神經調節蛋白1對體外循環心臟停搏大鼠的心肌保護作用研究

羅志方，江美蘭，李章紅，李文通

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·論著·

神經調節蛋白1對體外循環心臟停搏大鼠的心肌保護作用研究

羅志方，江美蘭，李章紅，李文通

目的探討神經調節蛋白1(NRG-1)對體外循環(CPB)心臟停搏大鼠的心肌保護作用。方法選取成年健康雄性SD大鼠30只，隨機分為正常對照組、模型組、NRG-1預處理組，每組10只。B、C組大鼠參照文獻建立CPB模型，NRG-1預處理組大鼠在CPB心臟停搏前30 min腹腔注射NRG-1，正常對照組大鼠置于恒溫干凈環境中正常喂養。比較3組大鼠血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)水平及血漿內皮素(ET)、血栓素A2(TXA2)、前列環素(PGI2)水平。結果模型組和NRG-1預處理組大鼠血清CK-MB、LDH、MDA水平及血漿ET、TXA2水平高于正常對照組，血清SOD、GSH-Px水平及血漿PGI2水平低于正常對照組(P<0.05)；NRG-1預處理組大鼠血清CK-MB、LDH、MDA水平及血漿ET、TXA2水平及低于模型組，血清SOD、GSH-Px水平及血漿PGI2水平高于模型組(P<0.05)。結論CPB可引起心臟停搏大鼠心肌損傷，NRG-1對CPB心臟停搏大鼠具有一定心肌保護作用。

體外循環；心臟停搏；神經調節蛋白1；心肌；模型，動物

羅志方，江美蘭，李章紅，等.神經調節蛋白1對體外循環心臟停搏大鼠的心肌保護作用研究[J].實用心腦肺血管病雜志，2016，24(9)：55-58.[www.syxnf.net]

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體外循環又稱心肺轉流(CPB)，是一種將回心靜脈血引流出來，經氧合器氧化后再回輸到動脈系統進行組織灌注以維持呼吸循環功能的過程。目前，中等程度低溫CPB及間斷灌注冷心臟停搏液一直是心內科手術過程中進行心肌保護的主要方法，但低溫CPB所產生的一系列不良反應以及心臟停搏復搏后的再灌注損傷一直是影響心臟外科手術進一步進展和效果的難題，因此不斷摸索心肌保護方法是當前臨床心臟外科研究的重點之一。

神經調節蛋白-1(NRG-1)是一種由心臟內皮細胞分泌的重要信號蛋白。NRG-1與表皮生長因子受體(ErbB)的結合具有高度選擇性，與酪氨酸激酶受體(ErbB4)結合可誘導產生表皮生長因子受體2(ErbB2)/ErbB4異源二聚體，進而產生一系列生物學效應?，F代研究表明，NRG-1/ErbB信號通路與心臟結構形成、心功能維持、心力衰竭的發生發展密切相關[1]。本研究通過建立深低溫CPB心臟停搏大鼠模型，旨在探討NRG-1對大鼠的心肌保護作用，為NRG-1在CPB心臟手術中的應用提供參考，現報道如下。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物選取成年健康雄性SD大鼠30只，月齡2.5～4.5個月，體質量450～550 g，由贛南醫學院動物中心提供，動物合格證號：贛實動質字SCXK2008-006；飼養條件：相對恒溫干凈環境，同一飼料不同籠喂養。術前禁飲禁食10 h，按照贛南醫學院動物倫理委員會要求處理大鼠。將所有大鼠隨機分為正常對照組、模型組、NRG-1預處理組，每組10只。正常對照組大鼠平均月齡(3.5±0.5)個月，平均體質量(480±30)g；模型組大鼠平均月齡(3.5±0.8)個月，平均體質量(500±20)g；NRG-1預處理組大鼠平均月齡(3.5±0.6)個月，平均體質量(500±30)g。3組大鼠月齡(F=0.366)、體質量(F=1.542)比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.1.2實驗試劑2%戊巴比妥鈉注射液由宜昌市永諾藥業有限公司生產，規格：10 ml/支；NRG-1由上海康朗生物科技有限公司生產，規格：10 μg/支。

1.2實驗方法

1.2.1正常對照組正常對照組大鼠置于相對恒溫干凈環境中，同一飼料籠養觀察。

1.2.2模型組參照宋丹丹等[2]研究報道建立大鼠CPB模型并進行一定程度的改良：采用2%戊巴比妥鈉溶液50 mg/kg腹腔注射行全身麻醉，然后將監護儀連接至大鼠的左股動脈，回流靜脈血通過16G套管經右頸外靜脈置入右心房后轉流到儲血罐，經恒流蠕動泵輸送到大鼠專屬膜式氧合器進行氧合，再將氧合后的動脈血注入尾動脈，開始時轉速為40 ml·kg-1·min-1，逐漸增至100 ml·kg-1·min-1，并維持此轉速60 min。其中，血液降溫即將儲血罐或各引流管道放入冰水混合物中，體表和頭部則采取冰袋降溫，持續30 min，在此期間將血流量逐漸減至30 ml·kg-1·min-1，一般肛溫降至16～18 ℃。當大鼠出現深低溫CPB心臟停搏癥狀，監護儀顯示出一條直線時，則將轉流泵逐漸減低轉速至停機，關閉轉流泵，夾閉各引流管。CPB 30 min，血細胞比容(HCT)維持在20%～23%。30 min后開始轉流、升溫，將儲血罐和引流管道放入變溫水箱中，使其溫度緩慢升至37 ℃，同時進行體表復溫(用四盞200 W燈泡直接照射)，在升溫的同時逐步提高轉流量，并時刻監測大鼠的動脈壓等生命體征，使用熱血儀及加溫燈泡對其進行復溫，升溫時大鼠心臟自主復搏，復溫至37 ℃且CPB輔助維持60 min后停止轉流。模型建立完成后先拔除右心房靜脈插管，降低動脈灌注流量，待大鼠血壓恢復至實驗前水平后拔除尾動脈插管，繼而拔除左股動脈監測插管，繼續觀察大鼠生命體征，60 min后將大鼠處死并留取其心臟組織和血液送檢。

1.2.3NRG-1預處理組NRG-1預處理組大鼠在建立CPB心臟停搏前30 min腹腔注射NRG-1 5 μg/kg。模型建立及心臟停搏、復搏方法同模型組。

1.3觀察指標采用全自動生化分析儀檢測3組大鼠血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)及乳酸脫氫酶(LDH)水平；采用光電比色法檢測3組大鼠血清丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)水平；采用放射免疫法檢測大鼠血漿內皮素(ET)、血栓素A2(TXA2)及前列環素(PGI2)水平。

2　結果

模型組和NRG-1預處理組大鼠血清CK-MB、LDH、MDA水平及血漿ET、TXA2水平高于正常對照組，血清SOD、GSH-Px水平及血漿PGI2水平低于正常對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；NRG-1預處理組大鼠血清CK-MB、LDH、MDA水平及血漿ET、TXA2水平低于模型組，血清SOD、GSH-Px水平及血漿PGI2水平高于模型組，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

表1　3組大鼠觀察指標比較±s)

注：CK-MB=肌酸激酶同工酶，LDH=乳酸脫氫酶，SOD=超氧化物歧化酶，MDA=丙二醛，GSH-Px=谷胱甘肽過氧化物酶，ET=內皮素，TXA2=血栓素A2，PGI2=前列環素；與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

3　討論

NRG-1是一種由心臟內皮細胞分泌的重要信號蛋白，其可結合心肌細胞表面ErbB4，誘導產生ErbB2/ErbB4異源二聚體。NRG-1與ErbB家族的結合具有高度選擇性，其首先以高親和力的方式與心肌細胞膜上的ErbB4結合(在較高濃度時可與ErhB3結合)，誘導受體構象變化形成ErbB2/ErbB4(ErbB3)異源二聚體，繼而激活酪氨酸激酶，引起受體C末端酪氨酸磷酸化和反式酪氨酸磷酸化，為下游信號轉導分子提供結合位點，結合的蛋白可能是接頭蛋白、激酶或磷酸化的酪氨酸，繼而啟動細胞內信號級聯系統，包括NRG-1/ErbB信號系統、心臟型肌球蛋白輕鏈激酶(cMLCK)/肌球蛋白輕鏈(MLC-2v)信號系統、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蘇氨酸蛋白激酶(AkT)信號系統、細胞外調節蛋白激酶(ErK)信號系統和黏著斑激酶(FAK)信號系統等，進而發揮促進生長和保護心肌細胞的作用[3]。NRG-1/ErbB信號系統作用有精細的步驟，研究表明，存在NRG-1/ErbB信號系統缺陷的心肌細胞可通過抑制副交感神經活性而增強交感神經活性，這一機制可能有益于了解為何該信號系統被抑制時心力衰竭發生的危險性會增加[4]。近年漸有證據表明，NRG-1可通過結合酪氨酸激酶受體而發揮抗炎、調節細胞生長、抑制細胞凋亡、促進血管新生等多重效應，具有廣泛的心血管保護作用[5]。NRG-1的多重生物學效應在心臟微血管與心肌細胞間的信號轉導過程中具有重要作用[6]，加之其可調控RISK通路和JAK/STAT通路，可滿足全面激活內源性心肌保護機制的多靶點多效應要求；又有Ⅱ期臨床試驗證實，NRG-1可改善慢性心力衰竭患者的心功能，臨床運用安全且耐受性好[7]。采用NRG-1干預治療可同時觸發多種機制達到預防心肌缺血再灌注損傷的目的，因此，NRG-1是一種有潛力的心肌保護因子[8]。有研究結果顯示，造模前給予rhNRG-1對心肌梗死大鼠心率無明顯作用，但可減少大鼠心肌梗死面積，同時降低心肌Toll樣受體4(TLR4)的mRNA表達水平。因此，初步推測NRG-1可通過下調心肌TLR4的表達來抑制其下游炎性因子的進一步激活，從而減輕炎性反應、保護缺血心肌、減少心肌梗死面積[9]。近年來關于NRG-1的實驗研究發現，大鼠建立急性心肌梗死模型24 h后，其梗死區心肌TLR4 mRNA表達水平增加[10-11]。

研究CPB造成各臟器損傷的機制以及保護措施的關鍵在于建立接近臨床的CPB動物模型。理想的大鼠CPB模型應該是操作簡便、無血預充、主動脈順行灌注、全流量、可控性強和存活時間長，建立一個盡可能接近于現代臨床的實驗模型[12]。宋丹丹等[2]首次成功建立了無血預充CPB心臟停搏大鼠模型。以往研究大鼠心臟停搏復搏CPB模型多是離體實驗，多數選擇離體心臟Langendo-rf模型[13-14]，但該模型最大的問題是與臨床實際差距太大，且研究范圍有限。GOURLAY等[15]建立的大鼠CPB模型無心臟停搏復搏，持續并行循環，研究CPB期間并無心臟停搏造成的心肌損傷。而本實驗中建立的是無血預充深低溫心臟停搏CPB大鼠模型，其心臟停搏復搏過程接近臨床，完全無血預充，可排除異體血液對機體造成的損傷，避免異體血預充對動物實驗的影響。本實驗的改良之處如下：(1)采用直接深低溫誘發心室顫動心臟停搏技術改進大鼠心臟停搏CPB模型，可有效避免復雜的插管操作，比較安全；(2)采用自制冰毯降溫、中心降溫并將循環管道置入冰水混合物中；(3)復溫時體表升溫使用4盞100 W的燈泡直接照射加溫，中心復溫采用將儲血罐和引流循環管道沒入變溫水箱中加溫。但目前在深低溫CPB技術中仍缺乏完全有效的溫度控制，還需進一步改進。

CPB可暫時替代心肺臟器，既能保證心臟大血管手術的正常開展，又可保證其他重要臟器的基本供血，但其自身固有的不良反應及心臟停搏復搏后引起的心肌損傷一直影響著心臟外科的發展。心肌缺血再灌注損傷時，氧自由基生成增多，氧自由基的清除能力降低，從而造成心肌組織中的氧自由基大量蓄積，引起心肌組織的嚴重損傷。CK-MB是診斷心肌受損的一種特異性酶學指標；LDH是一種糖酵解酶，可催化乳酸脫氫生成丙酮酸；ET存在于血管內皮及各組織和細胞中，是調節心血管功能的重要因子，對維持基礎血管張力與心血管系統穩態具有重要作用；TXA2是一種常用血管收縮劑，可激活血小板，是治愈組織損傷和炎癥的常用藥，但也會導致心絞痛。因此，在心肌受損時血清CK-MB、LDH水平及血漿ET、TXA2水平均會明顯升高。SOD是廣泛存在于動、植物體內的一種金屬酶，其可催化超氧陰離子等自由基發生歧化反應，消除過剩的氧自由基及其衍生物，保護細胞免受損傷，心肌損傷時其水平會明顯降低；MDA是膜脂質過氧化物質，其水平高低間接反映了機體細胞受氧自由基攻擊的嚴重程度，SOD與MDA聯合檢測可反映組織細胞的氧化損傷程度；GSH-Px是機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶；心肌缺血再灌注損傷時，動脈血管內皮功能受損，嚴重影響冠狀動脈血管內皮細胞的PGI2合成，因此在心肌損傷時，血漿PGI2水平會明顯降低。本研究結果顯示，模型組和NRG-1預處理組大鼠血清CK-MB、LDH、MDA水平及血漿ET、TXA2水平高于正常對照組，血清SOD、GSH-Px水平及血漿PGI2水平低于正常對照組，證實CPB已對大鼠心肌造成損傷；NRG-1預處理組大鼠血清CK-MB、LDH、MDA水平及血漿ET、TXA2水平低于模型組，血清SOD、GSH-Px水平及血漿PGI2水平高于模型組，表明大鼠應用NRG-1預處理后可明顯減輕CPB對其造成的心肌損傷。因此，本實驗初步證實NRG-1對CPB心臟停搏大鼠具有一定的心肌保護作用。

綜上所述，CPB可引起心臟停搏大鼠心肌損傷，而NRG-1對CPB心臟停搏大鼠有一定心肌保護作用。由于本實驗中心為醫學院科研中心，基礎條件有限，建立大鼠CPB心臟停搏模型與臨床實際還有差距，如何建立理想的貼近臨床CPB心臟停搏大鼠模型將是今后實驗的重點；同時由于無電子顯微鏡，無法觀察應用NRG-1后大鼠心臟的細微結構變化，其具體作用還需要進一步探討。

作者貢獻：羅志方進行實驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；羅志方、李章紅、李文通進行實驗實施、評估、資料收集；羅志方、江美蘭進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：李越娜)

Myocardial Protective Effect of Neuregulin 1 in Rats with Cardiac Arrest under Cardiopulmonary Bypass

LUOZhi-fang，JIANGMei-lan，LIZhang-hong，LIWen-tong.

TheFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalCollege，Ganzhou341000，China

JIANGMei-lan，GanzhouHealthSchool，Ganzhou341000，China；E-mail：896728154@qq.com

Objective To investigate the myocardial protective effect of neuregulin 1(NRG-1)in rats with cardiac arrest under cardiopulmonary bypass(CPB).MethodsA total of 30 healthy adult male SD rats were selected and randomly divided into A group，B group and C group，each of 10 rats.Of B group and C group，CPB model was prepared according to the reported literatures，meanwhile rats of C group were given intraperitoneal injection of NRG-1 before 30 minutes of cardiac arrest；rats of A group were normally fed in constant temperature and clean environment.Serum levels of CK-MB，LDH，MDA，SOD and GSH-Px，plasma levels of ET，TXA2and PGI2were compared among the three groups.ResultsSerum levels of CK-MB，LDH and MDA，plasma levels of ET and TXA2of B group and C group were statistically significantly higher than those of A group，while serum levels of SOD and GSH-Px，plasma PGI2level of B group and C group were statistically significantly lower than those of A group(P<0.05)；serum levels of CK-MB，LDH and MDA，plasma levels of ET and TXA2of C group were statistically significantly lower than those of B group，while serum levels of SOD and GSH-Px，plasma PGI2level of C group were statistically significantly lower than those of B group(P<0.05).ConclusionCPB may cause myocardial damage in rats with cardiac arrest，while NRG-1 has certain myocardial protective effect in rats with cardiac arrest under CPB.

Extracorporeal circulation；Heart arrest；Neuregulin-1；Myocardium；Models，animal

江西省教育廳科學技術研究項目(14689)

341000江西省贛州市，贛南醫學院第一附屬醫院(羅志方，李章紅，李文通)；贛州衛生學校(江美蘭)

江美蘭，341000江西省贛州市，贛州衛生學校；

E-mail：896728154@qq.com

R 541.78

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2016.09.014

2016-06-08；

2016-08-22)