3種白血病細胞株中P73、DAPK、O6MGMT和CDH1基因啟動子區(qū)CpG島甲基化模式分析

葉松山，侯俊然，邱耕，毛秉豫，卞華，楊雷

(1南陽理工學院張仲景國醫(yī)學院，河南南陽 473004；2中山大學達安基因股份有限公司)

?

3種白血病細胞株中P73、DAPK、O6MGMT和CDH1基因啟動子區(qū)CpG島甲基化模式分析

葉松山1，侯俊然1，邱耕2，毛秉豫1，卞華1，楊雷1

(1南陽理工學院張仲景國醫(yī)學院，河南南陽 473004；2中山大學達安基因股份有限公司)

目的分析3種白血病細胞株中P73、DAPK、O6MGMT和CDH1基因啟動子區(qū)CpG島甲基化模式。方法運用亞硫酸氫鹽測序法分析P73、DAPK、O6MGMT和CDH1抑癌基因啟動子區(qū)CpG島在健康人外周血白細胞(正常對照)和U937、HL-60及Jurkat白血病細胞株中甲基化狀態(tài)，繪制其甲基化圖譜，并應用甲基化特異性PCR法在不同細胞中進行驗證。結果正常對照、U937、HL-60及Jurkat基因組甲基化率分別為7.26%(238/3 279)、61.33%(1 813/2 956)、89.35%(3 090/3458)、58.10%(1 342/2 310),白血病細胞株與正常對照比較，P均<0.01。P73基因可鑒別正常細胞和腫瘤細胞，DAPK基因可區(qū)分開腫瘤細胞HL-60、U937及Jurkat，O6MGMT可進一步把U937與Jurkat區(qū)分開。結論P73、DAPK、O6MGMT和CDH1基因具有特異的甲基化模式，通過3次MSP檢測能將正常細胞和白血病細胞株進行鑒別。

DNA甲基化；亞硫酸氫鹽測序；腫瘤抑制基因；腫瘤標志物；白血病

腫瘤發(fā)生涉及表觀遺傳學改變，DNA甲基化作為表觀遺傳修飾之一，通過啟動子區(qū)CpG島胞嘧啶(C)甲基化在轉錄水平調節(jié)抑癌基因表達造成其“沉默”，成為腫瘤發(fā)生的重要機制[1,2]。DNA異常甲基化是腫瘤發(fā)生中的早期頻發(fā)事件，可作為應用前景廣闊的腫瘤診斷標志物[3]。白血病位居兒童及35歲以下成人惡性腫瘤發(fā)病率和病死率首位[4]，嚴重危害人類健康，正確診斷分型、早期治療及疾病監(jiān)測對白血病患者預后至關重要。啟動子區(qū)CpG島高甲基化使抑癌基因失活，是白血病發(fā)生的一種重要機制[5]。血液系統(tǒng)腫瘤中有二三十個基因啟動子區(qū)發(fā)生異常甲基化[6,7]，這些基因包括E-cadherin、runx3、MGMT、SFRP5、DAPK、P53、Id4、TEPI2、P57、P16、P73等，在多數(shù)病例中可檢測到P73、DAPK、O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(O6MGMT)和CDH1等抑癌基因高甲基化，這些異常甲基化可能在白血病的診斷分型和個性化治療等方面成為有用靶點[8]。本研究通過對P73、DAPK、O6MGMT和CDH1抑癌基因啟動子區(qū)CpG島在3種白血病細胞株——U937(單核細胞系)、HL-60(粒細胞系)及Jurkat(淋巴細胞系)基因組中的甲基化模式分析，探尋一種聯(lián)合多基因異常甲基化模式診斷白血病的方法，從而奠定白血病早期診斷標志物實驗研究的基礎。

1　材料與方法

1.1主要試劑、儀器RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；小牛血清(杭州四季青生物公司)；DH5α菌株為達安基因股份有限公司贈送；LB培養(yǎng)基(英國OXOID公司)；DNA提取試劑盒、PCR產物回收試劑盒(德國QIAGEN公司)；氫醌、亞硫酸氫鈉(美國Sigma公司)；Taq酶、dNTPs(晶美生物技術有限公司)；pMD-18T載體試劑盒(大連寶生物工程公司)；其他低耗品均為國產。PCR儀(ABI9700,美國ABI公司)；電子天平(AUW220D，日本島津公司)；冷凍離心機、超低溫冰箱和CO2培養(yǎng)箱(美國賽默飛世爾公司)；紫外分光光度計(UV-9000，上海)；微生物培養(yǎng)箱(SPX-150，上海)；空氣恒溫振蕩器(HZ-25，江蘇)；水平電泳儀(DYCP-31C，北京六一)；全自動凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂公司)。

1.2細胞株來源、培養(yǎng)白血病細胞株U937、HL-60和Jurkat購自中國科學院上海細胞所，正常人外周血來自健康人志愿者。將U937、HL-60和Jurkat懸浮于RPMI1640培養(yǎng)基與10%小牛血清中，在37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液1次傳代。

1.3細胞株P73、DAPK、O6MGMT和CDH1基因啟動子區(qū)CpG島甲基化模式分析健康人外周血白細胞(正常對照)和白血病細胞株U937、HL-60、Jurkat基因組DNA提取嚴格按照DNA提取試劑盒說明書操作，分光光度計定量DNA濃度，-20 ℃保存。1 μg DNA溶于純水補足體積至45 μL，與5 μL新配制NaOH(3 mol/L)混勻，42 ℃水浴20 min，取30 μL新配氫醌(10 mmol/L)和520 μL亞硫酸氫鈉(4.2 mol/L，pH調至5.0)加入變性后的DNA溶液中混勻，石蠟油封蓋液面，避光55 ℃水浴16 h，DNA溶液使用Wizard純化試劑盒脫鹽純化，用40 μL的TE溶解置于-20 ℃?zhèn)溆谩Ｏ螺dP73、DAPK、O6MGMT和CDH1全基因組序列在線分析各基因轉錄起始位點前后約3 000 bp序列CpG島和CpG位點位置(網址http://www.urogene.org/methprimer)，下載各基因C到胸腺嘧啶(T)的轉化序列作為修飾后轉變成的新序列，以此為模板用Oligo 7.0軟件設計引物。發(fā)現(xiàn)所有基因5′區(qū)域均有密集的CpG位點和近1 500 bp甲基島。由于CpG島較長，加之BSP擴增受產物長度的限制，為確保能夠分析全部CpG位點需對CpG島序列區(qū)域進行分段，P73、DAPK、O6MGMT和CDH1基因引物分別為5、5、3、5對，按BSP擴增基因種類和序列長短，計算得到各基因CpG位點數(shù)分別為226、156、105、113。根據引物特點，采用巢式或半巢式PCR方法。擴增特異且效率高的PCR產物直接用pMD18-T載體和感受態(tài)大腸桿菌DH5α進行連接及轉化做TA克隆，不特異的產物割膠純化后克隆，鑒定陽性的克隆送上海生工公司測序。測序結果中CpG位點若是CpG表示是甲基化的，TpG表示是去甲基化的，讀取CpG位點中C位置是C或T，分別計算各細胞整體甲基率和各基因CpG位點甲基化率，即甲基化率為DNA修飾后CpG的數(shù)目除以原始序列中CpG數(shù)目，計算公式：甲基化率=C/(C+T)×100%，將測序結果中C或T匯集到Microsoft office excel 2010中，繪制甲基化圖譜。參照文獻[9]中引物設計原則，設計非甲基化引物(U)和甲基化引物(M)各一對，參考在線“C”至“T”轉化后和測序后序列用Oligo7.0軟件設計引物(表1)。MSP擴增在25 μL體系進行，取8 μL產物電泳成像，判斷擴增結果。將甲基化引物擴增出目的條帶或非甲基化與甲基化引物都擴增出目的條帶看作陽性，非甲基化引物擴增出目的條帶視為陰性。

表1　各基因MSP引物情況

注：F為正向引物；R為反向引物。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

正常對照和白血病細胞株U937、HL-60及Jurkat基因組甲基化率分別為7.26%(238/3 279)、61.33%(1 813/2 956)、89.35%(3 090/3 458)、58.10%(1 342/2 310),白血病細胞株與正常對照比較，P均<0.01。P73基因在正?；蚪M中以完全去甲基化為主，在U937中以完全甲基化為主，在HL-60中完全甲基化與部分甲基化共存，在Jurkat中較復雜，完全甲基化、部分甲基化和完全去甲基化都有；DAPK基因在正常基因組中基本是完全去甲基化，在U937中甲基化狀態(tài)多樣，但甲基化和去甲基化界線明顯，在HL-60中除個別CpG位點去甲基化，其余都是完全甲基化，在Jurkat中情況復雜，主要以部分甲基化為主；O6MGMT基因在正?；蚪M185位點后完全去甲基化，在U937和HL-60中以完全甲基化為主，在Jurkat中基本是完全去甲基化；CDH1基因分析數(shù)據不完善，但可看出其在正常細胞基因組以完全去甲基化為主，腫瘤細胞中除個別位點出現(xiàn)完全去甲基化外其他以完全甲基化為主；P73基因在正常細胞與白血病細胞株甲基化狀態(tài)完全相反，DAPK基因在HL-60中與其他白血病細胞株甲基化狀態(tài)存在明顯差異，O6MGMT基因在U937及Jurkat細胞株基因組中甲基化狀態(tài)相反。正常對照和白血病細胞株U937、HL-60及Jurkat基因組甲基化模式見插頁Ⅰ圖1、2，基因CpG位點的甲基化頻率見插頁Ⅰ圖3～6。

對于P73基因，正常對照只有U擴增，白血病細胞株基因組只有M擴增；對于DAPK基因，HL-60細胞株基因組只有M擴增，其他2個腫瘤基因組只有U擴增；對于O6MGMT基因，U937細胞株基因組M、U都擴增，Jurkat細胞株基因組只有U擴增，M和U的PCR產物測序與目的基因片段序列一致(圖1)。

注：a為P73基因；b為DAPK基因；c為O6MGMT基因；M為DNA marker；1、2、3、4分別為HL-60、U937、Jurkat和正常對照細胞株相應基因。

圖1MSP擴增結果

3　討論

DNA異常甲基化與其他腫瘤標記物相比，具有較mRNA或活性蛋白質穩(wěn)定、不同腫瘤同一基因啟動子異常甲基化區(qū)域相同而方便檢測和易于設置陽性對照等優(yōu)點，更適合作為早期診斷的敏感生物學指標[10]。檢測腫瘤患者外周血中分子標志物成為當前腫瘤研究的熱點，本研究選擇白血病作為尋找腫瘤DNA甲基化標志物的突破口有兩個原因，一是診斷標志物能在血液或體液中檢出是較為理想的，而白血病的病變組織是骨髓，患者外周血中細胞外游離DNA含量高且有腫瘤源性；二是不同研究中同種基因相似的甲基化位點在同類腫瘤中甲基化檢測陽性率不一致，說明有必要對腫瘤細胞各亞型詳細的CpG位點甲基化狀態(tài)進行分析和篩查，特別是對于如白血病這種單克隆來源的腫瘤。

白血病發(fā)病涉及多個基因甲基化改變，如文獻[11]報道P73基因甲基化導致轉錄沉默誘導白血病和淋巴瘤發(fā)生，患者外周血中存在死亡相關蛋白激酶(DAPK)啟動子甲基化異常，通過檢測有助于腫瘤早期診斷[12,13]，O6MGMT基因啟動子區(qū)甲基化程度與白血病對烷化劑化療敏感性直接相關[14]，CDH1基因在急性白血病中啟動子區(qū)甲基化異常頻率高且具有腫瘤類型的特異性，只在包括白血病在內的少數(shù)腫瘤中表現(xiàn)等。所以對于亞型眾多的白血病而言，將單個基因表觀遺傳學改變作為腫瘤生物學標記具有一定的局限性，利用單一基因的甲基化模式不可能區(qū)別所有的類型，聯(lián)合多個基因、多位點進行檢測成為必然。

本研究選取一組與白血病發(fā)生關系密切的抑癌基因P73、DAPK、O6MGMT和CDH1基因作為研究重點，以不同來源白血病細胞株為模型，全面分析各基因甲基化狀態(tài)，繪制出詳細的CpG甲基化譜,并尋找特異的甲基化模式進行聯(lián)合診斷。為了診斷的特異性，只把完全甲基化或完全去甲基化的區(qū)域作為標志性的甲基化模式。P73完全甲基化位點是鑒別白血病和正常細胞的泛化指標，在腫瘤細胞株中具有和正常細胞完全不同的甲基化狀態(tài)。DAPK提供大量的HL-60特異的完全甲基化位點，可以將其與其他兩個腫瘤細胞分開，亦即是粒系白血病可能的特異位點。O6MGMT能區(qū)分單核系的U937與淋巴系的Jurkat細胞，在所選擇的特異位點區(qū)段，二者都有各自完全的甲基化或去甲基化狀態(tài)。這樣通過3次MSP檢測可將各類細胞鑒別開來，達到白血病初步診斷分型的目的，這些位點也將是以后尋找白血病及其亞型潛在的DNA甲基化標志物位點。

雖然白血病細胞株具有基因組單一、重復性好等優(yōu)點，并且在細胞株中也取得了滿意的診斷效果，但我們也應充分認識到白血病患者腫瘤細胞的甲基化狀態(tài)并不能完全由細胞株衡量[15]。選取細胞株的初衷是考慮到細胞的純粹性，避開白血病患者腫瘤細胞間的個體差異，這只是篩選標志物的第一步，真正評價異常甲基化模式診斷白血病的價值尚需在白血病患者外周血標本中驗證。另外在對細胞株鑒別診斷時進行了3次MSP檢測，步驟較繁瑣，而新近發(fā)展的基因芯片技術具有靈敏度高、高通量的特點，用來初篩與腫瘤有關的基因[16,17]，有可能一步完成多基因的檢測從而簡化操作。因此，針對檢測方法的優(yōu)化和臨床標本大樣本的篩查將是下一步研究的重點。

[1] De Smet C, Loriot A. DNA hypomethylation in Cancer: epigenetic scars of a neoplastic journey[J]. Epigenetics, 2010,5(3):206-213.

[2] 王昭,牛小青,周雯雯,等.沉默DNMT1基因對骨髓瘤細胞SOCS-1基因甲基化的影響[J].中國實驗血液學雜志,2015,23(3):713-717.

[3] 李新源,郭亞民,吳新民.DNA甲基化和E-cadherin基因甲基化與胃癌關系研究進展[J].中華腫瘤防治雜志,2014,21(12):965-968.

[4] 赫捷,陳萬青.中國腫瘤登記年報(2012)[M].北京:軍事醫(yī)學科學出版社,2012:118.

[5] 王艷,張敬宇,林鳳茹,等.DNA甲基化對TIG1基因在急性白血病中表達的影響[J].中國實驗血液學雜志,2014,22(3):648-652.

[6] 趙曉麗,王小欽,賈曉東,等.CpG島甲基化表型在血液系統(tǒng)疾病中的研究進展[J].臨床血液學雜志,2013,26(5):356-359.

[7] 王暢,于力,譚業(yè)輝,等.慢性粒細胞白血病ZO-1基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)分析及臨床意義探討[J].山東醫(yī)藥,2011,51(32):33-35.

[8] 廖于峰,戴金華,馬建波,等.成人急性淋巴細胞白血病p15和p73基因啟動子異常甲基化及臨床意義[J].實用醫(yī)學雜志,2014,30(21):3458-3461.

[9] Tusnády GE, Simon I, Váradi A, et al. BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes[J]. Nucleic Acids Res, 2005,33(1):e9.

[10]Cooke S, Campbell P. Circulating DNA and next-generation sequencing[J]. Recent Results Cancer Res, 2012,195:143-149.

[11] Sati H, Oka T, Shinnou Y, et al. Multi-step aberrant CpG island hyper-methylation is associated with the progression of adult T-cell leukemia/lymphoma[J]. Am J Pathol, 2010,176(1):402-415.

[12] Xiao FL, Kun T, Shao PY, et al. Correlation between promoter methylation of p14(ARF), TMS1/ASC, and DAPK, and p53 mutation with prognosis in cholangiocarcinoma[J]. World J Surg Oncol, 2012,10(1):5.

[13] 王春艷,劉文君.5-雜氮-2′-脫氧胞苷對人HL-60細胞DAPK基因表達的影響[J].中國實驗血液學雜志,2014,22(3):717-722.

[14] 康馬飛,駱梅青,劉瑛,等.彌漫大B細胞淋巴瘤患者血漿MGMT基因甲基化與化療療效關系[J].中國癌癥防治雜志,2011,3(3):210-213.

[15] 洪青曉,葉華丹,湯琳琳.急性髓系白血病相關基因的DNA甲基化[J].中國細胞生物學學報,2015,37(2):299-308.

[16] 陳偉,王磊,葉俊文,等.基于生物芯片檢測結直腸癌相關基因的甲基化[J].中山大學學報(醫(yī)學科學版),2014,35(6):920-924.

[17] 賈長河,劉志亮,張成偉.基因表達譜芯片在胰腺癌組織差異表達相關基因篩選中的應用[J].山東醫(yī)藥,2015,55(29):10-13.

Analysis of methylation patterns of CpG islands in the promoter region of P73,DAPK, O6MGMT and CDH1 genes from three kinds of leukemia cell lines

YESongshan1,HOUJunran,QIUGeng,MAOBingyu,BIANHua,YANGLei

(1ZhangZhongjingTraditionalChineseMedicineCollege,NanyangInstituteofTechnology,Nanyang473004,China)

ObjectiveTo analyze the methylation patterns of CpG islands in the promoter region of P73, DAPK, O6MGMT and CDH1 genes from three kinds of leukemia cell lines. MethodsThe methylation status and maps of P73, DAPK, O6MGMT and CDH1 gene promoters′ CpG islands were analyzed in the genome of healthy human white blood cells (control group), U937, HL-60 and Jurkat cell lines by bisulfite sequencing PCR. The differential methylation sites of each gene were verified in the leukemia cell lines by methylation specific PCR. ResultsThe methylation rates of the control group, U937, HL-60 and Jurkat genomes were 7.26% (238/3 279), 61.33% (1 813/2 956), 89.35% (3 090/3 458) and 58.10% (1 342/2 310), respectively. Significant difference was found between the leukemia cell lines and normal control group, allP<0.01 respectively. P73 gene could distinguish between normal and tumor cells, DAPK gene could be used to separate the tumor cells HL-60, U937 and Jurkat; and O6MGMT gene could discriminate U937 and Jurkat further. ConclusionThere were specific methylation patterns of P73, DAPK, O6MGMT and CDH1 genes. The normal cells and leukemia cell lines were identified through MSP detection thrice.

DNA methylation; bisulfite sequencing; tumor suppressor gene; tumor biomarker; leukaemia

葉松山(1980-)，男，講師，主治醫(yī)師，主要從事基因診斷的研究。E-mail: hnnyyss@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.23.007

R733.7

A

1002-266X(2016)23-0023-04

2015-12-26)