同一層面裸鼠移植瘤PET/CT圖像18F-FLT攝取量與Ki-67表達的關系

李澄明，張曉麗，張建波，孫新東，于金明，孟雪

(1濟南大學·山東省醫學科學院醫學與生命科學學院，濟南 250012；2山東省腫瘤醫院；3武漢大學人民醫院)

?

同一層面裸鼠移植瘤PET/CT圖像18F-FLT攝取量與Ki-67表達的關系

李澄明1,2，張曉麗2,3，張建波2，孫新東2，于金明2，孟雪2

(1濟南大學·山東省醫學科學院醫學與生命科學學院，濟南 250012；2山東省腫瘤醫院；3武漢大學人民醫院)

目的觀察同一層面裸鼠移植瘤PET/CT圖像18F-FLT攝取量與Ki-67表達的關系。方法10只雌性BALB/c型裸鼠，建立裸鼠移植瘤模型，裸鼠在體瘤及離體瘤接受18F-FLT PET/CT掃描，在PET圖像上勾畫感興趣區計算18F-FLT標準攝取值(SUV)的最大值(SUVmax)、平均值(SUVmean)，并在病理切片上檢測對應位置的Ki-67，采用斯皮爾曼秩和檢驗觀察SUV與Ki-67指數的關系。結果離體瘤與在體瘤的SUVmax、SUVmean比較差異無統計學意義。離體瘤SUVmax與Ki-67指數呈正相關(r=0.763，P<0.001)，SUVmean與Ki-67指數亦呈正相關(r=0.575,P=0.013)。結論同一層面裸鼠移植瘤PET/CT圖像18F-FLT攝取量與Ki-67表達具有一致性。

非小細胞肺癌；18F-FLT PET/CT攝取量；細胞增殖；Ki-67指數；放射治療

非小細胞肺癌(NSCLC)患者局部復發率高、預后差，增加病灶的放療劑量可降低復發率并提高總生存，但放療引起的不良反應會限制劑量增加[1]。靶區的大小是影響劑量增加的重要因素，PET圖像可定義腫瘤的生物靶區。因此，為避免高劑量引起的組織損傷，可參考PET掃描來勾畫靶區[2]。腫瘤細胞增殖與NSCLC等多種腫瘤的預后有關[3]。Ki-67指數是評價細胞增殖的金標準[4]，但Ki-67指數只能通過活檢標本或者切除的腫瘤組織計數，因此需要一種無創可重復的方法評價細胞增殖。18F-FLT被認為是可在體反映細胞增殖的示蹤劑[5,6]，已被應用到多種細胞系的體外實驗中[7]。應用腫瘤模型及腫瘤患者進行的在體研究[8,9]表明，腫瘤總體的18F-FLT攝取與特異性腫瘤增殖指標(Ki-67指數)有相關關系。但這些研究沒有進行示蹤劑攝取分布與病理細胞增殖區域的空間位置對比。有文獻[10]認為18F-FLT攝取的量級尚無充分理由作為評價細胞增殖高低的指標。18F-FLT示蹤劑濃聚多的區域給予高劑量的放療是否能真正提高腫瘤的控制率有待驗證。本研究通過18F-FLT PET圖像與病理切片層對層之間的對比，觀察同一層面裸鼠移植瘤PET/CT圖像18F-FLT攝取量與Ki-67表達的關系，明確18F-FLT攝取量與腫瘤細胞增殖的關系，從而指導臨床放療的劑量雕刻。

1　材料與方法

1.1細胞培養 A549細胞系購自中科院上海細胞所。細胞培養應用RPMI1640培養基(Gibco,美國)，加入10%的胎牛血清(FBS,Gibco,美國)、鏈霉素100 μg/mL、青霉素100 U/mL(Gibco,美國)，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的孵育箱中常規傳代培養。

1.2裸鼠移植瘤模型的建立 5～6周齡的雌性BALB/c型裸鼠10只，購自北京華阜康生物科技公司，動物生產許可證號：SCXK[京]2009-0008。于山東省腫瘤醫院基礎實驗中心動物房無特定病原體(SPF級)條件下飼養，標準顆粒飼料、飲用水、墊料等所有物品均經滅菌處理。動物房保持26 ℃的恒溫及50%～60%的相對濕度。取指數生長期的A549細胞，經消化后，用平衡鹽溶液調整細胞濃度為2×107/mL，在無菌條件下，每只BALB/c型裸鼠右后肢皮下注射A549細胞懸液100 μL(含有2×106個細胞)。用游標卡尺測量腫瘤直徑。當腫瘤的平均直徑達到8 mm時即進行PET顯像。

1.318F-FLT PET/CT顯像及18F-FLT攝取量計算使用PET-MF-2V-IT-I型氟多功能合成模塊制備18F-FLT，合成方法如文獻[11]所述。用Inveon DPET(美國西門子公司)進行小動物PET掃描。通過尾靜脈對裸鼠進行18F-FLT注射，劑量為(4.46 ± 2.47)MBq。在進行18F-FLT PET掃描的前夜起至掃描結束，裸鼠禁飲水。PET掃描在注射18F-FLT 60 min后開始，掃描前及掃描過程中裸鼠用純氧中含1.5%的異氟烷氣體麻醉，流量是2.0 L/min。將裸鼠仰臥位放于小動物PET掃描床上，四肢用膠帶固定。掃描10 min獲得靜態單幀圖像，并將圖像用OSEM-3D IAW(美國西門子公司)軟件重建。每只裸鼠PET掃描結束后即用MicroCAT?Ⅱ系統(美國西門子公司)進行小動物CT掃描，進行CT掃描所用到的掃描床即PET掃描時所用的掃描床，目的是對腫瘤進行定位，用于后期PET與CT圖像融合時確保腫瘤的位置不發生變化。小動物PET與小動物CT圖像用Inveon軟件(西門子公司)融合。接著在異氟烷麻醉狀態下頸椎脫臼處死裸鼠并取出腫瘤，離體腫瘤去除肌肉和骨等組織。對裸鼠所有的處理均經過了倫理委員會的同意。離體瘤按照上述掃描過程再次掃描。為了保證掃描圖像與相同層面的病理圖像進行比較，我們利用3D打印技術設計了離體瘤固定器。該固定器能夠在離體瘤內部做出明顯標記。固定器上有4個針孔以確定4根針線穿過腫瘤內部時能定位出2個平行的平面。根據CT圖像上細線穿過腫瘤的低密度影選取出相應的層面。PET圖像由兩位經驗豐富的核醫學醫師獨立分析并計算18F-FLT標準攝取值(SUV)。SUV通過公式(CT×W)/Dinj計算，CT是組織放射性濃度，W是裸鼠體質量，Dinj是18F-FLT的注射劑量。我們在PET掃描橫斷位圖像上勾畫感興趣區(ROI)。在每個標本選取要分析的層面。在所選取的每個層面勾畫出5個ROI計算SUV值，包括該層的4個ROI(圖1標號為1～4)，另一個ROI是橫斷位整個層面(圖1標號為5)，標號6以整個腫瘤作為一個ROI。通過上述公式計算出每個ROI的SUVmax和SUVmean。

1.4腫瘤組織Ki-67檢測圖像掃描完成后，將離體瘤置于4%甲醛溶液中固定24 h，后用石蠟包埋，隨后剔除所有穿過瘤體的細線。沿著兩條十字交叉細線所在處將離體瘤切割成節段。在離斷平面處切取4 μm厚的切片進行免疫組化染色，根據CT圖像同樣選取切片上有細線穿過形成十字空隙的片子進行分析。切片用Ki-67 MIB-1鼠單克隆抗體(按1∶200稀釋，Dianova，Hamburg，德國)孵育。切片染色后在顯微鏡下放大40倍計數Ki-67陽性細胞與腫瘤細胞，計算Ki-67指數(Ki-67陽性細胞與所有腫瘤細胞的比值)。細胞核染色清晰或為均勻顆粒狀定義為Ki-67陽性細胞，細胞質被染色的細胞不認為是陽性細胞[12]。為避免偏差，計數腫瘤組織切片Ki-67陽性細胞與分析PET圖像分別進行。分別在離體瘤病理圖像上計數與相應PET圖像層畫出的ROI的對應處的Ki-67(圖1)。

2　 結果

10只裸鼠移植瘤模型均建立成功，其移植瘤分別于在體、離體狀態下接受PET和CT掃描，但其中1只裸鼠的腫瘤包繞后肢生長未納入分析。9只裸鼠整個在體移植瘤的SUVmax與SUVmean分別為1.87±0.05、1.19±0.12，整個離體移植瘤分別為1.65 ±0.64、1.05±0.37，兩者SUVmax、SUVmean比較，P均>0.05。勾畫標號1～5的ROI層面中，在體移植瘤的SUVmax與SUVmean分別為1.24 ±0.19、1.14 ±0.16，離體移植瘤相對應層面分別為1.28 ±0.51、1.12 ±0.36，兩者SUVmax、SUVmean比較，P均>0.05。

9只裸鼠離體移植瘤組織切片HE染色良好。大部分切片同時含有腫瘤細胞、纖維化組織、炎癥細胞，有或沒有壞死組織，腫瘤直徑控制良好，其內壞死組織相對較少，所有的標本中均有有活性的腫瘤細胞。用于實驗分析的9個標本中，所有標號1～4的ROI的SUVmax是1.28±0.51、SUVmean是1.12±0.36，Ki-67指數是79.6%±15.8%，SUVmax與Ki-67指數呈正相關(r=0.763，P<0.001)，SUVmean與Ki-67指數亦呈正相關(r=0.575,P=0.013)。圖1標號1處SUVmax=2.340，SUVmean=1.718，Ki-67指數=98%；標號2處SUVmax=2.069，SUVmean=1.869，Ki-67指數=95%；標號3處SUVmax=1.229，SUVmean=1.226，Ki-67指數=85%；標號4處SUVmax=1.770，SUVmean=1.616，Ki-67指數=90%。

圖1　同一層面的ROI及Ki-67染色

3　 討論

本研究的目的是利用移植瘤模型驗證腫瘤內部18F-FLT的攝取區與腫瘤增殖指標空間位置一致性。為了避免腫瘤切除前后引起的誤差，我們用離體瘤圖像分析18F-FLT攝取與離體腫瘤組織Ki-67指數的關系。在我們的研究中，在體瘤與離體瘤的SUV值沒有差異，可以認為離體瘤的SUV值與Ki-67的關系可以代表在體瘤的SUV值與Ki-67指數的關系。且本研究中18F-FLT攝取的空間分布與Ki-67陽性細胞數有良好的相關關系。根據上述結果可得出：18F-FLT高攝取區的空間位置與Ki-67陽性細胞數高表達空間位置有良好的相關關系。也就是說，可初步認為PET/CT上18F-FLT的攝取可以指導放療生物亞靶區的勾畫。

許多腫瘤模型及臨床試驗已經證實，當把腫瘤作為一個整體分析時，18F-FLT的攝取與Ki-67指數有相關關系[13～16]。然而，當考慮到腫瘤內部的微環境異質性時，上述結論的得出難免有些草率。功能分子影像能夠將有活性的腫瘤組織與壞死組織區分開。在NSCLC的臨床放射治療中，我們可以應用腫瘤內微環境異質性定義亞靶區。Marian等[17]研究認為，只要成像設備能夠區分出腫瘤微環境異質性的特征，那么在勾畫靶區時引入亞靶區的概念就是可行的。意識到在直接評估腫瘤異質性存在的內在局限后，本研究應用人肺腺癌裸鼠移植瘤模型層與層比較瘤內18F-FLT攝取與細胞增殖標志物分布的關系，旨在探究18F-FLT PET在評價腫瘤增殖中的潛在作用。本研究的結果補充了先前研究中的不足，先前的有關研究沒有進行空間位置的比較[18～20]。Chalkidou等[21]發表了1篇關于FLT和Ki-67指數關系的Meta分析，該分析將先前諸多文獻中FLT和Ki-67相關關系的差異歸因于研究方法的不同，并指出應該進行更大樣本的改良前瞻性研究設計以解釋在不同的腫瘤中得出的矛盾結果。

對應的層與層比較PET圖像與病理圖像使得實驗能夠確定腫瘤內部PET示蹤劑的空間分布與相應區域生物學特性的相關性。本研究認為，18F-FLT PET可以作為一種無創的方法定量地評估NSCLC的細胞增殖情況，為臨床醫生進一步地提供評價腫瘤惡性程度的預測指標并可能更精確地勾畫腫瘤放療靶區。但存在以下幾點不足：作為可行性研究，本實驗樣本數太少，應該擴大研究樣本并在臨床中展開實驗；在病理切片制作過程中，標本的形變是無法避免的，所以說層與層的比較只能是粗略配準；本研究應用的A549細胞系的Ki-67指數比預期的要高很多，我們沒有找到有關定義Ki-67指數高表達的文獻，本研究計數的陽性細胞指數只是一個主觀指標。

[1] Moller DS, Khalil AA, Knap MM, et al. A planning study of radiotherapy dose escalationof PET-activetumour volumes in non-small cell lung cancer patients[J]. Acta Oncol, 2011,50(6):883-888.

[2] 于金明.21世紀的放射腫瘤學[J].中華腫瘤雜志,2002,24(6):521-525.

[3] Costa A, Silvestrini R, Mochen C, et al. P53 expression, DNA ploidy and S-phase cell fraction in operable locally advanced non-small-cell lung cancer[J]. Br J Cancer, 1996,73(7):914-919.

[4] Thureau S, Chaumet-Riffaud P, Modzelewski R, et al. Interobserver agreement of qualitative analysis and tumor delineation of18F-fluoromisonidazole and 3′-deoxy-3′-18F-fluorothymidine PET images in lung cancer[J]. J Nucl Med, 2013,54(9):1543-1550.

[5] Soloviev D, Lewis D, Honess D, et al. [(18)F]FLT: an imaging biomarker of tumour proliferation for assessment of tumour response to treatment[J]. Eur J Cancer, 2012,48(4):416-424.

[6] Sanghera B, Wong WL, Sonoda LI, et al. FLT PET-CT in evaluation of treatment response[J]. Indian J Nucl Med, 2014,29(2):65-73.

[7] Grierson J, Schwartz J, Muzi M, et al. Metabolism of 3′-deoxy-3′- [F-18]fluorothymidine in proliferating A549 cells: validations for positron emission tomography[J]. Nucl Med Biol, 2004,31(7):829-837.

[8] Kenny LM, Vigushin DM, Al-Nahhas A, et al. Quantification of cellular proliferation in tumor and normal tissues of patients with breast cancer by [18F]fluorothymidine-positron emission tomography imaging: evaluation of analytical methods[J]. Cancer Res, 2005,65(21):10104-10112.

[9] Woolf DK, Beresford M, Li SP, et al. Evaluation of FLT-PET-CT as an imaging biomarker of proliferation in primary breast cancer[J]. Br J Cancer, 2014,110(12):2847-2854.

[10] McKinley ET, Ayers GD, Smith RA, et al. Limits of [18F]-FLT PET as a Biomarker of Proliferation in Oncology[J]. PLoS One, 2013,8(3):e58938.

[11] 郭先偉，黃麗蓉，虞善友，等.PET顯像劑18F-FLT的合成條件優化[J].同位素，2011，24(B12)：76-79.

[12] Spyratos F, Ferrero-Poüs M, Trassard M, et al. Correlation between MIB-1 and other proliferation markers: clinical implications of the MIB-1 cut-off value[J]. Cancer, 2002，94(8):2151-2159.

[13] Yamamoto Y, Nishiyama Y, Ishikawa S, et al. Correlation of 18F-FLT and18F-FDG uptake on PET with Ki-67 immunohistochemistry in non-small cell lung cancer[J]. Eur J Nucl Med Mol Imaging, 2007，34(10):1610-1616.

[14] Hatakeyama T, Kawai N, Nishiyama Y, et al. 11C-methionine(MET) and18F-fluorothymidine (FLT) PET in patients with newly diagnosed glioma[J]. Eur J Nucl Med Mol Imaging, 2008,35(11):2009-2017.

[15] Brockenbrough JS, Souquet T, Morihara JK, et al. Tumor 3′-deoxy-3′-18F-fluorothymidine (18F-FLT) uptake by PET correlates with thymidine kinase 1 expression: static and kinetic analysis of18F-FLT PET studies in lung tumors[J]. J Nucl Med, 2011,52(8):1181-1188.

[16] Yue JB, Yang J, Liu J, et al. Histopathologic validation of 3′-deoxy-3′-18F-fluorothymidine PET for detecting tumor repopulation during fractionated radiotherapy of human FaDu squamous cell carcinoma in nude mice[J]. Radiother Oncol, 2014,111(3):475-481.

[17] Axente M, He J, Bass CP, et al. Tumour microenvironment heterogeneity affects the perceived spatial concordance between the intratumoural patterns of cell proliferation and18F-fluorothymidine uptake[J]. Radiother Oncol, 2012,105(1):49-56.

[18] Troost EG, Bussink J, Slootweg PJ, et al. Histopathologic validation of 3′-deoxy-3′-18F-fluorothymidine PET in squamous cell carcinoma of the oral cavity[J]. J Nucl Med, 2010,51(5):713-719.

[19] Sanghera B, Wong WL, Sonoda LI, et al. FLT PET-CT in evaluation of treatment response[J]. Indian J Nucl Med, 2014,29(2):65-73.

[20] Nakajo M, Nakajo M, Kajiya Y, et al. Correlations of (18)F-fluorothymidine uptake with pathological tumour size,Ki-67and thymidine kinase 1 expressions in primary and metastatic lymph node colorectal cancer foci[J]. Eur Radiol, 2014,24(12):3199-3209.

[21] Chalkidou A, Landau DB, Odell EW, et al. Correlation between Ki-67 immunohistochemistry and18F-fluorothymidine uptake in patients with cancer: a systematic review and meta-analysis[J]. Eur J Cancer, 2012,48(18):3499-3513.

Correlation between uptake of 18 F-FLT on PET/CT imaging and Ki-67 expression at the same layer based on nude mice with tumor xenografts

LIChengming1,ZHANGXiaoli,ZHANGJianbo,SUNXindong,YUJinming,MENGXue

(1UniversityofJinan,ShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250012,China)

Objective To observe the correlation between the uptake of18F-FLT on PET/CT imaging and the expression of Ki-67 at the same layer based on nude mice with tumor xenografts. MethodsTen BALB/c female nude mice with A549 cell xenografts in vivo and in vitro underwent18F-FLT PET/CT scan. In the interested region, we calculated the maximum (SUVmax) of18F-FLT standard uptake value (SUV) and mean uptake value (SUVmean).On the pathological section, the expression of Ki-67 was detected at the same corresponding position. Correlations among the SUV definition of FLT uptake and proliferation makers (Ki-67 LI) were analyzed using the nonparametric Spearman rank test. ResultsThere was no statistically significant difference in the SUVmaxand SUVmeanbetween tumor in vitro and in vivo. For tumors in vitro,18F-FLT SUVmaxwas positively correlated with Ki-67 (r=0.763,P<0.001), and18F-FLT SUVmeanwas also positively correlated with Ki-67 (r=0.575,P=0.013).ConclusionAt the same layer, the uptake of18F-FLT on PET/CT imaging of nude mice with tumor xenografts was in good agreement with Ki-67 expression.

non-small-cell lung cancer; uptake of18F-FLT PET/CT; cell proliferation; Ki-67 index; radiotherapy

公益性行業科研專項資助項目(201402011)；國家自然科學基金資助項目(81472810)；山東省科技發展計劃項目(2014GSF118138)。

李澄明(1988-)，女，碩士研究生，主要從事腫瘤放射治療學研究。E-mail： mzsdry@126.com

簡介：孟雪(1981-)，女，博士，副主任醫師，主要從事腫瘤放射治療學研究。E-mail： mengxue5409@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.23.002

R730.4

A

1002-266X(2016)23-0005-04

2016-01-27)