P311和TGF-β1在IgA腎病腎組織中的表達及意義

王豐平，樊均明，李正

（1.成都市第一人民醫院腎臟內科，四川610041；2.瀘州醫學院，四川瀘州646000）

P311和TGF-β1在IgA腎病腎組織中的表達及意義

王豐平1，樊均明2，李正1

（1.成都市第一人民醫院腎臟內科，四川610041；2.瀘州醫學院，四川瀘州646000）

目的探討P311和轉化生長因子β1（TGF-β1）在IgA腎病（IgAN）腎組織中的表達及意義。方法應用免疫組織化學方法檢測57例IgAN腎組織（IgAN組）和5例正常腎組織（對照組）中P311和TGF-β1的表達情況，同時測定IgAN患者24 h尿蛋白定量、血壓、血清肌酐（SCr）、肌酐清除率等，分析P311、TGF-β1表達與不同臨床分組、病理分級、有無高血壓、蛋白尿程度、SCr水平的關系。結果IgAN組患者腎組織中P311表達明顯高于對照組，且與病理分級呈正相關；小管間質中P311表達與TGF-β1表達、24 h尿蛋白定量等明顯相關；SCr＞133 μumol/L組患者腎組織中P311表達高于SCr＜133 μmol/L組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論在IgAN腎組織中P311表達與TGF-β1表達、蛋白尿、腎臟病理分級相關。P311是腎組織纖維化過程中的關鍵因子，且參與了IgAN疾病進展。

腎小球腎炎，IGA；腎小管；纖維化；轉化生長因子β1；P311

IgA腎病（immunoglobulin A nephropathy，IgAN）是一種常見的腎小球疾病，是導致終末期腎衰竭的重要原因之一。近年來有研究表明，在IgAN患者腎功能逐漸進展過程中腎間質病變具有決定性作用［1-2］。大量研究已證實，腎小管上皮細胞轉分化（tubular epithelial myofibroblast transdifferentiation，TEMT）是腎間質纖維化的重要機制，而轉化生長因子β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）是調節TEMT的重要細胞因子［3］。P311是新近發現的一種重要的參與細胞分化的轉錄因子，相對分子質量為8×103，不屬于任何已知的蛋白質家族［4］。有研究發現，P311通過與TGF-β1前體相關蛋白（latency associated protein，LAP）結合，參與了轉分化過程［5］。但P311是否表達于IgAN患者腎組織中，是否參與了TEMT目前尚鮮見文獻報道。本研究觀察了P311和TGF-β1在IgAN腎組織中的表達及其與病變程度、臨床指標的相關性，對探討IgAN的進展機制及研究延緩腎功能損害措施具有一定意義。

1　資料與方法

1.1資料

1.1.1標本來源選取2012～2013年四川大學華西醫院腎臟內科、四川省成都市第一人民醫院腎臟內科收治的行腎活檢穿刺檢查的IgAN患者57例（IgAN組），其中男27例，女30例；年齡15～53歲。57例患者均行超聲引導下腎穿刺活檢術，腎臟組織病理學檢查符合IgAN診斷標準（病理類型均依據1997年世界衛生組織制定的IgAN病理分型標準劃分），排除狼瘡性腎炎、乙型肝炎病毒相關性腎炎、紫癜性腎炎等繼發性病變及腎腫瘤。選取2012～2013年四川大學華西醫院泌尿外科因腎結核或腎腫瘤行手術治療患者5例，取遠離病變的正常腎組織作為對照組。

1.1.2主要試劑小鼠抗人P311多克隆抗體、SABC（strept avidin-biotin complex）免疫組織化學（免疫組化）試劑盒、二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑均購自北京博奧森公司。小鼠抗人TGF-β1單克隆抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。載玻片購自上海精輪工業玻璃有限公司，并用1∶10多聚賴氨酸溶液處理。

1.2方法

1.2.1免疫組化SP法檢測P311和TGF-β1在腎組織中的表達標本經10%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片厚3 μm，常規脫蠟入水，用3%過氧化氫浸泡，微波抗原修復15 min，正常血清封閉液封閉后加入P311多克隆抗體或TGF-β1單克隆抗體，4℃過夜，然后加入辣根過氧化物酶耦聯的羊抗小鼠IgG，室溫下孵育10 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）沖洗后DAB顯色，蘇木素復染、脫水、透明、中性樹脂封片。對照組用PBS代替一抗，其余步驟相同。

1.2.2圖像定量分析免疫組化染色結果采用Smartscape圖像分析系統進行分析。對每例切片隨機選取10個不重疊視野（100×），自動測定陽性面積灰度值，取平均值。

1.2.3觀察指標觀察并記錄57例患者病史包括患者年齡、性別、臨床表現及實驗室檢查結果等，腎穿刺活檢前1～3 d檢測24 h尿蛋白定量、血尿程度、肌酐清除率等。

1.2.4病理診斷標準對納入研究對象腎組織標本進行光鏡、免疫熒光等檢查。病理診斷和分型標準參照Lee氏分級［6］。將Lee氏Ⅰ、Ⅱ級定義為輕度病變組，Ⅲ級定義為中度病變組，Ⅳ、Ⅴ級定義為重度病變組。

1.3統計學處理應用SPSS13.0統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析；采用Spearman等級相關進行相關性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組患者一般資料比較輕度病變組患者蛋白尿定量、大量蛋白尿百分比、血清肌酐（serum creatinine，SCr）、腎小球濾過率（glomerular filtration rate，GFR）與中、重度病變組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1　各組患者一般資料比較（±s）

表1　各組患者一般資料比較（±s）

注：與輕度病變組比較，aP＜0.05；與中度病變組比較，bP＜0.05；-表示無此項；1 mm Hg=0.133 kPa。

項目對照組（n=5）輕度病變組（n=27）中度病變組（n=20）重度病變組（n=10）年齡（±s，歲）男/女（n/n）收縮壓（±s，mm Hg）舒張壓（±s，mm Hg）蛋白尿定量（±s，g/24 h）大量蛋白尿百分比（%）SCr（±s，μmol/L）GFR（±s，mL/min）33.00±6.29 1/4 114.40±8.68 87.80±6.06 0.20±0.08 0.00 56.12±11.47 -31.22±10.76 10/17 110.09±35.19 71.99±25.62 2.72±2.33 3.33 92.63±49.42 81.84±32.46 39.40±13.96 11/9 126.19±22.44 83.06±17.91 2.41±1.61a30.00a107.05±28.51a62.69±16.40a35.30±10.22 6/4 134.15±23.66 87.60±18.58 4.69±2.35ab70.00ab201.37±244.05ab48.39±19.35ab

2.2各組患者腎組織中P311、TGF-β1表達比較對照組患者腎組織中P311不表達，僅有少量TGF-β1表達于腎小球系膜細胞及腎小管上皮細胞質中，見圖1。IgAN組患者腎組織中P311陽性物質呈棕色或棕褐色顆粒，主要定位于小管上皮細胞質中，而在腎小球中并沒有檢測到P311陽性染色，見圖2。IgAN組患者腎組織小管間質中存在更強的TGF-β1染色，TGF-β1陽性染色不僅定位于小管上皮細胞質中，在腎小球系膜細胞、臟層和壁層上皮細胞中也存在陽性染色，見圖3。輕、中、重度病變組患者腎組織中P311、TGF-β1表達比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表2。

圖1　對照組腎組織中P311、TGF-β1的表達（免疫組化SP法，200×）

圖2　各IgAN亞組腎組織中P311的表達（免疫組化SP法，200×）

圖3　各IgAN亞組腎組織中TGF-β1的表達（免疫組化SP法，200×）

表2　各組患者腎組織中P311、TGF-β1表達比較（±s）

表2　各組患者腎組織中P311、TGF-β1表達比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與輕度病變組比較，bP＜0.05；與中度病變組比較，cP＜0.05。

檢測指標對照組（n=5）輕度病變組（n=27）中度病變組（n=20）重度病變組（n=10）P311 TGF-β1 0.00±0.00 1.08±1.14 1.95±2.75a2.42±3.21a5.00±7.86ab5.73±9.22ab20.09±15.78abc26.49±25.41abc

2.4P311與TGF-β1表達的一致性IgAN組患者腎組織中P311、TGF-β1均存在明顯高表達，二者在小管上皮細胞中均存在強陽性染色，見圖2、3。P311表達與TGF-β1表達明顯相關（r=0.921，P＜0.01）。

2.5P311表達與臨床指標的相關性IgAN組患者腎組織中P311表達與患者24 h尿蛋白定量呈正相關（r= 0.291，P＜0.05）。SCr＞133 μmol/L組（19例）P311表達明顯高于SCr＜133 μmol/L組（38例），分別為（14.59± 15.01）μmol/L、（4.63±8.63）%，差異有統計學意義（t= 2.93，P＜0.05）。P311表達與SCr、GFR估計值呈正相關（r=0.232、0.181，P＜0.05）。

3　討論

IgAN是最常見的原發性腎小球腎炎，占腎活檢患者的1/3，15%～40%IgAN患者最終發展為終末期腎病［1］。系膜細胞的激活和細胞因子的分泌參與了IgAN的發生、發展［7］。在腎小球損傷過程中炎癥細胞與介質滲透到腎間質，促使各種炎性細胞因子的釋放。這些炎性細胞因子刺激腎小管上皮細胞轉分化為肌成纖維細胞，導致細胞外基質（extracellular matrix，ECM）增多并在小管間質組織中積聚。炎性細胞因子的分泌、腎小管上皮細胞轉分化、ECM的積聚最終導致小管間質纖維化［7］。IgAN小管間質纖維化被認為是導致終末期腎衰竭的最終通路［7］。

多種細胞因子參與了小管間質纖維化的進展，TGF-β1是控制這一過程的重要細胞因子［2，8-10］。TGF-β1是一種多功能細胞因子。在炎癥狀態下機體以無活性形式分泌TGF-β1復合物，其含有LAP。通過細胞外修飾剪切掉LAP，TGF-β1被激活［11］。TGF-β1和LAP的非共價鍵在體外能被熱、極端pH和其他一些因素打斷。然而在體內TGF-β1和LAP的非共價鍵主要通過激活作用而斷裂。活化的TGF-β1通過與具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的Ⅰ、Ⅱ型受體結合，激活細胞內Smad信號傳導途徑，促進纖維化的發生、發展［12］。

由于LAP能調節TGF-β1的活性，使LAP具有調節TGF-β1多種效應的關鍵作用。LAP在病理狀態下具有重要作用。對皮膚纖維化的動物模型給予LAP治療，LAP抑制了部分TGF-β1介導的纖維化信號。LAP具有趨化因子活性和抗炎活性，且其功能均獨立于TGF-β1。新近研究發現，P311通過與LAP結合，改變LAP構象，調控TGF-β1激活，誘導成纖維細胞表型轉變為肌成纖維細胞，提示P311可能參與了纖維化過程［4］。

P311是新近發現的一種參與細胞分化的重要轉錄因子。P311基因定位于5號染色體長臂5q22區，是編碼含68個氨基酸的蛋白，相對分子質量為8×103，該蛋白不屬于任何已知的蛋白質家族，目前，其生物學功能尚不十分清楚。P311的N末端存在PEST結構域［富含脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸的區域］，該結構域是泛素/蛋白酶通路的高效作用靶點［4，13］。在體外培養的NIH3T3細胞中P311能與LAP結合，誘導肌成纖維細胞表型，上調α平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、表皮生長因子、血管內皮生長因子、血小板衍生生長因子受體表達，上調整合素表達，增加細胞增殖［4，13］。表明P311參與了纖維化過程，但是否參與了腎間質纖維化和小管上皮細胞轉分化，特別是是否參與了IgAN的發生、發展，目前尚不清楚。

本研究結果顯示，IgAN患者腎組織中的P311表達明顯高與對照組。另外IgAN患者腎組織中的P311表達與病理改變相關，病變程度越重，P311表達越高。P311表達上調的機制目前尚不十分清楚。作者認為，在IgAN早期，患者處于前炎癥狀態，可能是P311表達上調的原因。本研究結果顯示，IgAN患者腎組織中TGF-β1表達也上調。有趣的是，P311表達與TGF-β1表達明顯相關，不僅表現在量上，也表現在表達部位上。已有研究證明，TGF-β1是腎間質纖維化中的關鍵因子［2，8-10］。本研究結果顯示，P311可能與TGF-β1相互作用，并誘導小管間質纖維化。

在IgAN早期，患者處于前炎癥狀態，導致細胞增殖和細胞因子的分泌。同時前炎癥狀態也誘導P311的表達。由于P311能與LAP結合，可能通過幾種機制促進了腎小管間質纖維化。一方面P311與LAP結合后改變了LAP構象，抑制了LAP功能。被P311結合的LAP不能抑制TGF-β1的致纖維化信號，不能阻斷炎性反應。因此，被P311結合的LAP促進了炎癥和纖維化；另一方面P311表達上調，可能促進了無活性TGF-β1的激活。整合素在無活性TGF-β1的激活方面非常重要。上調的P311能增加α-SMA和整合素表達，增加細胞增殖，可能促進了TGF-β1的激活。活化的TGF-β1進一步促進了TEMT，上調ECM合成，最終導致腎小管間質纖維化。

本研究另一個重要發現是P311表達與臨床數據密切相關。IgAN患者腎組織中P311表達與24 h尿蛋白定量、腎小管間質纖維化程度相關，SCr＞133 μmol/L組P311表達高于SCr＜133 μmol/L組。IgAN患者P311、TGF-β1表達明顯高于對照組，且2種蛋白的表達與臨床指標均相關。

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Expression and significance of P311 and TGF-β1 in renal tissue of IgA nephropathy

Wang Fengping1，Fan Junming2，Li Zheng1（1.Department of Nephrology，Chengdu Municipal First People′s Hospital，Chengdu，Sichuan 610041，China；2.Luzhou Medical College，Luzhou，Sichuan 646000，China）

ObjectiveTo investigate the expression and significance of P311 and TGF-β1 in renal tissue of immunoglobulin-A nephropathy（IgAN）.MethodsThe expression levels of P311 and TGF-β1 were detected in the renal tissues of 57 cases of IgAN（IgAN group）and 5 cases of normal renal tissue（control group）by using the immunohistochemistry method.Meanwhile 24 h proteinuria，blood pressure，serum creatinine（SCr）and CCR in the IgAN patients were detected.Then the relation between P311 and TGF-β1 with different clinical groups，pathological grades，hypertension，proteinuria severity and SCr was analyzed. ResultsThe P311 expression in renal tissue of IgAN patients was significantly higher than that in the control group and was positively correlated with the pathological grade.The P311 expression in tubulointerstitial tissue was significantly correlated with TGF-β1 and proteinuria.The P311 expression in the SCr＞133 μmol/L group was higher than that in the SCr＜133 μmol/L group，the difference was statistically significant（P＜0.05）.ConclusionThe P311 protein expression in renal tissue of IgAN is correlates with TGF-β1 expression，proteinuria and renal pathological grade.P311 is a key factor in the renal tissue fibrosis process，moreover participates in the IgAN progression.

Glomerulonephritis，IGA；Kidney tubules；Fibrosis；Transforming growth factor beta1；P311

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.12.007

A

1009-5519（2016）12-1797-03

王豐平（1979-），博士研究生，主治醫師，主要從事腎病臨床及基礎研究工作。

（2016-02-17）