US3基因轉染樹突狀細胞誘導的T淋巴細胞增殖活性及NK細胞殺傷活性觀察

王昕，王鵬，李玲，潘雪，余祖江，蔣莉莉

(1 鄭州大學護理學院基礎教研室，鄭州 450052；2鄭州市第九人民醫院；3鄭州大學第一附屬醫院)

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US3基因轉染樹突狀細胞誘導的T淋巴細胞增殖活性及NK細胞殺傷活性觀察

王昕1，王鵬1，李玲2，潘雪1，余祖江3，蔣莉莉1

(1 鄭州大學護理學院基礎教研室，鄭州 450052；2鄭州市第九人民醫院；3鄭州大學第一附屬醫院)

目的觀察US3基因轉染樹突狀細胞(DCs)誘導的T淋巴細胞增殖活性和自然殺傷(NK)細胞殺傷活性。方法構建表達US3基因腺病毒載體r-US3和空載體r-Track。分離培養DCs，分為r-US3組(轉染r-US3的DCs細胞)、r-Track組(轉染r-Track的DCs細胞)和正常對照組，將三組細胞分別與T淋巴細胞混合培養，MTT法觀察各組DCs誘導的T淋巴細胞增殖活性；另外將三組細胞分別與NK細胞混合培養，乳酸脫氫酶釋放法觀察NK細胞殺傷活性。結果r-US3組、r-Track組、正常對照組混合培養第24 h時T淋巴細胞增殖活性分別為1.250 0±0.062 4、1.653 3±0.035 1、1.596 7±0.066 6，混合培養第48 h時分別為1.823 3±0.066 6、2.203 3±0.047 3、2.136 7±0.060 3，r-US3組與r-Track組、正常對照組相比，P均<0.05。r-US3組、r-Track組、正常對照組NK細胞殺傷DCs活性分別為87.67%±3.21%、103.02%±2.65%、100.00%，r-US3組與r-Track組、正常對照組相比，P均<0.05。結論轉染US3基因的DCs誘導的T淋巴細胞增殖和NK細胞殺傷活性降低。

樹突狀細胞；T淋巴細胞；自然殺傷細胞;US3基因；免疫逃逸

腺病毒載體被廣泛地應用于基因治療的各個領域[1,2]。但腺病毒載體表達的載體結構蛋白和外源治療基因表達的蛋白產物均會誘導宿主產生細胞和體液免疫反應，引起局部組織的炎癥和破壞，迅速被機體清除，導致目的基因的表達效率降低、表達時間縮短[3]。而傳統的免疫抑制劑幾乎都能抑制人體的免疫系統，增加患者感染和發生腫瘤的危險性。基因治療的研究越來越重視誘導特異性免疫耐受，而不再過分地關注有效的免疫抑制劑，減少或消除機體對腺病毒載體蛋白的免疫排斥反應成為基因治療中的研究熱點。有研究[4,5]報道，將病毒本身所具有的免疫調控基因片段構建于腺病毒載體，可介導免疫逃逸，特異性地阻斷機體針對腺病毒載體的免疫反應。近年研究[6]發現，人類巨細胞病毒(HCMV)編碼的免疫調控基因片段US3基因與病毒的免疫逃逸活性關系密切。本研究構建表達US3基因的腺病毒載體，轉染樹突狀細胞(DCs)，通過T淋巴細胞增殖實驗和自然殺傷(NK)細胞殺傷實驗，觀察US3基因轉染對DCs誘導的T淋巴細胞增殖和NK細胞殺傷活性的影響。

1　材料與方法

1.1細胞株及試劑293T細胞株購自中國科學院細胞庫。瓊脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉購自英國Oxoid公司。DMEM高糖培養基、RPMI1640培養基和胎牛血清購于美國Gibco公司。限制性內切酶、T4DNA連接酶購自New England Biolab公司，高保真Pfu DNA Polymerase酶購自美國Promega公司。質粒提取試劑盒、PCR清潔試劑盒、膠回收試劑盒購自北京TransGen公司。其余試劑購自Sigma公司。

1.2重組腺病毒r-US3的構建將HCMV型陽性標本(鄭州大學第一附屬醫院檢驗科提供)進行病毒DNA提取，PCR擴增U3基因。引物：sense為5′-CCGAAGCTTATGAAGCCGGTGTTGGTGCTCGC-3′，a-ntisense為5′-GCCGATATCAATAAATCGCAGACGG-GCGCTCAC-3′，上游引物含有Hind Ⅲ酶切位點，下游引物含有EcoR Ⅴ。依照說明書要求，依次加入模板HCMV、上下游引物、Pfu DNA Polymerase、dNTPs、10×PCR Buffer及適量的ddH2O，建立50 μL PCR反應體系，95 ℃預變性2 min后，95 ℃、30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，進行35個循環，循環結束后72 ℃延伸5 min。PCR結束后用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產物，測序。測序正確的序列通過PCR擴增US3-His-tag融合基因。引物：sense為5′-CCGAAGCTTATGAAGCCGGTGTTGGTGCTCGC-3′，antisense為5′-GCCGATATCTTAATGATGATGATGAT-GATGAAT-3′。PCR結束后用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產物，測序鑒定。將擴增好的US3-His-tag融合基因片段和腺病毒穿梭質粒pAdTrack-CMV進行連接，構建pAdTrack-US3。PmeⅠ酶切后共轉化含pAdEasy-1質粒的感受態BJ5183細菌，構建重組腺病毒載體pAdEasy-US3。PacⅠ單酶切后，采用脂質體轉染法在293T細胞中進行包裝，構建重組腺病毒r-US3，并進行CsCl梯度純化和滴度測定。同樣的方法構建空載重組腺病毒r-Track，作為生物活性鑒定實驗的對照。

1.3外周血DCs、T淋巴細胞和NK細胞的分離培養采集健康人志愿者外周抗凝血，梯度密度沉淀法常規分離白色云霧狀狹帶外周血單核細胞(PBMCs)。加入適量RPMI1640培養液重懸細胞，計數并調整細胞濃度為5×106個/mL，接種于6孔培養板，37 ℃、5%CO2培養4 h。用玻璃吸管將培養孔內的未貼壁細胞吸出，移至另一無菌離心管中，此吸出的細胞中富含大量的T淋巴細胞，調整細胞濃度至1×107個/mL，加入rhIL-2使其終濃度為20 U/mL，轉入培養瓶中37 ℃、5%CO2培養。用梯度密度沉淀法常規分離PBMCs，PBS洗滌后計數細胞，每1×107細胞加入80 μL緩沖液和20 μL抗CD56免疫磁珠，4 ℃孵育15 min，加入1 mL的緩沖液，300 g離心10 min，棄上清，緩沖液重懸細胞后加入Mini MACS磁場中，進行磁珠分離，分選的CD56+細胞即為NK細胞。

用梯度密度沉淀法常規分離另一健康志愿者外周抗凝血，分離PBMCs，加入適量RPMI1640培養液重懸細胞，計數并調整細胞濃度為5×106個/mL，接種于6孔培養板，37 ℃、5%CO2培養4 h。用玻璃吸管將培養孔內的未貼壁細胞吸出，貼壁細胞每孔中加入RPMIl640培養液2 mL，加入終濃度為1 000 U/mL的GM-CSF和800 U/mL的IL-4，37 ℃、5%CO2培養，第3天貼壁細胞即為未成熟DCs(imDCs)，繼續培養，培養的第5天加入終濃度為500 U/mL的TNF-α，培養至第9天為成熟DCs細胞。

1.4US3基因轉染DCs培養生長狀況良好的DCs細胞，接種于12孔板，每孔接種細胞1×105個，5% CO2、37 ℃培養24 h后棄去各孔細胞的舊培養液，將感染復數(MOI)分別為50、100和200的重組腺病毒液r-US3感染各孔細胞，每個濃度接種3個平行孔。5% CO2、37 ℃培養至48 h，在熒光顯微鏡下計數熒光細胞數和細胞總數，計算感染效率。以同樣的方法，測定重組腺病毒r-Track的感染效率。當MOI為100時，重組腺病毒載體rUS3和r-Track對DCs的轉染效率(90.15%±2.56%和91.83%±2.48%)較MOI為50時的轉染效率(30.22%±2.32%和33.28%±3.57%)高(P均<0.05)，而與MOI為200時的轉染效率(94.27%±3.33%和95.44%±2.40%)比較無統計學差異。為了盡可能地降低重組腺病毒對轉染細胞的毒性，本研究在隨后實驗過程中采用了MOI為100的感染劑量。

1.5轉染US3基因的DCs表型分析細胞分為4組：第5天的imDCs(imDCs組)、第9天成熟的DCs(正常對照組)、轉染MOI為100的重組腺病毒r-US3的DCs細胞(r-US3組)、轉染MOI為100的重組腺病毒r-Track的DCs細胞(r-Track組)，后兩組細胞第7天轉染，第9天用于測定表型。收集各組細胞，將其調整濃度至1×106個/mL。取DCs懸液100 μL，分別加入PE熒光標記的鼠抗人CD1α和CD86抗體各20 μL，混合均勻后，室溫避光放置30 min，以同型陰性熒光標記抗體作為陰性對照。PBS液清洗2次，流式細胞儀檢測DCs細胞。r-US3組、r-Track組、imDCs組、正常對照組CD86陽性的DCs分別占88.41%±5.32%、86.73%±5.60%、14.92%±4.68%、85.38%±4.47%，CD1α陽性分別占85.45%±6.04%、87.16%±6.05%、9.46%±2.73%、82.94%±6.62%，正常對照組與imDCs組比較，P均<0.05，r-US3組、r-Track組與正常對照組比較，P均>0.05。

1.6轉染US3基因的DCs誘導的T淋巴細胞增殖活性檢測將培養第7天生長狀況良好的DCs分為r-US3組(轉染r-US3的DCs細胞)、r-Track組(轉染r-Track的DCs細胞)和正常對照組，分別加入MOI均為100的r-US3腺病毒RPMI培養液、r-Track腺病毒RPMI培養液和空白RPMI培養液，接種于6孔板，每孔接種細胞1×105個，37 ℃、5%CO2培養。感染48 h后，各組細胞中加入終濃度為50 μg/mL絲裂霉素C，晃動混勻，37 ℃、5%CO2培養45 min，PBS清洗，做為靶細胞。將另一志愿者分離所得的T淋巴細胞作為反應細胞，調整細胞濃度至1×106個/mL，100 μL/孔加入96孔板中，分別與上述3組靶細胞混合，效靶比為20∶1。此外，另設效應細胞陰性對照孔，以效應細胞自身為空白對照。各組反應總體積均為200 μL/孔，37 ℃、5%CO2培養。分別于混合培養后即刻及第24、48 h時，各組取3孔進行檢測，每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，晃動混勻，37 ℃、5%CO2孵育4 h，棄上清。每孔加入150 μL的DMSO，振蕩10 min后，酶聯免疫檢測儀570 nm波長處測定各孔OD值，記錄結果。最終將正常對照組培養0 h的T淋巴細胞增殖活性設為1，T淋巴細胞增殖活性=(實驗組OD值-空白對照組OD值)/(1-空白對照OD值)。

1.7轉染US3基因的DCs對NK細胞殺傷活性的影響觀察將培養生長狀況良好的DCs細胞接種于12孔板，分為r-US3組、r-Track組和正常對照組，各組分別加入MOI為100的r-US3腺病毒RPMI培養液、r-Track腺病毒RPMI培養液和空白RPMI培養液培養48 h后作為靶細胞。混合NK細胞和靶細胞，效靶比為20∶1，另以NK細胞自身為空白對照。每組均設3個平行孔，NK細胞殺傷活性采用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法測定。最終將正常對照組NK細胞殺傷活性設為100%， NK細胞殺傷活性(%)=(實驗組OD值-空白對照組OD值)/(正常對照組OD值-空白對照OD值)×100%。

1.8統計學方法采用SPSS10.0統計軟件。計量資料進行正態性檢驗和方差齊性檢驗檢驗后，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

各組T淋巴細胞增殖活性比較見表1。r-US3組、r-Track組、正常對照組NK細胞殺傷DCs活性分別為87.67%±3.21%、103.02%±2.65%、100.00%，r-US3組與r-Track組、正常對照組相比，P均<0.05。

表1　各組T淋巴細胞增殖活性比較±s)

注：與正常對照組相比，*P<0.05；與r-Track組相比，#P<0.05。

3　討論

DCs是機體免疫反應的始動者，是體內目前已知功能最強的專職抗原提呈細胞(APC)，在基因治療和免疫治療中發揮著重要的作用，但免疫排斥反應是其面臨的一個重要的障礙。DCs對T淋巴細胞和NK細胞均有激活功能[7]，DCs細胞能及時地攝取和加工各種抗原，形成主要組織相容性復合體(MHC)-抗原肽復合物，激活T細胞介導的免疫應答。此外，DCs還能高表達黏附分子和共刺激分子，分泌多種細胞因子，在細胞免疫中發揮關鍵作用[8]。隨著高效轉染基因工程的發展，基因治療被系統地引入細胞移植，移植細胞具有了基因修飾的可能性[9]。將治療基因導入細胞后移植于受體，既能滿足移植的需要，又能通過轉染、基因干擾或敲除等技術使移植細胞獲得所需的特性，達到防治疾病的目的，但免疫排斥問題仍是其面臨的一個主要問題，因此，通過基因修飾使移植細胞獲得免疫逃逸的特性成為目前國內外針對免疫排斥的研究熱點[10]。

病毒是典型的胞內感染，干擾感染細胞表面MHCⅠ類分子抗原呈遞途徑來逃避免疫清除的策略被許多病毒所利用，病毒對此途徑的調節也就成為研究病毒逃逸免疫細胞殺傷機制的焦點之一[11]。現有研究[4,5]發現，病毒可通過各種機制干擾MHCⅠ類分子的成熟、組裝和輸出，作用于MHCⅠ類抗原肽復合物形成的各環節，在其生長周期的不同階段均可以干擾MHCⅠ類抗原呈遞，從而產生病毒逃逸，減少機體對病毒的清除。但是病毒感染細胞表面MHCⅠ類分子的表達與其對NK細胞的敏感性呈反比。病毒感染細胞在破壞或下調MHCⅠ類分子的同時，卻成了NK細胞的攻擊目標。因此單純降低病毒感染細胞表面MHCⅠ類分子表達達不到理想的免疫逃逸效果。有研究[6]報道，HCMV編碼的免疫調控基因片段US3基因既可以選擇性下調NK細胞興奮性受體的優勢配體MHCⅠ-A和MHCⅠ-B，又可不對NK細胞抑制性受體的優勢配體MHCⅠ-C和MHCⅠ-E產生影響，在逃逸CTL殺傷的同時還可避免NK細胞的免疫殺傷，有效逃逸宿主的免疫清除。

本研究通過分離健康人的PBMCs，在rhGM-CSF、IL-4和TNF-α的聯合刺激培養下，成功地誘導出典型的DCs細胞。基于已有的研究基礎和理論依據，本研究構建表達US3基因的腺病毒載體，轉染DCs細胞，通過T淋巴細胞增殖實驗和NK細胞殺傷實驗，研究表達US3基因腺病毒載體的免疫逃逸活性。結果發現，重組腺病毒能夠安全、高效地轉染DCs細胞，并且重組腺病毒的轉染對于DCs細胞的成熟表型不產生明顯影響。為了盡可能地降低重組腺病毒對轉染細胞的毒性，更好地研究其免疫活性，本研究采用了MOI為100的感染劑量。在隨后的實驗中，重組腺病毒r-US3和r-Track分別感染誘導成功的DCs后，與分離出的淋巴細胞混合培養，結果發現，與r-Track組和正常對照組相比，重組腺病毒r-US3組在混合培養24 h內和48 h內均能明顯抑制DCs誘導的T淋巴細胞增殖活性。而r-Track組和正常對照組比較差異無統計學意義。此外，本研究又通過NK細胞殺傷活性實驗檢測重組腺病毒r-US3的免疫活性。結果發現，r-US3組能明顯地降低NK細胞對轉染DCs細胞的特異性殺傷活性，與正常對照組和r-Track組相比有統計學差異，而正常對照組和r-Track組比較差異無統計學意義。

可見，表達US3基因的重組腺病毒能夠有效地抑制DCs誘導的T淋巴細胞增殖，同時降低NK細胞對轉染DCs的免疫殺傷。這些結果在一定程度上提示，表達US3基因的腺病毒載體能夠介導基因工程載體及其轉染細胞的免疫逃逸，降低機體免疫系統對外源基因及其轉染細胞的排斥反應，有利于目的基因的長期表達。

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Proliferation of T lymphocytes induced by DCs transfected with US3 gene and cytotoxic activities of NK cells

WANGXin1,WANGPeng,LILing,PANXue,YUZujiang,JIANGLili

(1NursingSchoolofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

Objective To observe the proliferation of T lymphocytes induced by dendritic cells (DCs) transfected with US3 gene and cytotoxic activities of natural killer (NK) cells. MethodsTo construct adenovirus vectors expressing r-US3 or r-Track. DCs were separately cultured and then were divided into r-US3 group (r-US3-infected DCs), r-Track group (r-Track-infected DCs), and normal control groups. DCs in the three groups were mixed with T lymphocytes and the proliferation activity of T lymphocytes induced by DCs in each group was observed by MTT. In addition, DCs of three groups were mixed with NK cells, and cytotoxic activity of NK cells was tested using lactate dehydrogenase release assay. ResultsThe proliferation activities of T lymphocytes in r-US3 group, r-Track group and the control group were 1.250 0±0.062 4, 1.653 3±0.035 1 and 1.596 7±0.066 6, respectively at the 24th hour of mixed cultivation. When it came to the 48th hour, the proliferation activities of T lymphocytes were 1.823 3±0.066 6, 2.203 3±0.047 3 and 2.136 7±0.060 3, respectively. Compared with the r-Track group and control group, r-US3 significantly decreased the proliferation activities of T lymphocytes, allP<0.05. Cytotoxic activities of NK cells in the r-US3 group, r-Track group and the control group were 87.67%±3.21%, 103.02%±2.65% and 100.00%, respectively. Compared with the r-Track group and control group, r-US3 significantly decreased the cytotoxic activities of NK cells, allP<0.05. Conclusion The proliferation of T lymphocytes induced by DCs transfected by US3 gene and cytotoxic activities of NK cells are decreased.

dendritic cells; T-lymphocyte; natural killer cells; US3 gene; immune evasion

國家自然科學基金資助項目(81500433)；河南省教育廳自然科學研究計劃項目(16A310003，12A310010)。

王昕(1972-)，女，副教授，主要從事免疫藥理學的研究。E-mail: wangxinsfyy@126.com

簡介：王鵬(1975-),女，教授，碩士生導師，主要從事免疫藥理學的研究。E-mail： upliz@zzu.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.23.005

R392

A

1002-266X(2016)23-0016-04

2016-01-12)