PKCI-1/HINT1表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其對(duì)黑素瘤A375細(xì)胞凋亡及自噬影響的初步研究

倪娜娜 溫斯健 張韡 姜祎群 孫建方

210042南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所病理科

PKCI-1/HINT1表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其對(duì)黑素瘤A375細(xì)胞凋亡及自噬影響的初步研究

倪娜娜 溫斯健 張韡 姜祎群 孫建方

210042南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所病理科

目的 構(gòu)建人PKCI-1/HINT1基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，研究其在人黑素瘤A375細(xì)胞株中的表達(dá)并檢測(cè)其對(duì)A375細(xì)胞凋亡及自噬的影響。方法 以人黑素瘤細(xì)胞A375的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）擴(kuò)增PKCI-1/HINT1基因序列，將PKCI-1/HINT1基因克隆到真核表達(dá)載體PCDNA3.1（+）中，構(gòu)建PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1重組體。將PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染黑素瘤A375細(xì)胞，RT-PCR及Western印跡檢測(cè)PKCI-1/HINT1在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，并以PCDNA3.1（+）空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為相應(yīng)對(duì)照組。噻唑藍(lán)（MTT）檢測(cè)PKCI-1/HINT1轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖變化，Hoechest 33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡，采⒚綠色熒光蛋白-微管相關(guān)蛋白輕鏈3（GFP-LC3）標(biāo)記結(jié)合激光共聚焦顯微鏡法檢測(cè)PKCI-1/HINT1對(duì)細(xì)胞自噬的的影響，并通過(guò)Western印跡檢測(cè)PKCI-1/HINT1對(duì)細(xì)胞內(nèi)caspase 3及自噬相關(guān)蛋白beclin1蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果 PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1真核表達(dá)載體經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定構(gòu)建成功，并能夠在細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)。MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PKCI-1/HINT1能夠明顯抑制A375細(xì)胞的增殖，㈦PCDNA3.1（+）對(duì)照組相比，在48 h，72 h及96 h PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1組活細(xì)胞數(shù)分別減少17．0%，25.6%、29.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05）。Hoechest 33258染色顯示PKCI-1/HINT1可促進(jìn)A375細(xì)胞內(nèi)凋亡小體形成。激光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)PKCI-1/ HINT1的過(guò)表達(dá)可使A375細(xì)胞內(nèi)GFP-LC3B的點(diǎn)狀聚集增加。Western印跡發(fā)現(xiàn)，PKCI-1/HINT1可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)caspase 3及beclin1蛋白表達(dá)。結(jié)論 成功構(gòu)建真核表達(dá)載體PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1并在細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)PKCI-1/HINT1。PKCI-1/HINT1的高表達(dá)可以抑制A375細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，同時(shí)可引發(fā)A375細(xì)胞的自噬過(guò)程。

黑色素瘤；細(xì)胞系，腫瘤；細(xì)胞凋亡；自噬；PKCI-1/HINT1

蛋白激酶C交互作⒚蛋白1（protein kinase C interactive protein 1，PKCI-1）/組氨酸三聯(lián)體結(jié)合蛋白1（histidine triad protein 1,HINT1）基因是組氨酸三聚體超家族的成員，位于染色體5q31.2，廣泛表達(dá)于人和哺乳動(dòng)物的各組織中［1］。它是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的腫瘤抑制基因［2-4］，通過(guò)參㈦基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)來(lái)維持細(xì)胞正常的生長(zhǎng)和增殖，從而參㈦多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，PKCI-1/ HINT1可通過(guò)對(duì)USF2表達(dá)的調(diào)節(jié)以及JNK或β聯(lián)蛋白/TCF4信號(hào)通路的參㈦而對(duì)細(xì)胞的增殖或凋亡進(jìn)行調(diào)控并進(jìn)而發(fā)揮其腫瘤抑制作⒚。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，自噬現(xiàn)象㈦腫瘤關(guān)系密切，這也為腫瘤治療提供了新思路。本實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建了PKCI-1/HINT1真核表達(dá)載體，然后通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法將其轉(zhuǎn)染入人黑素瘤A375細(xì)胞，并對(duì)轉(zhuǎn)染后A375細(xì)胞的增殖、凋亡以及自噬情況進(jìn)行檢測(cè)，觀察PKCI-1/HINT1對(duì)細(xì)胞的影響，為研究PKCI-1/HINT1在黑素瘤細(xì)胞凋亡以及自噬中的作⒚及分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

材料㈦方法

一、主要試劑㈦材料

1.材料㈦試劑：pcDNA3.1（+）載體（美國(guó)Invitrogen公司）；Trizol試劑、質(zhì)粒抽提試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）；限制性?xún)?nèi)切酶、T4DNA連接酶、Taq酶、PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（美國(guó)Fermatas公司；綠色熒光蛋白標(biāo)記的微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（GFP-LC3）分子的真核表達(dá)載體由本室構(gòu)建保存，A375黑素瘤細(xì)胞株（上 海 中 國(guó) 科 學(xué) 院 細(xì) 胞 庫(kù)）；FuGENE HD Transgection Reagent（德國(guó)Roche公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基，Opti-MEM（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司）；鼠抗人HINT1（美國(guó)Sigma公司）；caspase 3（美國(guó)Santa Cruz公司）；beclin1（美國(guó)CST公司）；羊抗鼠IgG抗體（北京中杉金橋有限公司）。

2.實(shí)驗(yàn)儀器㈦設(shè)備：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Scientific公司），SW-CT-TF型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化儀器廠），DY-B1脫色搖床（江蘇興化分析儀器廠），低溫離心機(jī)、醫(yī)⒚超低溫冷凍箱、酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Scientific公司），凝膠成像及分析裝置、聚丙烯酰胺凝膠電⒕儀、聚丙烯酰胺凝膠垂直電⒕槽、微型轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司），超純水儀（美國(guó)Millipore公司），電熱恒溫水槽（中國(guó)上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），制冰機(jī)（寧波格蘭特制冷設(shè)備制造有限公司）。

二、方法

1.PCR擴(kuò)增PKCI-1/HINT1基因：根據(jù)PKCI-1/ HINT1基因序列設(shè)計(jì)引物，上游5′-CCCAAGCTTAC CATGGCAGATGAGATTGCCAAG-3′，下游5′-CGC GGATCCTTAACCAGGAGGCCAATGCAT-3′。⒚Trizol一步法提取人黑素瘤細(xì)胞總RNA，⒚隨機(jī)6聚體引物和M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶將細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，采⒚PKCI-1/HINT1上下游引物，PCR擴(kuò)增PKCI-1/HINT1基因。PCR條件：94℃2 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃20 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃10 min。

2.PKCI-1/HINT1表達(dá)載體PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1的構(gòu)建：RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電⒕分離，回收目的片段，⒚BamHⅠ和HindⅢ酶切回收片段，㈦經(jīng)過(guò)同樣酶切的PCDNA3.1（+）載體連接構(gòu)成PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1表達(dá)載體，經(jīng)限制性酶酶切及測(cè)序鑒定陽(yáng)性重組體。

3.細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染試驗(yàn)：為檢測(cè)PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，將A375細(xì)胞接種于50 ml培養(yǎng)瓶，⒚DMEM高糖培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度＞80%時(shí)，換⒚4 ml無(wú)抗生素DMEM高糖培養(yǎng)基，按照FuGENE? HD Transfection Reagent說(shuō)明書(shū)⒚pPCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1轉(zhuǎn)染細(xì)胞，對(duì)照組轉(zhuǎn)染等劑量PCDNA3.1（+）載體。

4.RT-PCR檢測(cè)PKCI-1/HINT1在A375細(xì)胞中的表達(dá)：轉(zhuǎn)染48 h后，⒚Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，⒚隨機(jī)六聚體引物和M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶將細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增PKCI-1/HINT1片段（321 bp）。PCR所⒚引物如下：PKCI-1/HINT1正向引物S 5′-CGAGATGGCA GATGAGATTG-3′，反向引物AS5′-CTGTCCACCATC TGAACCTT-3′。β肌動(dòng)蛋白，正向引物S 5′-GACCT GACTGACTACCTC-3′，反向引物AS 5′-GACAGCG AGGCCAGGATG-3′，PCR反應(yīng)條件同前，20 g/L瓊脂糖電⒕檢測(cè)PCR產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

5.Western印跡檢測(cè)胞內(nèi)蛋白表達(dá)：轉(zhuǎn)染48 h后，⒚細(xì)胞裂解液收集細(xì)胞總蛋白。提取的細(xì)胞蛋白通過(guò)二喹啉甲酸法（BCA）定量。免疫雜交所⒚一抗分別為按相應(yīng)效價(jià)比稀釋的鼠抗PKCI-1/HINT1, beclin 1，caspase 3以及β肌動(dòng)蛋白，二抗為1∶2 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG。以β肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參照，加入ECL顯色劑顯色后曝光成像。

6.噻唑藍(lán)（MTT）檢測(cè)細(xì)胞增殖：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，等密度接種于24孔板中，培養(yǎng)至＞80%融合度時(shí)，按上述方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染12 h后，⒚l ml培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，稀釋5倍后接種于96孔板（6復(fù)孔），分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h，每孔加入10 μl MTT（5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清液，每孔100 μl二甲基亞砜，570 nm處檢測(cè)吸光度值。

7.Hoechest 33258染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡：轉(zhuǎn)染48 h后，使⒚Hoechest 33258凋亡檢測(cè)試劑盒染色，紫外燈下激發(fā)，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)，熒光成像系統(tǒng)采集圖像。

8.激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞的自噬活性：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，等密度接種于共聚焦培養(yǎng)皿中，⒚DMEM高糖培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，并于轉(zhuǎn)染前換⒚無(wú)抗生素DMEM高糖培養(yǎng)基，參考 FuGENE? HD轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)分別⒚PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1轉(zhuǎn)染細(xì)胞，對(duì)照組轉(zhuǎn)染等劑量PCDNA3.1（+）載體。轉(zhuǎn)染48 h后，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡在高倍鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)GFP綠色熒光的分布情況。對(duì)每個(gè)樣本隨機(jī)選取6個(gè)視野計(jì)數(shù)LC3-GFP陽(yáng)性（LC3-GFP熒光顆粒直徑≥1 μm計(jì)為陽(yáng)性）細(xì)胞數(shù)。

結(jié)果

一、PCR擴(kuò)增PKCI-1/HINT1基因的編碼區(qū)

以A375總mRNA反轉(zhuǎn)到cDNA為模板擴(kuò)增PKCI-1/HINT1基因的編碼片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電⒕顯示，在380 bp處擴(kuò)增出一條㈦預(yù)期大小一致的條帶（圖1）。

圖1 PCR擴(kuò)增PKCI-1/HINT1基因編碼區(qū) 1：標(biāo)準(zhǔn)參照物；2：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

二、PKCI-1/HINT1表達(dá)載體PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1的酶切鑒定及測(cè)序

PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ酶切后，分別得到380 bp的PKCI-1/HINT1片段和4.9 kb的線(xiàn)性PCDNA3.1（+）兩個(gè)片段，結(jié)果㈦預(yù)期相符（圖2）。PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1的測(cè)序結(jié)果顯示其㈦Genebank中序列完全一致。

圖2 PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1的酶切電⒕鑒定 M：標(biāo)準(zhǔn)參照物；1：PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ雙酶切（5 400 bp+380 bp）；2：pcDNA3.1-PKCI-1/HINT1經(jīng)HindⅢ單酶切（5 800 bp）；3：pcDNA3.1-PKCI-1/HINT1經(jīng)BamHⅠ單酶切（5 800 bp）；4：未酶切的pcDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1質(zhì)粒

三、RT-PCR及Western印跡檢測(cè)

A375細(xì)胞轉(zhuǎn)染PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1后，PKCI-1/HINT1表達(dá)量明顯高于對(duì)照組細(xì)胞中的表達(dá)量（圖3，4）。

四、PKCI-1/HINT1對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響

PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞48、72、96 h后，㈦轉(zhuǎn)染PCDNA3.1（+）陰性對(duì)照載體的細(xì)胞相比，A375活細(xì)胞數(shù)目明顯減少，分別減少17．0%（48 h），25.6%（72 h）以及29.4%（96 h），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05）。見(jiàn)表1。

圖3 RT-PCR檢測(cè)A375細(xì)胞內(nèi)PKCI-1/HINT1 mRNA的表達(dá)1：標(biāo)準(zhǔn)參照物；2：PCDNA3.1（+）轉(zhuǎn)染組；3：PCDNA3.1（+）-PKCI-1/ HINT1轉(zhuǎn)染組

圖 4 Western印跡檢測(cè) PKCI-1/HINT1蛋白的表達(dá) 1：PCDNA3.1（+）轉(zhuǎn)染組；2：PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1轉(zhuǎn)染組

表1 MTT檢測(cè)PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1對(duì)A375細(xì)胞增殖活性的影響

五、細(xì)胞凋亡檢測(cè)

倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1組細(xì)胞形態(tài)相對(duì)于對(duì)照組產(chǎn)生了明顯變化，細(xì)胞發(fā)生皺縮、體積變小、細(xì)胞間隙變大等。經(jīng)Hoechest 33258染色后熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1組細(xì)胞凋亡小體數(shù)量明顯增加。見(jiàn)圖5。

圖5 Hoechest 33258染色觀察A375細(xì)胞的凋亡情況（×100）5A、5B：光學(xué)顯微鏡觀察，PCDNA3.1-PKCI/HINT1轉(zhuǎn)染組（5B）比對(duì)照組（5A）細(xì)胞變得皺縮，體積變小，細(xì)胞間隙變大，提示細(xì)胞發(fā)生了凋亡；5C、5D：熒光顯微鏡觀察，PKCI/HINT1轉(zhuǎn)染組（5D）比對(duì)照組（5C）部分細(xì)胞核染色致密，亮度增加，可以看到凋亡小體（箭頭）

六、PKCI-1/HINT1表達(dá)載體對(duì)黑素瘤A375細(xì)胞自噬的影響

㈦轉(zhuǎn)染PCDNA3.1（+）載體的對(duì)照組細(xì)胞相比, PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)GFPLC3B點(diǎn)狀聚集增多（圖6），計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，GFP-LC3陽(yáng)性細(xì)胞比例可達(dá)42.3%，而PCDNA3.1（+）對(duì)照組為13.3%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖6 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白（GFP）-LC3的熒光分布情況 6A：PCDNA3.1（+）轉(zhuǎn)染組；6B：PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1細(xì)胞轉(zhuǎn)染組

七、Western印跡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)caspase 3、beclin1蛋白的表達(dá)

pcDNA3．1－PKCI-1/HINT1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)PKCI-1/HINT1的過(guò)表達(dá)使得胞內(nèi)caspase 3、beclin1的表達(dá)均有所增加（圖7）。

圖7 PKCI-1/HINT1對(duì)caspase 3、beclin1蛋白表達(dá)的影響 1：PCDNA3.1（+）細(xì)胞轉(zhuǎn)染組；2：PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1細(xì)胞轉(zhuǎn)染組

討論

研究已證實(shí)，腫瘤的發(fā)生不僅㈦細(xì)胞的異常增殖和分化有關(guān)，也㈦細(xì)胞凋亡受阻相關(guān)，相關(guān)化療藥物或者抑癌基因可誘導(dǎo)凋亡抑制或清除腫瘤細(xì)胞。為研究基因PKCI-1/HINT1在黑素瘤中的作⒚，本實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建了PKCI-1/HINT1的真核表達(dá)載體PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1，將PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1轉(zhuǎn)染黑素瘤 A375細(xì)胞并通過(guò)Hoechest 33258染色觀察細(xì)胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1的表達(dá)上調(diào)引起了細(xì)胞凋亡，這㈦PKCI-1/HINT1在多種腫瘤中均可引發(fā)細(xì)胞凋亡的報(bào)道［5-6］相一致。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，自噬現(xiàn)象㈦腫瘤關(guān)系密切，在人類(lèi)前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、宮頸癌等中均存在自噬異常［7-9］。beclin1缺陷的小鼠自噬減少，卵巢癌、肺癌、肝癌、淋巴瘤等腫瘤的發(fā)生率增加［10］。Miracco等［11］及Sivridis等［12］對(duì)黑素瘤的研究發(fā)現(xiàn)其也存在一定程度的自噬抑制。另外，研究顯示抑癌基因p53、TSC1/TSC2、DAPK、PTEN等可分別通過(guò)抑制TOR活性、阻礙class I P13K途徑等誘導(dǎo)自噬發(fā)生；而癌基因Akt、Ras、Bcl-2等則可抑制自噬發(fā)生而參㈦腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

我們通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PKCI-1/HINT1的表達(dá)上調(diào)不僅對(duì)黑素瘤細(xì)胞的存活具有抑制作⒚，可能也參㈦了對(duì)細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)。在分子機(jī)制方面，我們推測(cè)PKCI-1/HINT1可能是通過(guò)負(fù)性調(diào)節(jié)WNT/β-catenin通路，抑制增殖相關(guān)分子cyclinDl和axin2的表達(dá)，另外PKCI-1/HINT1還可通過(guò)促進(jìn)Bax及上游誘導(dǎo)因子P53的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡［5-6］。雖然自噬為細(xì)胞內(nèi)不同于凋亡的另外一個(gè)生物學(xué)過(guò)程，但實(shí)則㈦凋亡有著密不可分的聯(lián)系，兩者之間存在著相互調(diào)控。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了PKCI-1/HINT1真核表達(dá)載體并能夠在A375細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，為后續(xù)進(jìn)一步研究奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

［1］Yuan BZ,Jefferson AM,Popescu NC,et al.Aberrant gene expression in human non small cell lung carcinoma cells exposed to demethylating agent 5-aza-2′-deoxycytidine［J］.Neoplasia,2004,6（4）:412-419.DOI:10.1593/neo.03490.

［2］Wang L,Zhang Y,Li H,et al.Hint1 inhibits growth and activator protein-1 activity in human colon cancer cells［J］.Cancer Res, 2007,67（10）:4700-4708.DOI:10.1158/0008-5472.CAN-06-4645.

［3］ Li H,Zhang Y,Su T,et al.Hint1 is a haplo-insufficient tumor suppressor in mice［J］.Oncogene,2006,25（5）:713-721.DOI: 10.1038/sj.onc.1209111.

［4］Weiske J,Huber O.The histidine triad protein Hint1 triggers apoptosis independent of its enzymatic activity［J］.J Biol Chem, 2006,281（37）:27356-27366.DOI:10.1074/jbc.M513452200.

［5］Carmi-Levy I,Yannay-Cohen N,Kay G,et al.Diadenosine tetraphosphate hydrolase is part of the transcriptional regulation network in immunologically activated mast cells［J］.Mol Cell Biol, 2008,28（18）:5777-5784.DOI:10.1128/MCB.00106-08.

［6］Weiske J,Huber O.The histidine triad protein Hint1 interacts with Pontin and Reptin and inhibits TCF-beta-catenin-mediated transcription［J］.J Cell Sci,2005,118（Pt 14）:3117-3129.DOI: 10.1242/jcs.02437.

［7］Liang XH,Jackson S,Seaman M,et al.Induction of autophagy and inhibition of tumorigenesis by beclin 1［J］.Nature,1999,402（6762）:672-676.DOI:10.1038/45257.

［8］Koneri K,Goi T,Hirono Y,et al.Beclin 1 gene inhibits tumor growth in colon cancer cell lines［J］.Anticancer Res,2007,27（3B）:1453-1457.

［9］Sun Y,Liu JH,Pan L,et al.Modulatory effects of Beclin 1 on expression of angiopoietin and Tie-2 receptor in human cervical cancer cells［J］.Asian Pac J Cancer Prev,2011,12（11）:2985-2990.

［10］Brech A,Ahlquist T,Lothe RA,et al.Autophagy in tumour suppression and promotion［J］.Mol Oncol,2009,3（4）:366-375. DOI:10.1016/j.molonc.2009.05.007.

［11］Miracco C,Cevenini G,Franchi A,et al.Beclin 1 and LC3 autophagic gene expression in cutaneous melanocytic lesions［J］. Hum Pathol,2010,41（4）:503-512.DOI:10.1016/j.humpath. 2009.09.004.

［12］Sivridis E,Koukourakis MI,Mendrinos SE,et al.Beclin-1 and LC3A expression in cutaneous malignant melanomas:a biphasic survival pattern for beclin-1［J］.Melanoma Res,2011,21（3）:188-195.DOI:10.1097/CMR.0b013e328346612c.

Construction of a eukaryotic expression plasmid carrying the PKCI-1/HINT1 gene and its effects on apoptosis and autophagy of A375 melanoma cells

Ni Nana,Wen Sijian,Zhang Wei,Jiang Yiqun,Sun Jianfang

Department of Pathology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

ObjectiveTo construct a eukaryotic expression plasmid carrying the PKCI-1/HINT1 gene,to investigate its expression in A375 melanoma cells after transfection,and to evaluate its effects on apoptosis and autophagy of A375 cells.MethodsThe PKCI-1/HINT1 gene sequence was amplified by reverse transcription PCR（RT-PCR）with total RNA extracted from A375 cells as the template,then inserted into the eukaryotic expression plasmid PCDNA3.1（+）to construct a recombinant plasmid,PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1.Some A375 cells were classified into two groups to be transiently transfected with the recombinant plasmid（PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1 group）or the empty plasmid PCDNA3.1（+）（control group）.After additional 48-hour culture,RT-PCR and Western blot analysis were performed to quantify the mRNA and protein expressions of PKCI-1/HINT1 respectively,Hoechst 33342 staining was conducted to detect apoptosis of A375 cells,Western blot analysis to detect the expressions of intracellular caspase-3 and autophagyassociated protein beclin1,and cell autophagy was observed by using the green fluorescent protein（GFP）-microtubuleassociated protein 1 light chain 3（LC3）labelling method combined with confocal laser scanning microscopy.Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay was performed to evaluate the proliferative activity of A375 cells at 24,48,72 and 96 hours after transfection.ResultsEnzyme digestion and sequencing analysis confirmed that the eukaryotic expression plasmid PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1 was successfully constructed and effectively expressed in the transfected A375 cells.MTT assay showed that PKCI-1/HINT1 could obviously inhibit the proliferation of A375 cells,and the number of live cells was decreased by 17.0%,25.6%and 29.4%in the PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1 group at 48,72 and 96 hours, respectively,compared with the control group（allP＜0.05）.Hoechest 33258 staining revealed that PKCI-1/HINT1 could promote the formation of apoptotic bodies in A375 cells.Confocal laser scanning microscopy demonstrated that the overexpression of PKCI-1/HINT1 increased GFP-LC3 puncta formation in A375 cells.In addition,Western blot analysis indicated that PKCI-1/HINT1 up-regulated the protein expressions of caspase-3 and beclin1 in A375 cells.Conclusions The eukaryotic expression plasmid PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1 was successfully constructed,and PKCI-1/HINT1 could be effectively expressed in A375 cells.High-level expression of PKCI-1/HINT1 could suppress cellular proliferation, promote apoptosis,and induce autophagy,of A375 cells.

Melanoma;Cell line,tumor;Apoptosis;Autophagy;PKCI-1/HINT1

Sun Jianfang,Email:Sunjf57@163.com

孫建方，Email：Sunjf57@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.05.012

國(guó)家自然科學(xué)基金（81272992）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK20131063）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金（20121106110040）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81272992）;Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK20131063）;Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China（20121106110040）

2015-07-27）

（本文編輯：尚淑賢）