=0.82，I=1.97)，鞏留縣最低(Ne=5.55，He=0.75，I=1.89)。

2.2群體遺傳分化

F統計結果顯示，新疆野杏在不同SSR位點的遺傳分化系數(Fst)存在差異(表2)，遺傳分化系數范圍為0.03～0.10, 均值為0.05, 說明5%遺傳變異存在于群體間，絕大部分遺傳變異存在于群體內部；分子方差分析結果表明(表4)，新疆野杏遺傳變異主要存在于群體內(95.4%)，而群體間的遺傳變異僅占4.6%。通過Hardy-Weinbery檢測顯示4個群體均處于平衡狀態(表3)，表明新疆野杏群體受人類活動和環境變化的影響較小。近交系數是評價群體偏離哈迪-溫伯格平衡的程度，通過對新疆野杏近親繁殖檢測可知(表3)，4個群體近交系數(F)均大于0(0.28～0.38)，平均為0.31，表明新疆野杏群體均表現雜合子不足，群體內近親繁殖比較多。群體總基因流(Nm)為5.26，其中，鞏留縣與霍城縣群體間遺傳分化最大(Fst=0.06)，基因流最小(Nm=4.16)；新源縣與伊寧縣群體遺傳分化最小(Fst=0.03)，基因流最大(Nm=15.69)；表明新疆野杏群體間遺傳分化程度較低，群體間存在頻繁的基因交流。

2.3群體遺傳關系

根據Nei’s遺傳距離(D)和遺傳相似度(I)(表5)可知，新疆4個野杏群體遺傳距離為0.06～0.49，平均值為0.24，遺傳相似度為0.61～0.94，平均值為0.80，表明新疆野杏群體間親緣關系較近，其中新源縣與伊寧縣群體遺傳距離最小，遺傳相似度最大；霍城縣與鞏留縣群體遺傳距離最大，遺傳相似度最小；依據遺傳相似系數構建的UPGMA聚類分析(圖2)，在相似系數0.70位置，可將供試群體劃分為2組，其中新源縣、伊寧縣和霍城縣群體聚為一組，而鞏留縣群體單獨分為一組。通過Mantel檢測結果可知，遺傳距離與地理距離無顯著相關(r=0. 332，P=0.16)。

圖1　樣品277(新源縣)在MA007a處擴增的毛細管電泳檢測Fig.1　Capillary electropherogram obtained by MA007a of 277 (Xinyuanxian)表2　27個SSR位點的遺傳分析結果Table 2　Genetic analysis of twenty-seven SSR loci

位點LocusNaIHoHeFisFitFstNmPICUDP98-409[13]20.002.700.380.870.600.620.054.340.92UDP96-003[13]18.002.620.840.870.030.060.037.570.92UDP97-401[13]11.002.020.490.780.350.380.054.690.84UDP97-402[13]16.002.100.460.760.370.410.063.970.83UDP98-406[13]20.002.620.850.870.060.090.038.660.91UDP98-021[13]27.002.300.400.730.760.770.054.900.77UDP98-412[13]10.001.400.320.620.410.440.054.550.67BPPCT002[16]16.002.250.560.760.160.210.073.580.86BPPCT004[16]19.002.560.760.850.090.130.054.790.90BPPCT007[16]18.002.530.810.850.030.070.045.500.90BPPCT008[16]16.002.430.740.870.200.220.039.660.89BPPCT023[16]12.002.260.450.830.560.600.102.300.88Pchgms3[17]11.001.160.100.430.280.320.063.740.48Pchgms4[17]15.002.090.690.780.340.380.054.520.82Pchgms5[17]14.002.290.590.810.490.520.054.560.88pchgms12[17]18.002.470.480.790.320.360.054.500.88aprigms18[18]17.002.310.530.820.290.320.045.370.88aprigms24[18]21.002.570.580.830.810.810.037.130.90MA007A[19]20.002.390.530.770.220.240.038.250.87MA020A[19]9.001.540.310.690.190.220.045.670.75MA039A[19]14.001.800.100.710.290.330.064.290.76M6a[19]12.001.770.450.690.470.510.082.770.75PMS2[20]20.002.480.700.810.330.370.063.740.88PMS67[20]15.002.480.720.860.380.430.082.900.90ASSR71[21]11.001.820.610.680.120.170.054.380.80ASSR72[21]11.002.020.600.790.290.320.046.060.83PCEGA25[21]20.002.640.810.870.070.090.039.550.91均值/Mean15.962.210.550.780.310.350.055.260.84

注：Na. 等位基因；I. Shannon’s信息指數；Ho. 觀察雜合度；He. 期望雜合度；Fis. 居群內繁育系數；Fit. 總居群內繁育系數；Fst. 遺傳分化系數；Nm. 基因流；PIC. 多樣性信息指數

Note：Na. Number of alleles；I. Shannon’0.s Information Index；Ho. Observed heterozygosity；He. Expected heterozygosity；Fis. Inbreeding coefficient at the population level；Fit. Inbreeding coefficient at the total sample level；Fst. Proportion of differentiation among populations；Nm. Gene flow；PIC. Polymorphism information content

表3　新疆野杏群體遺傳多樣性Table 3　Genetic diversity of wild apricot populations in Xinjiang

注：Ne. 有效等位基因數；F. 近交系數；HWE. 哈代-溫伯格平衡

Note：Ne. Effective number of alleles；F. Inbreeding coefficient；HWE. Hardy-Weinberg equilibrium

表4　27個SSR位點分子方差分析Table 4　Analysis of molecular variance (AMOVA) average across 27 SSR loci

表5　群體間遺傳相似度(對角線上方)和遺傳距離(對角線下方)Table 5　Genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal) among populations

圖2　遺傳相似度UPGMA聚類分析Fig.2　UPGMA dendrogram based on genetic identity

為了進一步探討新疆野杏群體間的遺傳關系，利用遺傳距離進行主坐標分析(PCoA)(圖3)，結果與聚類分析結果基本一致，都將80個供試材料劃分為2組，第Ⅰ組包括新源縣、伊寧縣和霍城縣群體的60個單株；第Ⅱ組包括鞏留縣群體的20個單株。

圖3　杏群體主坐標分析Fig.3　Principal coordinates analysis of apricot populations

3　討　論

3.1群體遺傳多樣性

遺傳多樣性是物種所攜帶遺傳信息的總和，遺傳多樣性高的物種，可更好地適應環境；相反，則更容易受到環境影響[22]。新疆野杏作為世界栽培杏原始種，具有極高的營養價值、藥用價值和觀賞價值。本研究基于27對SSR分子標記，對新疆4個野杏群體進行遺傳多樣性分析，共檢測到431個等位基因，平均每位點15.96個。4個野杏群體平均有效等位基因數(Ne)、期望雜合度(He)和Shannon’s信息指數(I)分別為5.85、0.79和1.92，高于章秋平等[23]利用SSR標記對華北生態區普通杏研究結果(He=0.67，I=1.44)和何天明等[2]利用SSR標記對新疆普通杏研究結果(He=0.29，I=0.43)，表明新疆野杏具有豐富的遺傳多樣性，與劉娟等[4-5]研究結果相一致；與其它野生資源相比，如王滑等[24]利用SSR對中國天然核桃(JuglansregiaLinn.)研究(Ne=2.81、He=0.61)，新疆野杏仍表現出較高的遺傳多樣性。這可能與居群的大小相關，新疆野杏在伊犁分布廣泛，常與野蘋果成混交林，居群面積較大。此外，作為多年生野生資源，長期的演化和擴散，使其累積了豐富的遺傳變異。因此，居群面積大以及悠久的演化歷史是新疆野杏遺傳多樣性高的主要原因。

3.2群體遺傳分化和遺傳結構

遺傳分化是由于遺傳漂變和基因流隔離引起的基因頻率和雜合性的變化。根據Wright[25]提出的遺傳分化系數(Fst)小于0.25，表明群體遺傳分化較低，本研究F統計(Fst=0.05)和方差分析(Fst=0.046)結果顯示，新疆野杏群體間遺傳分化程度較低，遺傳變異主要來自于群體內(95.4%)。劉娟等[4]利用ISSR標記研究指出新疆野杏群體遺傳分化程度較低(Fst=0.14)，Wang等[26]研究表明中國野山杏群體遺傳分化程度較低(0.06)，均與本研究結果相吻合。

基因流是揭示物種間的基因滲透以及遺傳分化的重要指標，其強弱對群體遺傳分化具有重要影響，基因流大于1時能有效阻止遺傳漂變引起的遺傳分化，反則，難以抵制群體內遺傳漂變引起的遺傳分化[25]。新疆野杏分布連續，生境片段化不嚴重，其基因流主要通過蟲媒傳花粉、人類及野生動物對野杏種子的取食和儲藏等擴散方式來完成[27]。本研究中新疆野杏群體總基因流為5.26，表明新疆野杏群體間存在頻繁的基因交流，有效削弱了遺傳漂變引起的遺傳分化；同時，新疆野杏群體存在雜合子缺失現象，這可能與新疆野杏較高的近交率(F=0.31)相關；說明新疆野杏受環境影響，群體可能正經歷著遺傳多樣性的喪失，今后需要加大樣品進一步深入研究和實驗驗證。

UPGMA聚類分析和主坐標分析均將4個野杏群體劃分為2組，與Mantel檢測結果一致，即新疆野杏群體遺傳距離與地理距離無顯著相關(r=0.332，P=0.16)。劉娟等[4-5]通過對新疆野杏群體研究，指出新源縣和霍城縣群體親緣關系較近，而鞏留縣群體與上述兩個群體親緣關系較遠；本研究將鞏留縣群體單獨分為一組，與其它3個群體遺傳關系較遠，具有明顯的特異性，而新源縣、霍城縣和伊寧縣3個群體遺傳多樣性相對較高，親緣關系較近，結合主坐標分析可知，此3個群體間存在明顯遺傳混雜，但與鞏留縣具有明顯的分化。鞏留縣位于新疆西北部，被伊什格力克和那拉提山包圍，阻礙了鞏留縣野杏與外界的基因交流(鞏留縣群體與新源縣、霍城縣和伊寧縣的平均基因流為4.85)，從而表現較低的遺傳多樣性和獨特的地理區域特征；然而新源縣、霍城和伊寧縣3個群體生境連續相連，基因交流較容易(新源縣、霍城縣和伊寧縣3個群體的平均基因流為11.30)，從而表現較高的遺傳多樣性和較近的遺傳關系。綜上可知，群體間頻繁的基因流是影響新疆野杏群體遺傳特征的主要因素。

綜上所述，基于27對SSR引物對新疆野杏群體遺傳特征研究結果顯示，新疆野杏具有豐富的遺傳多樣性，與新疆野杏居群面積大和悠久的演化歷史相關。新疆野杏遺傳變異主要來自群體內部，而群體間遺傳分化程度較低，這與新疆野杏生境分布連續、自身生物學特征、人類及野生動物對野杏種子的儲藏等因素共同作用下的群體間較高的基因流相關。遺傳關系分析顯示，新疆野杏群體間遺傳距離較近，遺傳相似度較高。因此，應重點保護遺傳多樣性高的群體，如新源縣群體，同時也要加強保護一些特異群體，避免一些特殊基因消失，如鞏留縣群體。在確定新疆野杏的地理分布、群體特點和生態學特性的基礎上，構建新疆野杏保護區，科學保護和利用新疆野杏資源，對培育或改良新杏品種具有重要意義。

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(編輯:宋亞珍)

Genetic Diversity and Population Structure of Wild Apricot in Xinjiang Revealed by SSR Markers

BAO Wenquan1,2, WUYUN Tana1,2*, WANG Lin1,2, ZHAO Han1,2, DU Hongyan1,2

(1 China Paulownia Research Center, State Forestry Administration, Zhengzhou 450003, China；2 Non-Timber Forest Research and Development Center, Chinese Academy of Forestry, Zhengzhou 450003, China)

In order to provide theoretical support for reasonable protection and utilization of wild apricot, we analyzed the genetic diversity and genetic differentiation of four wild apricot populations from Xinjiang by using twenty-seven pairs of SSR (simple sequence repeat) primers. The results showed that: (1) a total of 431 alleles (Na) were identified based on 27 SSR molecular markers. The average number of alleles (Na) per locus and polymorphism information content (PIC) per locus were 15.96 and 0.84, respectively. A high level of genetic diversity was revealed by Shannon’s information index (I, 2.21) and expected heterozygosity (He, 0.78) at species level. (2) The average number of alleles (Na), number of effective alleles (Ne), Shannon’s information index (I), expected heterozygosity (He) and observed heterozygosity (Ho) were 10.98, 5.85, 1.92, 0.79 and 0.55, respectively at population level. Comprehensive analysis suggested that Xinyuanxian population exhibits the highest level of genetic diversity, whereas the population of Gongliuxian exhibits the lowest level of genetic diversity. (3) The genetic differentiation coefficient (Fst) based onF-statistic and gene flow (Nm) were 0.05 and 5.26, respectively; Analysis of molecular variance showed that the most of the genetic variation within populations (95.4%), more than that among population (4.6%). (4) The genetic distance among population in Xinjiang wild apricot ranged from 0.06 to 0.49 with average of 0.24; the genetic identity among population in Xinjiang wild apricot ranged from 0.61 to 0.94 with average of 0.80. UPGMA cluster analysis and principal coordinates analysis (PCoA) showed that 4 populations could be divided into two clusters; The Mantel test showed that there was not a significant correlation between the genetic distance and geographic distance (r=0.332,P=0.16). All the results supported that the genetic diversity of wild apricot in Xinjiang was relatively abundant. Nevertheless, genetic differentiation and genetic distance was relatively lower, which resulted from the size of population, long historical evolution and frequent gene flow.

wild apricot; SSR; genetic diversity; genetic structure

1000-4025(2016)09-1757-07doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.09.1757

2016-06-12;修改稿收到日期:2016-08-19

國家十二五課題支撐(2013BAD14B02)

包文泉(1988-)，男，在讀博士研究生，主要從事經濟林育種研究。E-mail: 48369742@qq.com

烏云塔娜，教授，博士生導師。主要從事經濟林育種和林業生物技術研究。E-mail：tanatanann@163.com

Q346+.5; Q789

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