菏澤鳳丹牡丹花花青素提取工藝研究

張志超，余輝攀，楊玉琴，肖順麗，曹丹亮，張宏桂

（1.北京中醫藥大學中藥學院，北京100102；2.菏澤金豐魯德生物科技有限公司，山東菏澤274000）

菏澤鳳丹牡丹花花青素提取工藝研究

張志超1，余輝攀1，楊玉琴1，肖順麗1，曹丹亮2，張宏桂1

（1.北京中醫藥大學中藥學院，北京100102；2.菏澤金豐魯德生物科技有限公司，山東菏澤274000）

目的以花青素含量為指標優選菏澤鳳丹牡丹花的最佳提取工藝。方法采用比色法測定其含量，比較乙醇濃度、料液比、提取時間、超聲頻率等因素對花青素提取率的影響。采用單因素水平考察乙醇體積分數（10%～90%）、料液比（1∶10～1∶40）、提取時間（10～40 min）、超聲頻率（16～40 kHz）對花青素提取率的影響，以確定花青素最佳提取工藝。結果在單因素考察中，乙醇最佳體積分數范圍為70%～90%，最佳料液比范圍為1∶15～1∶25，最佳超聲頻率范圍為16～32 kHz，最佳提取時間范圍為10～25 min；正交試驗極差結果分析表明，所考察的因素中，對鳳丹牡丹花花青素提取率的影響程度依次為超聲頻率＞溶劑體積分數＞液料比＞提取時間；花青素的最佳提取工藝為25倍70%乙醇，24 kHz超聲提取12 min；按優化后的提取工藝，花青素的提取率為0.42%。結論該提取工藝可行，具有工藝流程簡單和提取率高的優點。

鳳丹牡丹花；花青素；比色法；提取工藝

牡丹Paeonia suffruticosa Andr.屬芍藥科芍藥屬植物，為我國特有。牡丹花作為觀賞性花卉，享譽古今中外，并被尊為“花中之王”和“國花”［1］。其藥用功效記載于《淄博本草》，牡丹花味苦、淡，性平，無毒，有調經活血的功效，主治婦女月經不調，經行腹痛［2］。2013年，菏澤鳳丹牡丹花被國家衛生部批準為食品新原料?；ㄇ嗨厥悄档せㄉ纬傻奈镔|基礎，花色苷是花青素與糖以糖苷鍵結合而成的一類化合物，存在于植物的花、果實和葉中，使其呈現由紅、紫紅到藍等不同的顏色。花青素廣泛應用于治療微循環失調、抗潰瘍、抗炎癥等，其含量測定主要有高效液相色譜（HPLC）法、對照品法和pH示差法，HPLC法主要用于測花青素單體的含量，對照品法和pH示差法均可用于測花青素總含量［3-4］。但花色素對照品很不穩定，限制了HPLC法的應用；pH示差法誤差較大，且樣品易渾濁。故本研究中采用對照品法來測定鳳丹牡丹花花瓣中花青素的含量，對照品法以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷為對照品，且通過單因素考察和正交試驗優化了花青素的提取工藝，為開發利用牡丹花提供了依據?，F報道如下。

1　儀器與試藥

1.1儀器

KQ-500DE型數控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；U-2000型紫外可見分光光度計；RE52CS型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵；B-220型恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）；高速萬能粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）；BS11OS型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；DZ-2BC型烘箱（天津市麥斯特儀器有限公司）。

1.2試藥

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對照品（月旭科技有限公司，批號為10428，純度大于98%）；牡丹花采自山東省菏澤市，經曹丹亮工程師鑒定為鳳丹牡丹Paeoniaostii T.Hong et J.X.Zhang，5℃保存。

2　方法與結果

2.1花青素含量測定

2.1.1檢測波長確定

用甲醇配制的對照品溶液和少量牡丹花提取液，在UV-2401PC紫外可見分光光度計的200～800 nm波長范圍內掃描，分別得到對照品溶液和牡丹花提取液吸收光譜圖，見圖1 A和圖1 B。綜合分析后，選擇536 nm波長作為牡丹花提取物中花青素吸光度的檢測波長。

圖1　光譜掃描曲線圖

2.1.2方法學考察

標準曲線繪制：稱取矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解，定容至10 mL容量瓶中，配制成1 g/L的標準貯備液，備用。分別精密吸取0.10，0.75，1.00，1.25，1.50 mL貯備液置5 mL容量瓶中，用甲醇定容。在536 nm波長處測定吸光度并繪制標準曲線，見圖2。

圖2　矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標準曲線圖

精密度試驗：精密吸取對照品溶液1.0 mL，按擬訂條件進樣測定6次。結果的RSD=0.96%（n=6），表明該儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密吸取對照品溶液1.5 mL，分別于0，2，4，6，8，10 h時測定吸光度值。結果的RSD= 1.39%（n=6），表明該溶液在10 h內穩定。

重復性試驗：稱取保存在5℃的牡丹花瓣1.014 6 g 6份，乙醇濃度為70%，液料比為1∶10，16 kHz超聲波下提取1次，提取時間為0.5 h。結果的RSD=1.63%（n=6），表明該方法重復性良好。

加樣回收試驗：分別精密吸取0.5，0.8，1.0，1.5，1.8，2.0 mL質量濃度為10 μg/mL的對照品溶液加入至6份已知含量為0.008 8%的牡丹花瓣，依法測定含量并計算回收率。結果的RSD=1.21%（n=6），表明該方法回收率良好。

2.2提取工藝單因素試驗

2.2.1提取方法

溫浸提?。悍Q取5℃保存的牡丹花瓣1.014 6 g，加入10倍量70%乙醇，水浴60℃，浸泡0.5 h，濾過，提取濾液，減壓回收溶劑，殘渣加甲醇定容至10 mL容量瓶。結果花青素含量為0.088%。

回流提取：稱取5℃保存的牡丹花瓣1.014 6 g，加入10倍量70%乙醇，水浴60℃，回流提取0.5 h，濾過，提取濾液，減壓回收溶劑，殘渣加甲醇定容至10 mL容量瓶。結果花青素含量為0.096%。

超聲提取：稱取保存在5℃的牡丹花瓣1.014 6 g，加入10倍量70%乙醇，水溫60℃，16 kHz超聲提取0.5 h，濾過，提取濾液，減壓回收溶劑，殘渣加甲醇定容至10 mL容量瓶。結果花青素含量為0.167%。

可見，超聲提取效果最佳。

2.2.2提取溶劑

稱取5℃保存的牡丹花瓣1.014 6 g，在料液比為1∶15，16 kHz超聲波下提取1次，提取時間為0.5 h，考察水及不同體積分數乙醇對花青素提取率的影響。結果經水和10%，30%，50%，70%，90%乙醇提取后，花青素含量分別為0.086%，0.117%，0.134%，0.155%，0.169%，0.150%。可見，乙醇提取效果較好，且乙醇的體積分數在50%～70%效果最佳。

2.2.3提取時間

稱取5℃保存的牡丹花瓣1.014 6 g，在料液比為1∶10，70%乙醇，16 kHz超聲波下提取1次，考察不同提取時間對花青素提取率的影響。結果提取10，15，20，25，30，40 min后，花青素含量分別為0.151%，0.175%，0.171%，0.165%，0.165%，0.157%?？梢?，提取時間在15～20 min最佳。

2.2.4液料比

稱取5℃保存的牡丹花瓣1.014 6 g，乙醇體積分數為70%，16 kHz超聲波下提取1次，提取時間為0.5 h，考察不同液料比對花青素含量的影響。結果料液比為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40時，花青素含量分別為0.162%，0.180%，0.181%，0.183%?？梢?，隨著溶劑量的增加，花青素含量提高，溶劑量超過20倍時，溶劑量增加但提取率提高并不多，且液料比增大，給后期處理工序增加困難，增加生產成本，故料液比不宜太高，宜選擇1∶15～1∶25。

2.2.5超聲頻率

稱取5℃保存的牡丹花瓣1.014 6 g，乙醇體積分數為70%，在料液比為1∶10，不同超聲頻率下提取0.5 h。結果超聲頻率在16，24，32，40 kHz時，花青素含量分別為0.165%，0.179%，0.171%，0.163%。可見，花青素的提取率開始先隨超聲頻率增加而增加，隨后又隨頻率增加而減少，這與文獻［5］的報道一致。這可能是因為隨超聲頻率的增加，場內所產生的空化效應、粉碎等作用減弱，導致提取率變低，故選擇頻率為16～32 kHz。

2.3正交試驗優化提取工藝

以乙醇體積分數（因素A）、提取時間（因素B）、料液比（因素C）、超聲頻率（因素D）等因素作為考察對象，分別單因素考察，找到相應合適的條件，然后對4因素、3水平進行L9（34）正交試驗，以獲取最佳工藝參數。根據以上單因素試驗結果，因素A，B，C，D對花青素提取率具有重要影響。采用L9（34）因素水平表選用最佳提取參數，結果見表1和表2。以花青素含量為考察指標。由表2中極差R值大小顯示，超聲頻率極差最大，其次為提取次數和液料比，提取時間極差相差最小。對于牡丹花花青素而言，各因素對提取效果影響的大小順序為D＞A＞C＞B。通過直觀分析方法，篩選出最佳提取方案A2B1C3D2，即稱取適量牡丹花，加入25倍70%乙醇，24 kHz超聲提取12 min。

表1　因素水平表

2.4最佳工藝驗證試驗

稱取適量牡丹花，在最佳提取條件下重復試驗3次，取平均值，結果見表3。可見，牡丹花中花青素提取率平均達0.42%，該提取工藝穩定，提取率高。

2.5不同品種牡丹花花青素的含量測定

結果見表4。

3　討論

本研究結果顯示，采用超聲方法提取，乙醇為提取溶劑有多種影響因素。通過單因素考察結果表明，乙醇體積分數、料液比、超聲頻率、提取時間對提取率有較大影響；正交試驗結果表明，各因素對提取效果影響順序為D＞A＞C＞B；通過直觀分析方法，篩選出最佳提取方案A2B1C3D2，即稱取適量鳳丹牡丹花，加入25倍70%乙醇，24 kHz超聲提取12 min。該方法鳳丹牡丹花中花青素提取率平均達0.42%，該提取工藝穩定，提取率高。與醇提法相比，水提花青素明顯不夠徹底，故不宜采用水提法。

表2　L9（34）正交試驗設計與結果

表3　驗證試驗結果

表4　不同品種牡丹花花青素的含量

4個品種的鳳丹牡丹花花瓣的花青素含量依次為紅色牡丹（0.174%）、淡紅色牡丹（0.154%）、紫色牡丹（0.778%）、黃色牡丹（0.083%）。

牡丹花除了作為觀賞性花卉外，還有潛在的尚未開發的經濟價值。本文對鳳丹牡丹花花青素的提取工藝和花青素含量測定方法的建立，為開發利用牡丹花提供了依據。

［1］郭少霞，張玉剛，任茹.中國牡丹研究進展［J］.萊陽農學院學報，2003，20（2）：116-121.

［2］趙亦成，蔣紀洋.淄博本草［M］.北京：中國中醫藥出版社，1995：12.

［3］楊兆艷.pH示差法測定桑椹紅色素中花青素含量的研究［J］.食品科技，2007，32（4）：201-203.

［4］吐爾洪，何文靜，堵年生.紫外分光光度法測定木賽萊斯酒中花青素的含量［J］.中國民族醫藥雜志，2006，12（4）：54-55.

［5］郭孝武，張福成，林書玉，等.超聲提取對黃連素提出率的影響［J］.中國中藥雜志，1995，20（11）：673-675.

Study on Optimum Extraction Technology of Anthocyanidin in Paeoniaostii Flower

Zhang Zhichao1，Yu Huipan1，Yang Yuqin1，Xiao Shunli1，Cao Danliang2，Zhang Honggui1
（1.College of Chinese Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing，China100102；2.Heze Jinfeng Lude Biotechnology Co.，Ltd.，Heze，Shandong，China274000）

ObjectiveTo optimize the extraction technology of anthocyanidin inPaeoniaostii Flower.M ethodsThe contents of anthocyanidin were detected by colorimetric determination and the factors（ethanol concentration，solid-liquid ratio，extraction time and ultrasonic wave）were studied to compare their influence on the extraction ratio of anthocyanidin.Single factor tests were studied to compare the influence of ethanol concentration（10%-90%），solid-liquid ratio（1∶10-1∶40），extraction time（10-40 min），ultrasonic wave（16-40 kHz）on the extraction ratio of anthocyanidin.The influence of each factor was analyzed and the best extraction technology was determined.ResultsSingle factor tests gave the optimized arrange of factors as follows：ethanol concentration（70%-90%），solidliquid ratio（1∶15-1∶25），extraction time（10-25 min），ultrasonic wave（16-32 kHz）.Range analysis of orthogonal experiment showed that the influence of each factors in the extraction of anthocyanidin was ultrasonic wave＞ethanol concentration＞solid-liquid ratio＞extraction time.The best extraction condition was ratio of solid-liquid 1∶25，70%ethanol as solvent，24 kHz ultrasonic waveextractwith 12mineachtime.By theoptimizedextraction technology，theextractionratioof anthocyanidinwas0.42%. ConclusionThe extraction technology is feasible with efficient and simple process.

Paeoniaostii Flower；anthocyanidin；colorimetric determination；extraction technology

TQ461；R284．2；R282．71

A

1006－4931（2016）16－0014－04

國家自然科學基金資助項目，項目編號：31070328。

張志超（1992-），男，碩士研究生，研究

方向為中藥藥效物質基礎，（電子信箱）zhangzc5@ 163.com；張宏桂（1955-），男，教授，主要研究方向為中藥藥效物質的應用及體內代謝，本文通訊作者，（電話）010-84738642（電子信箱）bzy714@163.com。

（2016－05－01）