氣候變暖背景下泥炭蘚泥炭地酚氧化酶和過氧化物酶活性的研究

Vincent E. J. Jassey， Geneviève Chiapusio， Daniel Gilbert， Marie-Laure Toussaint， Philippe Binet著胡雪鳳卜兆君譯

（1 法國弗朗什孔泰大學工業技術管理應用系，年代環境實驗室 蒙貝利亞爾 25211 2 東北師范大學草地科學研究所 長春 130024 3 東北師范大學地理科學學院泥炭沼澤研究所，國家環境保護濕地生態與植被恢復重點實驗室長春 130024）

氣候變暖背景下泥炭蘚泥炭地酚氧化酶和過氧化物酶活性的研究

Vincent E. J. Jassey1， Geneviève Chiapusio1， Daniel Gilbert1， Marie-Laure Toussaint1， Philippe Binet1著胡雪鳳2卜兆君3*譯

（1 法國弗朗什孔泰大學工業技術管理應用系，年代環境實驗室 蒙貝利亞爾 25211 2 東北師范大學草地科學研究所 長春 130024 3 東北師范大學地理科學學院泥炭沼澤研究所，國家環境保護濕地生態與植被恢復重點實驗室長春 130024）

泥炭地主要氧化酶在各個季節均會面臨氣候脅迫，但目前缺乏氧化酶特征及其對氣候脅迫響應方面的數據。在實驗增溫條件下、泥炭蘚蘚坪區，沿狹窄的礦養-雨養泥炭地梯度，測定了酚氧化酶和過氧化物酶的活性。發現，不管季節和采樣面積如何，泥炭蘚的過氧化物酶活性均比酚氧化物酶活性高出1000倍以上。氣溫升高（平均1 ℃）使過氧化物酶活性增加（30%），但增溫不改變酚氧化酶的活性。結果表明，泥炭地過氧化物酶活性的監測可作為反映氣候變暖對泥炭地碳循環影響的一個合適的且有預見性的指標。

2，7-二氨基芴 過氧化物酶 酚氧化酶 氣候變暖 泥炭地 開頂箱

細胞外酚氧化酶和過氧化物酶的測定能提供有關生態系統碳循環穩定性方面的重要信息。酚氧化酶和過氧化物酶通過促進簡單和復雜的酚類化合物的氧化或轉換，促進難分解物質部分或完全分解，最終作用于碳循環。由于持續的全球變暖，酚氧化酶和過氧化物酶在陸地碳庫如泥炭地中的活性引起了科學關注。泥炭土中的碳累積的部分原因是酶促分解的正常途徑受到了抑制，在該酶促分解過程中氧化性酶（如酚氧化酶）起著關鍵作用。

盡管參與多酚降解的酚氧化酶（PO）可分為O2依賴型PO（如漆酶、酪氨酸酶）和H2O2依賴型PO（如木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶），但目前為止，在泥炭地中主要研究了O2依賴型PO。在森林枯落物中，曾發現這兩種酚氧化酶具有不同的時空變化特征，突出反映出這些細胞外酶對環境改變無相似響應。因此，泥炭地缺少這些氧化性酶在生態環境和季節變動上的特征及其對氣候變暖響應的可用數據。

本研究的目的是，在泥炭地的兩個季節間，沿著礦養-雨養過渡梯度探究模擬增溫對泥炭地中O2依賴型PO和H2O2依賴型PO的影響。本研究不區分單個酶，選用通用術語酚氧化酶和過氧化物酶來分別描述以O2和H2O2為受體的酶的活性。

1　研究方法

1.1樣地選擇和實驗設計

2010年夏秋兩季，在位于法國朱羅山脈（46°49′35″N，6°10′20″E）的1個較大的礦養和雨養復合型泥炭地中進行酚氧化酶和過氧化物酶的研究。沿著從寡植物礦養泥炭地到隆起雨養泥炭地過渡的梯度設置樣地，植被組成以喙葉泥炭蘚（Sphagnum fallax）占優勢。采集喙葉泥炭蘚，從頭狀枝上部開始將其截成0～3 cm（活體片段，上部）和3～10 cm（衰老片段，下部）兩個部分。在礦養和雨養兩種泥炭地具有代表性的區域地表，各布設6個泥炭蘚樣方，其中3個為對照，3個為增溫處理。在2008年4月，通過在植被上方布設開頂箱（OTC）實現增溫處理。實驗期間持續監測每個樣方泥炭蘚表面上方10 cm處的氣溫。

1.2酶活測量

由于土壤有機質會影響酶活，因此采用一種特殊的方法制取酶提取液。取3 g喙葉泥炭蘚鮮樣放入含有0.05%（v/v）Tween 80及20 g PVPP的50 mL 0.1 mol/L的CaCl2溶液中，振蕩1 h后離心，將上清液過濾（0.2 μm），濾液裝入纖維素透析管（10 kDa的分子量截留），在管外覆蓋聚乙二醇進行吸收濃縮，直到濾液體積為初始體積的1/10時，將所得濃縮提取物置于pH為5.6的磷酸緩沖液中，制得酶提取懸濁液。通過分光光度法利用96孔的微量滴定板測定酶活。為了量化酚氧化酶，每個重復孔中加入150 μL的酶提取液，同時加入以下物質中的1種作為氧化底物，100 μL的左旋多巴（L-DOPA；10 mmol/L），或2 μL 2，7-二氨基芴（DAF；0.68 mmol/L；εM*= 10228 ［mol/（L·cm）］，或2 μL的丁香醛連氮［5 mmol/L；εM=mol/（L·cm）］或5 μL的ABTS［0.1 mmol/L；εM=36000 mol/（L·cm）］，分別在460、600、525、400 nm的波長下進行比色。過氧化物酶活性利用2 μL DAF（0.68 mmol/L）和10 μL H2O2（0.3% wt）做底物，錳過氧化物酶（Mn-peroxidases）用12 μL MnSO4（0.1 mmol/L）做底物，氧化率均在600 nm波長下測定。錳氧化物酶活性由錳過氧化物酶測試結果減去過氧化物酶活性得到。用12 μL藜蘆醇［0.4 mmol/L；εM=9300 mol/（L·cm）］和10 μL H2O2（0.3% wt）做底物，在310 nm波長下比色測定真菌木質素過氧化物酶。酶活以每分鐘氧化每克干物質底物的微摩數表述，單位是U/g DM。

1.3統計分析

利用重復測量方差分析方法，以時間（夏季和秋季）為組內變量，以增溫、研究區和泥炭蘚的深度為組間變量，分析不同泥炭蘚片段、樣地、季節和增溫處理間的酚氧化酶和過氧化物酶的差異。同時考慮樣地、季節和增溫的交互作用。進行假設性參數檢驗。利用相同方法檢測對照樣方和增溫樣方間的空氣和土壤溫度差異。

2　結果與討論

2.1酶活性量化過程中底物的選擇

研究結果表明：利用DAF做底物測得了酚氧化酶活性最大值。經歷1h酶動力學反應后在丁香醛連氮和 ABTS為底物的孔中出現了沉淀。已有研究發現，時間尺度上丁香醛連氮和ABTS產生的醌類不溶于水相介質。利用DAF底物測定酚氧化酶活性，發現在泥炭蘚的不同片段，以及礦養和雨養兩種樣地間均呈顯著差異，但利用L-DOPA底物測定時無顯著差異（圖1）。因此，DAF是量化泥炭蘚泥炭地酚氧化酶活性的理想底物。

2.2酚氧化酶與過氧化物酶活性比較

本研究發現過氧化物酶活性比酚氧化酶活性高出1000倍（圖1，圖2），過氧化物酶構成泥炭蘚泥炭地的主要氧化系統。根據目前已有文獻，雖然在森林枯落物表層曾發現過氧化物酶活性比酚氧化酶活性高出120倍，但活性高出1000倍的則十分罕見。此外，該種高活性比例強烈表明過氧化物酶具有植物來源，其原因主要體現在以下幾個方面：（1） 泥炭蘚強烈占據礦養和雨養泥炭地；（2） DAF-H2O2組合是測定植物過氧化物酶的最敏感的底物；（3） 無明顯的真菌木質素過氧化物酶活性證明泥炭蘚是高過氧化物酶活性的來源；（4） 從泥炭蘚枯落物中鑒定出的不同真菌類群中，僅有24%可以產生過氧化物酶；（5） 泥炭地非生物條件（如酸性和滯水）在很大程度上被認為是限制真菌氧化活性的。

2.3泥炭蘚上部與下部的過氧化物酶活性比較

過氧化物酶活性在泥炭蘚片段上部顯著高于下部，夏季顯著高于秋季（圖2）。這表明，過氧化物酶活性與多酚含量存在正相關關系。

2.4增溫對酚氧化酶和過氧化物酶的影響

開頂箱設置使得2個樣地的日均氣溫平均增加1 ℃。溫度升高對酚氧化酶的活性無顯著影響。但增溫使礦養地區的過氧化物酶活性顯著升高30%，尤其是在0～3 cm的泥炭蘚上部活性片段（圖2）。礦養-雨養泥炭地間過氧化物酶活性對增溫響應表明，氧化庫沿不同方向變化來應對氣候變暖，這與之前酚類化合物所示結果相同。雖然增溫可增強過氧化物酶活性，但由于過氧化物酶在礦化和腐殖化過程中均存在功能多樣性，因此全球變暖對泥炭地土壤有機質固持影響仍難以預測。

3　結論

從研究結果可得出以下3個結論：（1） DAF是量化泥炭蘚蘚坪提取物中酚氧化酶和過氧化物酶活性的有效氧化底物；（2） 泥炭蘚過氧化物酶構成泥炭蘚泥炭地主要的氧化系統；（3） 泥炭地植物過氧化物酶活性的監測是指示氣候變暖情況下泥炭地碳循環改變的有效長遠指標。

說明：文中εM表示濃度為1 mol/L，厚度為1 cm的溶液在最大吸收波長下的吸光值。

（略）

譯自：Soil Biology & Biochemistry，2012，46：49～52。

Phenoloxidase and Peroxidase Activities in Sphagnum-dominated Peatland in a Warming Climate

Vincent E. J. Jassey1， Geneviève Chiapusio1， Daniel Gilbert1， Marie-Laure Toussaint1， Philippe Binet1write Hu Xuefeng2， Bu Zhaojun3*translate
（1 Laboratoire Chrono-Environnement， UFR Sciences， Techniques et gestion de l'industrie， Université de Franche-Comté， Montbéliard cedex， France， 25211 2 Institute of Grassland Science， Northeast Normal University， Changchun， 130024 3 Institute for Peat and Mire Research， School of Geographical Science Northeast Normal University， State Environmental Protection Key Laboratory of Wetland Ecology and Vegetation Restoration， Changchun， 130024）

Peatlands still suffer from the scarcity of available data about the characterization and the response to climate forcing of the main oxidative enzymes that occur over the seasons. In the present study， phenoloxidase and peroxidase activities were examined in Sphagnum lawns along a narrow fen-bog gradient under experimental elevated temperatures. We showed that peroxidase activities from Sphagnum mosses were 1000-fold higher than those of phenoloxidases irrespective of seasons and sampling areas. Peroxidase activities increased （+30%） with the rise of air temperatures （an average of 1 ℃）， while warming didnot alter phenoloxidase activities. These results suggest that the monitoring of peroxidase activities in peatlands may represent a suitable and forward indicator of the impact of climate warming on carbon cycle in peatlands.

2，7-diaminofluorene； peroxidases； phenoloxidases； climate warming； peatland； open top chambers

TQ314.1，S156.2

A

1671-9212（2016）05-0034-04

2016-07-15

胡雪鳳，1991年生，碩士研究生，主要從事濕地科學與生態學研究。*通訊聯系人：卜兆君，男，教授，E-mail：buzhaojun@nenu.edu.cn。