肝癌干細(xì)胞體外富集模式的構(gòu)建

楊帥，陳娟，佘佐亞，陳相宜，蔡捷，鄺曉聰

(1廣西醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室，南寧530021；2廣西醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院；3廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心)

?

·論著·

肝癌干細(xì)胞體外富集模式的構(gòu)建

楊帥1，陳娟1，佘佐亞2，陳相宜1，蔡捷3，鄺曉聰1

(1廣西醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室，南寧530021；2廣西醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院；3廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心)

目的構(gòu)建肝癌干細(xì)胞體外富集模式。方法選擇肝母細(xì)胞瘤HepG2細(xì)胞系，以有限稀釋法培養(yǎng)體外單細(xì)胞，觀察體外單細(xì)胞克隆培養(yǎng)的克隆細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和形成全克隆、部分克隆以及旁克隆的比例，選取全克隆逐級(jí)擴(kuò)增，取1×104和1×106的HepG2細(xì)胞進(jìn)行裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)，qRT-PCR檢測(cè)全克隆癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物ABCG2、ALDH1A3、CD44、CXCR4、OCT4 mRNA，懸浮球形成實(shí)驗(yàn)計(jì)算全克隆懸浮球形成率。對(duì)全克隆細(xì)胞加0.5、0.3、0.2、0.1、0.05、0.01 μg/mL濃度的阿霉素干預(yù)48 h，觀察全克隆生長(zhǎng)情況；對(duì)于干預(yù)后存活的全克隆全部進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)增和裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)。結(jié)果HepG2細(xì)胞克隆形成率為32.78%±9.03%，其中全克隆、部分克隆、旁克隆百分比分別為7.12%±2.96%、62.67%±13.39%、30.21%±14.87%；所有全克隆均可逐級(jí)擴(kuò)增；1×104、1×106個(gè)HepG2細(xì)胞全克隆接種裸鼠成瘤率分別為12.5%、100%；與HepG2細(xì)胞相比，單細(xì)胞全克隆ABCG2、CD44、ALDH1A3、CXCR4和OCT4表達(dá)倍數(shù)分別為2.26±0.33、2.67±0.55、3.96±1.56、2.56±0.55、1.05±0.40，兩者ABCG2、ALDH1A3、CD44、CXCR4相比,P均<0.05；只有HepG2全克隆細(xì)胞可形成懸浮球。單細(xì)胞克隆培養(yǎng)后的全克隆進(jìn)行阿霉素干預(yù)，發(fā)現(xiàn)僅加入0.1、0.05、0.01 μg/mL阿霉素的HepG2細(xì)胞全克隆存活，接種裸鼠成瘤率均為100%。結(jié)論成功構(gòu)建了肝癌干細(xì)胞體外富集模式。

腫瘤干細(xì)胞；肝癌干細(xì)胞；細(xì)胞全克隆；細(xì)胞培養(yǎng)

目前，腫瘤干細(xì)胞的分離和富集方法主要有流式分選、磁式分選以及“懸浮球”培養(yǎng)等方法[1,2]，其主要是依據(jù)腫瘤干細(xì)胞“干性”、耐藥性、特殊功能細(xì)胞標(biāo)志以及干細(xì)胞特性進(jìn)行實(shí)施的，并多認(rèn)為是得到了富含腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞群體，未獲取到高純度甚至單純的腫瘤干細(xì)胞。其中，流式分選對(duì)癌細(xì)胞活性有一定影響，磁式分選獲得細(xì)胞量較少，“懸浮球”培養(yǎng)需要特殊的條件培養(yǎng)基。因此，有研究者把干細(xì)胞和白血病干細(xì)胞在體外單細(xì)胞培養(yǎng)會(huì)形成全克隆類型的細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)結(jié)論加以擴(kuò)展，認(rèn)為單個(gè)癌細(xì)胞形成的全克隆富含腫瘤干細(xì)胞，其細(xì)胞群體也表現(xiàn)出腫瘤干細(xì)胞的惡性特征[3]，該方法簡(jiǎn)單易行且可保持細(xì)胞活性，但不足之處是全克隆的判定依據(jù)是形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)(如細(xì)胞克隆的形狀和細(xì)胞間的緊密度等指標(biāo))，主觀性很強(qiáng)。為提高全克隆判定標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)謹(jǐn)性和實(shí)用性，本研究在明確全克隆源于腫瘤干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，加入阿霉素進(jìn)行細(xì)胞毒性干預(yù)，觀察全克隆細(xì)胞群體的耐藥特性，旨在構(gòu)建一種簡(jiǎn)單易行的肝癌干細(xì)胞體外富集模式。

1　材料與方法

1.1材料人肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞系HepG2(加拿大UBC大學(xué)戴龍君教授惠贈(zèng))、胎牛血清和RPMI1640培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司)、TRIzol(Invitrogen公司)、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和引物(大連寶生物公司)、熒光定量Mix和八聯(lián)管(羅氏公司)、mTeSRTM1人胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)基(Stem Cell Technologies公司)、阿霉素(深圳萬樂藥業(yè)有限公司)。恒溫CO2培養(yǎng)箱(日本三洋公司)、倒置顯微鏡(日本Olympus公司)、定量PCR儀(Roche480Ⅱ,羅氏公司)。Balb/C雄性裸鼠5～6周齡，體質(zhì)量為18～22 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2肝癌干細(xì)胞體外富集模式的構(gòu)建及驗(yàn)證

1.2.1肝癌干細(xì)胞干性檢測(cè)

1.2.1.1單個(gè)細(xì)胞全克隆形成及擴(kuò)增培養(yǎng)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基以有限稀釋法，接種于96孔板,平均每孔1個(gè)細(xì)胞,置于37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中,每天用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。記錄細(xì)胞數(shù)量，2周后觀察單個(gè)細(xì)胞克隆形成情況,根據(jù)單細(xì)胞克隆形態(tài)分類,將克隆分為全克隆、部分克隆和旁克隆3類,判斷標(biāo)準(zhǔn)參考Barrandon和Green對(duì)人表皮角質(zhì)細(xì)胞的研究[4]。計(jì)算克隆形成率，克隆形成率=克隆總數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。選取96孔板中的HepG2細(xì)胞的全克隆，培養(yǎng)14 d后胰酶消化轉(zhuǎn)移至24孔板，待24孔板長(zhǎng)至70%～80%，同法轉(zhuǎn)移至6孔板，待6孔板長(zhǎng)至70%～80%轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.1.2細(xì)胞全克隆成瘤實(shí)驗(yàn)一組將不同孔號(hào)內(nèi)的全克隆進(jìn)行組合，細(xì)胞數(shù)量為1×104；另一組將單個(gè)細(xì)胞全克隆擴(kuò)增培養(yǎng)至培養(yǎng)瓶長(zhǎng)滿，細(xì)胞計(jì)數(shù)為1×106，兩組均以800 r/min離心5 min,棄掉上清,用RPMI1640培養(yǎng)基1 mL重懸,用1 mL注射器吸取細(xì)胞懸液。隨機(jī)選取5～6周、體質(zhì)量為18～22 g的Balb/C雄性裸鼠16只，右側(cè)腋下皮下注射0.2 mL的1×104、1×106全克隆細(xì)胞各8只。每日觀察裸鼠的精神、飲食、體質(zhì)量，移植瘤形成后需測(cè)量瘤體直徑。待瘤體直徑達(dá)1.5 cm時(shí)處死裸鼠，移植瘤體置10%甲醛固定液中固定,石蠟包埋,常規(guī)病理切片及HE染色。

1.2.1.3細(xì)胞全克隆干細(xì)胞表面標(biāo)志物mRNA檢測(cè)采用qRT-PCR。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞及典型的全克隆(同類型克隆組合)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/mL，吸取1 mL單細(xì)胞懸液至EP管中，2 000 r/min離心5 min，棄去上清。用TRIzol法提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。real-time PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 10 min、95 ℃ 10 s、65 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。以β-actin為內(nèi)參基因，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所獲Ct對(duì)各基因進(jìn)行相對(duì)定量分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，結(jié)果以2-ΔΔCt法表示。

1.2.1.4細(xì)胞全克隆懸浮球形成率計(jì)算取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2及其全克隆、部分克隆、旁克隆,胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞，用配制好的mTeSRTM1人胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為2 000個(gè)/mL。接種于低黏附96孔板,每孔100 μL，即每孔200個(gè)細(xì)胞,每一種細(xì)胞設(shè)10個(gè)復(fù)孔，每天觀察細(xì)胞成球情況。3 d后向每孔加入含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基80 μL。10 d后計(jì)算≥100個(gè)細(xì)胞的“球囊”數(shù),計(jì)算懸浮球形成率。懸浮球形成率=球囊數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

表1　目的基因引物序列

1.2.2肝癌干細(xì)胞耐藥特性檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2單細(xì)胞培養(yǎng)形成全克隆，第12天分別加入含0.5、0.3、0.2、0.1、0.05、0.01 μg/mL濃度阿霉素的培養(yǎng)基，24 h后換液，48 h后改換不含阿霉素的正常培養(yǎng)基，其后觀察2 d，觀察全克隆生長(zhǎng)情況。將完整存活的全克隆進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，將持續(xù)擴(kuò)增的全克隆進(jìn)行裸鼠皮下荷瘤實(shí)驗(yàn)。

2　結(jié)果

HepG2單細(xì)胞培養(yǎng)均可形成全克隆、部分克隆、旁克隆細(xì)胞形態(tài)。從生長(zhǎng)曲線可以看出，第7天以后全克隆增殖速度最快，細(xì)胞數(shù)量最大，部分克隆次之，旁克隆增殖最慢并于第10天開始出現(xiàn)細(xì)胞皺縮死亡。HepG2細(xì)胞克隆形成率為32.78%±9.03%，其中全克隆、部分克隆、旁克隆百分比分別為7.12%±2.96%、62.67%±13.39%、30.21%±14.87%。HepG2單個(gè)細(xì)胞于第14天形成全克隆，細(xì)胞排列規(guī)則、緊湊，邊界光滑清晰；轉(zhuǎn)至24孔板培養(yǎng)到第16天細(xì)胞成克隆團(tuán)分布，后逐漸連接成片狀生長(zhǎng)；第22天轉(zhuǎn)至6孔板后持續(xù)擴(kuò)增，于第32天轉(zhuǎn)至培養(yǎng)瓶，細(xì)胞呈鋪路石狀生長(zhǎng)迅速，狀態(tài)良好(圖1)。1×104個(gè)HepG2細(xì)胞全克隆接種裸鼠成瘤率為12.5%(1/8),成瘤時(shí)間為接種后的第32天，第56天瘤體直徑7.3 mm; 1×106個(gè)HepG2細(xì)胞全克隆接種裸鼠成瘤率為100%(8/8)，成瘤時(shí)間為接種后的第4～5天，第28天瘤體直徑為(10.49±1.25)mm。與HepG2細(xì)胞相比，單細(xì)胞全克隆ABCG2、CD44、ALDH1A3、CXCR4和OCT4表達(dá)倍數(shù)分別為2.26±0.33、2.67±0.55、3.96±1.56、2.56±0.55、1.05±0.40，兩者ABCG2、ALDH1A3、CD44、CXCR4相比,P均<0.05。在懸浮球形成實(shí)驗(yàn)中,只有HepG2細(xì)胞全克隆有懸浮球形成,其余細(xì)胞系不形成懸浮球,均于第3天開始逐漸皺縮死亡，全克隆懸浮球形成率為8.79%±5.62%。

圖1　HepG2單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)形成的全克隆

HepG2細(xì)胞全克隆分別加入0.5、0.3、0.2 μg/mL阿霉素后48 h逐漸萎縮死亡，換正常培養(yǎng)基2 d后，幾乎無細(xì)胞存活。HepG2細(xì)胞全克隆加入0.1、0.05、0.01 μg/mL阿霉素后，出現(xiàn)部分或少數(shù)細(xì)胞變圓變亮死亡，更換正常培養(yǎng)基后大部分全克隆細(xì)胞狀態(tài)良好，轉(zhuǎn)至24孔板后，細(xì)胞呈鋪路石狀生長(zhǎng)迅速。加入0.1、0.05、0.01 μg/mL阿霉素HepG2細(xì)胞全克隆接種裸鼠成瘤率均為100%(5/5)，成瘤時(shí)間為接種后的第4～5天，第28天瘤體直徑分別為(9.27±2.06)、(12.92±1.88)、(11.62±0.07)mm。

3　討論

對(duì)于體外單細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)方式，早期的研究表明，皮膚的上皮細(xì)胞單個(gè)培養(yǎng)時(shí)，會(huì)形成全克隆、部分克隆和旁克隆3種生長(zhǎng)形態(tài)，其中全克隆在二次克隆形成實(shí)驗(yàn)中大部分可以連續(xù)傳代下去，只有<5%的細(xì)胞分化，被認(rèn)為是富含干細(xì)胞的群體；而旁克隆面積小，構(gòu)成細(xì)胞體型大且排列極不規(guī)則，在二次克隆形成實(shí)驗(yàn)中不能形成克隆；部分克隆介于全克隆和旁克隆之間，也因此認(rèn)為部分克隆只有少量干細(xì)胞群存在，旁克隆則是基本為分化的細(xì)胞群，無干細(xì)胞[4]。因此，在同是源于上皮細(xì)胞組織的癌干細(xì)胞研究中，多位研究者在體外單細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)乳腺癌[5]、前列腺癌[6]、胰腺癌[7]和卵巢癌[8]等腫瘤的全克隆成瘤性很高，1×103個(gè)來源于全克隆的細(xì)胞就可使NOD/SCID鼠形成皮下移植瘤，但來源于部分克隆或旁克隆的細(xì)胞即使1×105個(gè)也無法成瘤[9]。本研究組前期研究也發(fā)現(xiàn)，腎上腺皮質(zhì)癌也有類似的現(xiàn)象[10]，在本次研究中，將全克隆細(xì)胞的成瘤性實(shí)驗(yàn)接種對(duì)象更換為Bald/C裸鼠，1×104與1×106個(gè)細(xì)胞水平均可部分或全部成瘤，即在免疫功能明顯強(qiáng)于NOD/SCID鼠的裸鼠體內(nèi)也能成瘤，提示HepG2單細(xì)胞培養(yǎng)形成的全克隆富含肝癌干細(xì)胞。在無血清懸浮球培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，HepG2全克隆細(xì)胞有懸浮球形成，另兩種克隆細(xì)胞系均不形成懸浮球，并逐漸皺縮死亡。這提示HepG2全克隆細(xì)胞具有更強(qiáng)的腫瘤干細(xì)胞特性，即自我更新及增殖能力，可以在無血清的培養(yǎng)條件下成球狀生長(zhǎng)。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HepG2全克隆細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物ABCG2、CD44、ALDH1A3、CXCR4表達(dá)水平顯著升高，而OCT4則與旁克隆與部分克隆無顯著差異，其中CD44、CXCR4分子標(biāo)志與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[11,12]。ABCG2是典型的耐藥蛋白[13]，可見HepG2全克隆細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲性和耐藥性，這也與腫瘤干細(xì)胞特性是一致的。因此，肝癌HepG2細(xì)胞體外單細(xì)胞培養(yǎng)形成的全克隆極可能富含癌干細(xì)胞。

在單細(xì)胞培養(yǎng)形成全克隆的具體判定中，全克隆的標(biāo)準(zhǔn)主要是克隆面積為10～30 mm2，含有(2～5)×104個(gè)細(xì)胞，克隆結(jié)構(gòu)緊湊且邊界光滑，形狀規(guī)則多為圓形，克隆內(nèi)細(xì)胞體積小且排列緊密[4]。這都是初步的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，容易受不同評(píng)判觀察者主觀因素的影響，因此，在研究中增加了觀察全克隆耐藥特性的干預(yù)實(shí)驗(yàn)，選用細(xì)胞毒性的周期非特異性化療藥物阿霉素[14]，干細(xì)胞ABCG2等耐藥蛋白可以泵出阿霉素，顯示其抗藥特性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)所選的HepG2全克隆可以耐受較高的阿霉素濃度(0.1 μg/mL)，能夠維持其生長(zhǎng)活性和較強(qiáng)的成瘤特性，而該濃度阿霉素可以基本抑制普通培養(yǎng)體系中的HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)活性，導(dǎo)致大部分細(xì)胞死亡。說明體外單細(xì)胞培養(yǎng)的HepG2全克隆細(xì)胞群體可耐受阿霉素殺傷，極有可能是富含肝癌干細(xì)胞群體。因此，在對(duì)單個(gè)癌細(xì)胞培養(yǎng)形成的全克隆判定后再進(jìn)行阿霉素等化療藥物干預(yù)，這可能是簡(jiǎn)單有效改良型體外腫瘤干細(xì)胞富集模式，可為腫瘤干細(xì)胞的研究提供細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1] Reya T， Morrislon SJ， CIarke MF， et al．Stem cells， cancer， and cancer Stem cells[J]． Nature， 2001，414(6859)：105-111．

[2] Reynolds BA, Weiss S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervoussystem[J]. Science, 1992,255(5052):1707-1710.

[3] Chaichana KL, Mcgirt MJ, Frazier J, et al. Relationship of glioblastoma multiforme to the lateral ventricles predicts survival following tumor resection[J]. J Neurooncol, 2008,89(2):219-224.

[4] Barrandon Y， Green H． Three clonal types of keratinocyte with different capacities for multiplication [J]． Proc Natl Acad Sci U S A， 1987，84(8)：2302-2306．

[5] Al-Hajj M, Wicha MS, Benito-Hernandez A, et al. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2003,100(7):3983-3988.

[6] Collins AT, Berry PA , Hyde C, et al. Prospective identification of tu-morigenic prostate cancer stem cells[J]. Cancer Res, 2005,65(23):10946-10951.

[7] Li C, Heidt DG, Dalerba P, et al. Identification of pancreatic cancer stem cells[J]. Cancer Res, 2007,67(3):1030-1037.

[8] Zhang S, Balch C, Chan MW, et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors[J]. Cancer Res, 2008,68(11):4311-4320.

[9] Li H， Chen X， Calhoun-Davis T， et al． PC3 human prostate carcinoma cell holoclones contain self-renewing tumor-initiating cells[J]. Cancer Res， 2008，68(6)：1820-1825．

[10]Zeng W, Chen X．A Novel Approach for enriching cancer stem cells from the human SW-13 adrenocortical carcinoma cell Line[J]. Anticancer Research, 2014,34(1):117-123.

[11] Locke M, Heydon M, Fawell S, et al. Retention of intrinsic stem cell hierarchies in carcinoma-derived cell lines[J]. Cancer Res, 2005,65(19):8944-8950.

[12] Scotton CJ, Wilson JL, Scott K, et al. Multiple actions of the chemokine CXCL12 on epithelial tumor cells in human ovarian cancer[J]. Cancer Res, 2002,62(20):5930-5938.

[13] Doyle L, Ross DD. Multidrug resistance mediated by the breast cancer resistance protein BCRP(ABCG2)[J]. Oncogene, 2003,22(47):7340-7358.

[14] Onishi H, Yamaguchi M, Kuriyama K, et al. Effect of concurrent intra-arterial infusion of platinum drugs for patients with stage Ⅲ or Ⅳ uterine cervical cancer treated with radical radiation therapy[J]. Cancer J Sci Am, 2000,6(1):40-45.

Establishment of enrichment pattern of hepatocellular carcinoma stem cells in vitro

YANGShuai1,CHENJuan,SHEZuoya,CHENXiangyi,CAIJie,KUANGXiaocong

(1Departmentofdathophysiology,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To establish the enrichment pattern of hepatocellular carcinoma stem cells in vitro. Methods The hepatoblastoma cell line HepG2 was selected to establish the system of single-cell colony formation by limiting dilution in vitro, and we observed the growth curve of single-cell clones in vitro and the formation ratio of holoclone (Holo), meroclone (Mero) and pareclone (Pare). The holoclones were selected to amplify and then the 1×104and 1×106hepatocellular carcinoma cells were inoculated subcutaneously in nude mice. The mRNA expression of CSC markers (ABCG2, ALDH1A3, OCT4, CD44 and CXCR4) was detected by qRT-PCR. Sphere formation ratio of the holoclones was detected by tumor cell sphere culture. After holoclones were intervented by 0.5, 0.3, 0.2, 0.1, 0.05 and 0.01 μg/mL adriamyc for 48 h, we observed the growth of holoclones. For the survival holoclones after intervention, all progressive amplification and inoculation subcutaneously in nude mice were conducted. ResultsThe clone formation rate of HepG2 cells was 32.78%±9.03%, among which the percentage of holoclones was 7.12%±2.96%, the percentage of meroclones was 62.69%±13.39%, and the percentage of pareclones was 30.21%±14.87%. All the holoclones could be amplified and the tumor formation rates in the 104 and 106 HepG2 cells in nude mice were respectively 12.5% and 100%. Compared with HepG2 cells, the times of ABCG2, CD44, ALDH1A3, CXCR4 and OCT4 expression in the holoclones were 2.26±0.33, 2.67±0.55, 3.96±1.56, 2.56±0.55 and 1.05±0.40. Significant difference was found between ABCG2, ALDH1A3, CD44 and CXCR4 (allP<0.05). Only HepG2 holoclones could form suspension sphere. After the single cell clone culture, the holoclones were intervened by adriamyc, only HepG2 holoclones intervened by 0.1, 0.05 and 0.01 μg/mL adriamyc were survival, and the tumor formation rate in nude mice was 100%. Conclusion The enrichment pattern of liver cancer stem cells is successfully constructed in vitro.

cancer stem cells; hepatocellular carcinoma stem cells; holoclone; cell culture

廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2013GXNSFAA019244)。

楊帥(1987-)，女，碩士，主要從事癌干細(xì)胞的特性及富集分離方法的研究。E-mail: 785322903@qq.com

簡(jiǎn)介：鄺曉聰(1970-)，男，副教授，主要從事癌干細(xì)胞及免疫抑制劑的研發(fā)。E-mail: 13617715826@139.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.23.001

R73

A

1002-266X(2016)23-0001-04

2015-11-25)