一株固化珊瑚砂的巴斯德芽孢桿菌的特性研究

張　楠，方祥位，洛桑銀巴，李　捷，歐益希，高菱悅

(1.后勤工程學院 國防建筑規劃與環境工程系，重慶 401311；2.后勤工程學院 軍事土木工程系，重慶401311；3.95526部隊,西藏 拉薩 850000；4.91241部隊，廣西 桂平 537200；5.93668部隊，北京 100005)

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一株固化珊瑚砂的巴斯德芽孢桿菌的特性研究

張楠1，方祥位2，洛桑銀巴3，李捷2，歐益希4，高菱悅5

(1.后勤工程學院 國防建筑規劃與環境工程系，重慶 401311；2.后勤工程學院 軍事土木工程系，重慶401311；3.95526部隊,西藏 拉薩 850000；4.91241部隊，廣西 桂平 537200；5.93668部隊，北京 100005)

將一株具有分解尿素能力的巴斯德芽孢桿菌在不同溫度、pH值、NaCl濃度下培養，通過測定脲酶活性探討其最適生長條件；而后將最適生長條件下培養的菌懸液用于珊瑚砂固化實驗，研究其固化珊瑚砂的能力。結果表明，該巴斯德芽孢桿菌最適生長條件為：溫度30～33 ℃、pH值8.0、NaCl濃度20 g·L-1；將其用于固化珊瑚砂，可使松散的珊瑚砂顆粒膠結形成具有一定強度的砂柱，但受模具限制和砂柱固化過程中滲透性的影響，砂柱各部分固化強度不一致。

巴斯德芽孢桿菌；珊瑚砂；固化；特性

珊瑚砂是熱帶海洋中的一種疏松多孔、質脆易碎的特殊巖土介質，主要由珊瑚碎屑和其它海洋生物碎屑組成，碳酸鈣含量高達96%以上[1]。近年來，我國加大了對海洋石油、漁業資源的開發以及國防現代化的建設，迫切需要建設大型的珊瑚島礁工程。用傳統的土壤(砂土)固化方法(化學固化和物理固化)固化遠離陸地的珊瑚砂時，會遇到機械設備匱乏、原材料運輸困難、施工環境差、破壞島礁生態環境等問題，而微生物固化能夠克服這些缺點，是一種經濟環保的土壤固化方法。

微生物固化是自然界廣泛發生的一種作用[2]。微生物礦物學最新研究表明，巖土中某些特定的微生物可利用尿素等有機物及鈣離子源，較快地生成具有膠凝作用的碳酸鈣，使松散砂土固化成為可能[3-9]。目前，對普通砂(硅砂)的微生物固化已取得一定進展，但對遠離陸地、處于特殊環境(高含鹽量海水)下的珊瑚砂的微生物固化需考慮鹽度高、溫差大等海洋環境因素，鮮有研究。

鑒于此，作者以固化珊瑚砂的巴斯德芽孢桿菌為對象，研究該菌在不同環境下的生長特性，探討其最適生長溫度、pH值、NaCl濃度，初步考察其對珊瑚砂的固化能力，擬為珊瑚砂的微生物固化提供參考。

1　實驗

1.1菌種與培養基

巴斯德芽孢桿菌(Bacilluspasteurii)，購于德國微生物菌種保藏中心(DSMZ)。

LB液體培養基：胰蛋白胨1 g，酵母浸出粉1 g，NaCl 2 g，蒸餾水定容至100 mL，2 mol·L-1的NaOH溶液調pH值至7.0，121 ℃高溫蒸汽滅菌30 min。LB固體培養基需加入2 g瓊脂粉。

LB-尿素液體培養基：在上述LB液體培養基滅菌30 min后，加入2 g尿素。LB-尿素固體培養基需加入2 g瓊脂粉。

1.2菌懸液的制備

采用濕重法配制菌懸液：將巴斯德芽孢桿菌置于LB固體培養基上復活，挑取單菌落于LB液體培養基上，32 ℃、200 r·min-1振蕩培養36 h，7 000 r·min-1離心5 min，去上清，稱菌體濕重，用0.85%的無菌生理鹽水配制質量分數為10%的菌懸液。

1.3珊瑚砂固化細菌的生長特性研究

1.3.1溫度對菌株生長的影響

微生物生長的溫度范圍通常很寬，但有一個最適生長溫度或范圍。

1)適宜菌株生長的溫度范圍的確定

將巴斯德芽孢桿菌分區劃線于LB平板上，分別置于20 ℃、30 ℃、40 ℃和50 ℃的生化培養箱中培養48 h，觀察菌落的大小和數量，確定適宜菌株生長的溫度范圍。

2)菌株最適生長溫度的確定

在上述溫度范圍內，選取適當的溫度，取0.2 mL菌懸液加入100 mL的LB-尿素液體培養基中，于生化培養箱中靜置培養48 h。采用DDS-307A型電導率儀(上海佑科儀器儀表有限公司)測定未加菌懸液時的初始電導率和培養48 h后的電導率，計算電導率變化值△K(以△K表征菌株的脲酶活性)，確定菌株的最適生長溫度(同時做3個平行實驗，取平均值，下同)。

1.3.2pH值對菌株生長的影響

用2 mol·L-1的鹽酸或2 mol·L-1的NaOH溶液將100 mL LB-尿素液體培養基的pH值分別調至6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，加入菌懸液0.2 mL，于32 ℃、200 r·min-1振蕩培養48 h，測定未加菌懸液時的初始電導率和培養48 h后的電導率，計算電導率變化值△K，確定菌株的最適生長pH值。

1.3.3NaCl濃度對菌株生長的影響

1)適宜菌株生長的NaCl濃度范圍的確定

在100 mL LB-尿素液體培養基中分別加入不同質量的NaCl，使培養基中NaCl濃度(g·L-1)分別為5、25、50、75、100，加入菌懸液0.2 mL，于32 ℃、200 r·min-1振蕩培養48 h，測定未加菌懸液時的初始電導率和培養48 h后的電導率，計算電導率變化值△K，確定適宜菌株生長的NaCl濃度范圍。

2)菌株最適生長NaCl濃度的確定

在上述NaCl濃度范圍內適當縮小考察范圍，配制不同NaCl濃度的培養基，并加入0.2 mL菌懸液，于32 ℃、200 r·min-1振蕩培養48 h，測定未加菌懸液時的初始電導率和培養48 h后的電導率，計算電導率變化值△K，確定菌株生長的最適NaCl濃度。

1.4珊瑚砂的微生物固化研究

1.4.1原理

產脲酶微生物可以利用環境中的尿素和鈣離子源，較快地生成具有膠凝作用的碳酸鈣。與一般化學作用生成的碳酸鈣不同，這種微生物成因的碳酸鈣材料的生成速度及強度可控，并可作為粘結劑將松散的砂粒粘結成強度及滲透性可控的人造砂礫石。

巴斯德芽孢桿菌固化珊瑚砂的原理如下[10-11]：

Ca2++cell(帶負電的微生物細胞)→cell-Ca2+

1.4.2固化過程

固化前準備：(1)將巴斯德芽孢桿菌加入pH值為8.0的LB-尿素液體培養基上，于32 ℃、200 r·min-1振蕩培養48 h，備用；(2)用孔徑為3.2 mm的檢驗篩對珊瑚砂進行篩分；(3)配制相同濃度、體積比為1∶1的尿素-氯化鈣混合溶液作為粘結液；(4)用50 mL一次性注射器(內徑3 cm、高11.5 cm)作為模具，按生化纖維棉-珊瑚砂-生化纖維棉依次鋪設(圖1)。

圖1　珊瑚砂的微生物固化實驗裝置Fig.1　Equipment for biocementation of coral sand

固化：加入菌懸液，讓其流過模具，使珊瑚砂充分截留細菌；加入粘結液；調節止水夾，控制粘結液以低流速流出模具，使粘結液與截留在珊瑚砂柱中的細菌充分反應，直至粘結液不再滲出；取下模具，置于恒溫烘箱中烘干；取出珊瑚砂柱，觀察固化效果。

2　結果與討論

2.1珊瑚砂固化細菌的生長特性

2.1.1最適生長溫度

將巴斯德芽孢桿菌分別在20 ℃、30 ℃、40 ℃和50 ℃下培養48 h。結果發現，菌株在20 ℃、30 ℃和40 ℃下生長較好，其中在30 ℃時的菌株個體形態最大，而50 ℃下肉眼幾乎看不見單菌落。因此，選擇適宜菌株生長的溫度范圍為20～40 ℃。

為確定最適生長溫度，分別在24 ℃、27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃和39 ℃下進行培養，測定電導率，并計算電導率變化值△K，考察溫度對細菌脲酶活性的影響，結果見圖2。

圖2　溫度對細菌脲酶活性的影響Fig.2　Effect of temperature on bacterial urease activity

由圖2可見，隨著溫度的升高，△K先增大后減小，在30～33 ℃時△K達到最大值9.2；且24～30 ℃時的△K增大趨勢明顯比33～39 ℃的減小趨勢緩和。表明，24～33 ℃比33～39 ℃更有利于巴斯德芽孢桿菌生長，而30～33 ℃最適宜巴斯德芽孢桿菌生長。因此，確定菌株的最適生長溫度為30～33 ℃。

2.1.2最適生長pH值

pH值對細菌脲酶活性的影響見圖3。

圖3　pH值對細菌脲酶活性的影響Fig.3　Effect of pH value on bacterial urease activity

由圖3可見，隨著pH值的升高，△K先增大后減小，在pH值為8.0時△K達到最大值12.9。因此，確定菌株的最適生長pH值為8.0。

2.1.3最適生長NaCl濃度

在不同NaCl濃度的培養基中加入菌懸液，于32 ℃、200 r·min-1振蕩培養48 h，考察NaCl濃度對細菌脲酶活性的影響，結果見圖4。

圖4　NaCl濃度對細菌脲酶活性的影響Fig.4　Effect of NaCl concentration on bacterial urease activity

由圖4可見，隨著NaCl濃度的增加，△K先快速增大后緩慢減小，在NaCl濃度為25 g·L-1時達到最大值12.8；且在20～60 g·L-1范圍內的△K均較大。因此，選擇20～60 g·L-1為適宜菌株生長的NaCl濃度范圍。

為確定菌株的最適生長NaCl濃度，分別在NaCl濃度(g·L-1)為20、30、40、50、60的培養基中培養，考察NaCl濃度對細菌脲酶活性的影響，結果見圖5。

由圖5可見，當NaCl濃度從20 g·L-1逐漸增加到60 g·L-1時，△K逐漸減小，在NaCl濃度為20～

圖5　最適生長NaCl濃度的確定Fig.5　Determination of optimal NaCl concentration

50 g·L-1時，△K減幅較小；在NaCl濃度超過50 g·L-1后，△K減幅明顯增大。因此，確定菌株生長的最適NaCl濃度為20 g·L-1。

2.2珊瑚砂的微生物固化效果

經過72 h固化，將砂柱模具烘干，取出珊瑚砂柱(圖6)，觀察固化效果。

圖6　微生物固化珊瑚砂柱Fig.6　Biocementation column of coral sand

為了便于砂柱直立，圖中砂柱與在模具中實際固化時的方向相反。由圖6可見，通過多次澆注固化，原本松散的珊瑚砂顆粒最終膠結形成具有一定強度的砂柱。砂柱的下半部分(實際位于模具中的上半部)明顯更加密實、紋路更少、空隙更小，固化效果更好。這可能是因為，加入菌懸液時，上半部快速反應并固化，使得上半部的珊瑚砂空隙變小，降低了粘結液在砂柱中的滲透性，導致下半部因碳酸鈣含量不足而使砂柱強度降低。因此，為獲得密實而均勻的珊瑚砂柱，須在后續實驗中設計并完善模具，以提高珊瑚砂柱的固化強度。

3　結論

通過測定脲酶活性，確定巴斯德芽孢桿菌的最適生長條件為：溫度30～33 ℃、pH值8.0、NaCl濃度20 g·L-1。將巴斯德芽孢桿菌在上述最適生長條件下培養后，用于珊瑚砂固化實驗，結果表明，經多次澆注固化后，松散的珊瑚砂顆粒最終膠結形成具有一定強度的砂柱，但受模具限制和砂柱固化過程中滲透性影響，砂柱各部分固化強度不一致。因此，為獲得密實而均勻的珊瑚砂柱，須在后續實驗中設計并完善模具，提高珊瑚砂柱的固化強度。該研究具有重要的工程實用價值和廣闊的應用前景。

[1]孫宗勛.南沙群島珊瑚砂工程性質研究[J].熱帶海洋,2000,19(2):1-8.

[2]崔福齋.生物礦化[M].北京:清華大學出版社,2007:1.

[3]RODRIGUEZ-NAVARRO C,RODRIGUEZ-GALLEGO M,BEN C K,et al.Conservation of ornamental stone byMyxococcusxanthus-induced carbonate biomineralization[J].Applied and Environmental Microbiology,2003,69(4):2182-2193.

[4]RODRIGUEZ-NAVARRO C,JIMENEZ-LOPEZ C,RODRIGUEZ-NAVARRO A,et al.Bacterially mediated mineralization of vaterite[J].Geochimica et Cosmochimica Acta,2007,71(5):1197-1213.

[5]JIMENEZ-LOPEZ C,JROUNDI F,PASCOLINI C,et al.Consolidation of quarry calcarenite by calcium carbonate precipitation induced by bacteria activated among the microbiota inhabiting the stone[J].International Biodeterioration & Biodegradation,2008,62(4):352-363.

[6]van PASSEN L A,DAZA C M,STAAL M,et al.In situ soil reinforcement by microbial denitrification[C]//Proceedings of 1stInternational Conference BGCE.Netherlands:TU Delft,2008:124-133.

[7]KARATAS I,KAVAZANJIAN E,RITTMANN B E.Microbially induced precipitation of calcite usingPseudomonasdenitrificans[C]//Proceedings of 1stInternational Conference BGCE.Netherlands:TU Delft,2008:58-66.

[8]CASTANIER S,METAYER-LEVREL G L,PERTHUISOT J P.Ca-Carbonates precipitation and limestone genesis：the microbiogeologist point of view[J].Sedimentary Geology,1999,126(1/2/3/4):9-23.

[9]MéTAYER-LEVRELA G L,CASTANIER S,ORIAL G,et al.Applications of bacterial carbonatogenesis to the protection and regeneration of limestones in buildings and historic patrimony[J].Sedimentary Geology,1999,126(1):25-34.

[10]GOLLAPUDI U K,KNUTSON C L,BANG S S,et al.A new method for controlling leaching through permeable channels[J].Chemosphere,1995,30(4):695-705.

[11]STOCKS-FISCHER S,GALINAT J K,BANG S S.Microbiological precipitation of CaCO3[J].Soil Biology and Biochemistry,1999,31(11):1563-1571.

Characteristics of aBacilluspasteuriiStrain for Cementation of Coral Sand

ZHANG Nan1,FANG Xiang-wei2,LUOSANG Yin-ba3,LI Jie2,OU Yi-xi4,GAO Ling-yue5

(1.DepartmentofNationalDefenseArchitecturePlanning&EnvironmentalEngineering,LogisticEngineeringUniversity,Chongqing401311,China;2.DepartmentofCivilEngineering,LogisticEngineeringUniversity,Chongqing401311,China;3.Unit95526,Lhasa850000,China;4.Unit91241,Guiping537200,China;5.Unit93668,Beijing100005,China)

TheoptimumgrowthconditionsofaBacillus pasteuriistrainthathadtheabilitytodecomposeureawerestudiedbymeasuringtheureaseactivityatdifferenttemperatures,pHvaluesandNaClconcentrations.TestsofcementationofcoralsandbyBacillus pasteuriiculturedundertheoptimumgrowthconditionswereconducted.Resultsindicatedthat,theoptimumgrowthconditionsofBacillus pasteuriiwereasfollows:temperatureof30～33 ℃,pHvalueof8.0,andNaClconcentrationof20g·L-1.AfterbiocementationofcoralsandbyBacillus pasteuriiculturedundertheoptimumgrowthconditions,loosecoralsandparticleswerebondedtoformsandcolumnswithcertainstrength.Duetothelimitationsoftestmouldandpermeabilityofsandcolumnincementingprocess,thestrengthsofdifferentpartsofsolidifiedsandcolumnwereinconsistent.

Bacillus pasteurii;coralsand;cementation;characteristics

國家自然科學基金資助項目(51479208，11272354)，總后勤部基建營房部資助項目(CY114C022)

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.10.005

X 172TU 411

A

1672-5425(2016)10-0023-04

張楠，方祥位，洛桑銀巴，等.一株固化珊瑚砂的巴斯德芽孢桿菌的特性研究[J].化學與生物工程，2016，33(10)：23-26.