HPLC法測(cè)定清肺消炎丸中三種抗炎成分含量

崔慶新, 廖承美, 陳志凱, 馬　芳, 陶　瑾

(南開(kāi)大學(xué) 藥學(xué)院, 天津　300071)

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HPLC法測(cè)定清肺消炎丸中三種抗炎成分含量

崔慶新, 廖承美, 陳志凱, 馬芳, 陶瑾

(南開(kāi)大學(xué) 藥學(xué)院, 天津300071)

采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)清肺消炎丸中牛蒡子苷、牛蒡子苷元和綠原酸進(jìn)行定量測(cè)定。色譜柱:Symmetry? C18柱。流動(dòng)相:牛蒡子苷、牛蒡子苷元采用甲醇-水(體積比為50∶50),檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；綠原酸采用乙腈-0.4%的磷酸(體積比為13∶87),檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm。 結(jié)果表明,清肺消炎丸中含牛蒡子苷4.07 mg/g,牛蒡子苷元0.19 mg/g,綠原酸0.076 mg/g。牛蒡子苷、牛蒡子苷元和綠原酸進(jìn)樣量分別在1.94～9.70 μg、0.20～1.00 μg、0.05～0.25 μg范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。牛蒡子苷、牛蒡子苷元和綠原酸的回收率分別為102.59%(RSD=1.69%,n=5)，98.17%(RSD=1.52%,n=5)和98.33%(RSD=1.46%,n=5)。該方法簡(jiǎn)單、精確、靈敏、專(zhuān)屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可定量測(cè)定清肺消炎丸中抗炎物質(zhì)含量。

清肺消炎丸； 牛蒡子苷； 牛蒡子苷元； 綠原酸； 高效液相色譜

清肺消炎丸配方包含8味藥材:麻黃、石膏、地龍、牛蒡子、葶藶子、人工牛黃、炒苦杏仁和羚羊角。牛蒡子是清肺消炎丸中起主要活性的藥材之一,為二年生菊科植物的干燥成熟果實(shí)。牛蒡子中含有多種化學(xué)成分,主要包括木脂素類(lèi)、萜類(lèi)、揮發(fā)油、脂肪酸和酚酸衍生物。其中,牛蒡子苷和牛蒡子苷元是木脂素類(lèi)中代表性有效成分[1],具有抗炎[2]、抗腫瘤[3]、熱休克反應(yīng)抑制[4]等藥理作用；綠原酸在牛蒡子中也有發(fā)現(xiàn)[5],屬于酚酸衍生物類(lèi),廣泛分布于植物界,具有抗氧化[6]、抗炎[7]、抗誘變和抗腫瘤[8]、抗菌、抗病毒[9]、降血糖[10]等藥理作用。

現(xiàn)有文獻(xiàn)缺乏明確的清肺消炎丸中上述3種抗炎成分含量的具體測(cè)定方法。為能更好地控制清肺消炎丸的質(zhì)量,本文采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)這3種抗炎成分含量的定量分析方法進(jìn)行探究。

1　實(shí)驗(yàn)

1.1儀器與材料

儀器：戴安U3000高效液相色譜儀,Chromeleon色譜工作站；離心機(jī)；超聲儀；電子分析天平。

材料：清肺消炎丸(批號(hào):5230077、5230098、7870008),由天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司達(dá)仁堂制藥廠制造；牛蒡子苷、牛蒡子苷元、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品,一方科技有限公司生產(chǎn)；糊精淀粉混合物,Germany公司生產(chǎn)；乙腈、甲醇為色譜純,磷酸為分析純,天津康科德科技有限公司生產(chǎn)；超純水。

1.2色譜條件

色譜柱為Symmetry? C18柱(250×4.6 mm,5 μm),柱溫設(shè)為25℃。牛蒡子苷和牛蒡子苷元的流動(dòng)相為甲醇-水(體積比為50∶50),流速1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；綠原酸的流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸(體積比為13:87),檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm。

1.3溶液的制備

1.3.1對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取牛蒡子苷、牛蒡子苷元、綠原酸對(duì)照品適量,溶于適量甲醇中,配制成每1 mL含牛蒡子苷0.97 mg對(duì)照品溶液、含牛蒡子苷元0.10 mg對(duì)照品溶液、含綠原酸0.025 mg的對(duì)照品溶液。

1.3.2供試品溶液的制備

取1 g清肺消炎丸于研缽中,充分研碎后溶于10 mL甲醇,超聲溶解20 min,過(guò)0.22 μm微孔濾膜,放入-20 ℃的冰箱中冷凍24 h,析出滴丸輔料聚乙二醇(PEG),13 000 r/min條件下離心10 min,取上清液。

1.3.3空白樣品溶液的制備

取1 g糊精淀粉混合物,按照1.3.2節(jié)的操作步驟制備空白樣品.

2　方法考察

2.1專(zhuān)屬性考察

為考察方法的專(zhuān)屬性,按照上述色譜條件,取供試品與對(duì)照品溶液,進(jìn)樣量為10 μL,注入HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分析。樣品及3種對(duì)照品的色譜圖見(jiàn)圖1(圖1中t為保留時(shí)間，I為吸收強(qiáng)度),牛蒡子苷、牛蒡子苷元和綠原酸對(duì)照品的保留時(shí)間分別為6.907、16.007 min和9.300 min,樣品中3種物質(zhì)的保留時(shí)間依次為6.860、16.100 min和9.327 min。從該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)方法專(zhuān)屬性良好。

圖1　樣品(A、C)、綠原酸對(duì)照品(B)、牛蒡苷對(duì)照品(D)、牛蒡苷元對(duì)照品(E)色譜圖

2.2線性關(guān)系考察

分別精密稱(chēng)取3種對(duì)照品溶液(牛蒡子苷0.97g/L、牛蒡子苷元0.10 g/L、綠原酸0.025 g/L)2、4、6、8、10 μL進(jìn)樣,每個(gè)進(jìn)樣量各3針,分別記錄峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),做標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程:牛蒡子苷為y=7.343 6x+2.350 4,r=0.999 4；牛蒡子苷元為y=18.824x+0.081 6,r=0.999 7；綠原酸為y=51.539x+0.504 9,r=0.999 1。結(jié)果表明,牛蒡子苷進(jìn)樣量在1.94～9.70 μg范圍內(nèi)、牛蒡子苷元進(jìn)樣量在0.20～1.00 μg范圍內(nèi)、綠原酸進(jìn)樣量在0.05～0.25 μg范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。

2.3精密度考察

按照上述色譜條件,取10 μL進(jìn)樣,重復(fù)進(jìn)樣5針,測(cè)定各自峰面積值。牛蒡子苷的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.33%(測(cè)量次數(shù)n=5),牛蒡子苷元RSD為0.84%(n=5),綠原酸RSD為1.96%(n=5)。結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)方法及儀器的精密度良好。

2.4穩(wěn)定性考察

取同一批次供試品溶液(批次為5230098),依次于0、2、4、6、8 h后進(jìn)樣10 μL,分別測(cè)定牛蒡子苷、牛蒡子苷元和綠原酸的峰面積。得到牛蒡子苷的RSD為1.44%、牛蒡子苷元RSD為0.91%、綠原酸RSD為2.67%。可見(jiàn)樣品溶液中牛蒡子苷、牛蒡子苷元和綠原酸在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5重復(fù)性考察

取同一批次清肺消炎丸(批次為5230098),按照2.2節(jié)的步驟平行制備5份供試品溶液,分別測(cè)定牛蒡子苷、牛蒡子苷元和綠原酸的峰面積。得到牛蒡子苷RSD為0.24%(n=5),牛蒡子苷元RSD為0.97%(n=5),綠原酸RSD為1.50%(n=5)。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)方法及儀器的重復(fù)性良好。

2.6加樣回收實(shí)驗(yàn)

取空白樣品溶液共15份(樣品中無(wú)牛蒡子苷、牛蒡子苷元和綠原酸),每份500 μL,5份加入0.97 g/L牛蒡子苷對(duì)照品溶液500 μL,另5份加入0.10 g/L牛蒡子苷元對(duì)照品溶液500 μL,另5份加入0.025 g/L綠原酸對(duì)照品溶液500 μL,混合均勻后,各取10 μL進(jìn)樣,測(cè)定峰面積值,計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見(jiàn)表1。牛蒡子苷回收率為98.33%,RSD=1.69%(n=5)；牛蒡子苷元回收率為102.59%,RSD=1.62%(n=5)；綠原酸回收率為98.17%,RSD=0.98%(n=5)。

表1　回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7實(shí)際樣品檢測(cè)

取3批清肺消炎丸,按照1.3.2節(jié)的步驟制備供試品溶液,按照上述色譜條件,牛蒡子苷和牛蒡子苷元的進(jìn)樣量為12 μL,綠原酸的進(jìn)樣量為20 μL,每批重復(fù)進(jìn)樣3次,測(cè)定峰面積值,代入各回歸方程,計(jì)算各批次清肺消炎丸中牛蒡子苷、牛蒡子苷元和綠原酸的含量,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　樣品檢測(cè)結(jié)果

2.8特征圖譜相似度評(píng)價(jià)

將表2中樣品檢測(cè)所得9組數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”進(jìn)行相似度評(píng)價(jià),得特征譜圖見(jiàn)圖2,相似度評(píng)價(jià)結(jié)果分別見(jiàn)表3和表4。三批樣品共9組,相似度均大于0.88,可見(jiàn)這三批清肺消炎丸的質(zhì)量比較穩(wěn)定。

圖2　三批清肺消炎丸特征圖譜

批號(hào)523007752300775230077523009852300985230098787000978700097870009R52300770．9110．8860．8970．8900．8970．8850．8840．8830．90852300770．9110．9930．9940．9900．9940．9920．9900．9890．99652300770．8860．9930．9920．9980．9930．9990．9990．9990．99852300980．8970．9940．9920．9950．9990．9930．9900．9890．99652300980．8900．9900．9980．9950．9960．9980．9970．9970．99852300980．8970．9940．9930．9990．9960．9950．9900．9910．99778700090．8850．9920．9990．9930．9980．9950．9980．9980．99878700090．8840．9900．9990．9900．9970．9900．9981．0000．99778700090．8830．9890．9990．9890．9970．9910．9981．0000．997R0．9080．9960．9980．9960．9980．9970．9980．9970．997

表4牛蒡苷和牛蒡苷元測(cè)定特征圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

批號(hào)523007752300775230077523009852300985230098787000978700097870009R52300770．9120．9160．9120．9120．9070．9150．9130．9130．9352300770．9120．9840．9820．9980．9960．9850．9850．9860．99352300770．9160．9840．9920．980．9790．9940．9940．9940．99452300980．9120．9820．9920．9820．9810．9970．9970．9980．99552300980．9120．9980．980．9820．9960．9850．9850．9850．99252300980．9070．9960．9790．9810．9960．9840．9840．9850．99278700090．9150．9850．9940．9970．9850．9841．0000．9990．99778700090．9130．9850．9940．9970．9850．9841．0000．9990．99778700090．9130．9860．9940．9980．9850．9850．9990．9990．997R0．930．9930．9940．9950．9920．9920．9970．9970．997

3　結(jié)果與討論

3.1注意事項(xiàng)

由于綠原酸的不穩(wěn)定性,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)盡量避光、避熱,且盡可能用時(shí)現(xiàn)配,并用棕色瓶保存[11]。

3.2波長(zhǎng)的確定

根據(jù)文獻(xiàn)[12]報(bào)道,牛蒡子苷元和牛蒡子苷在280 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)時(shí),所得圖譜清晰、特征性好、吸收峰面積大,預(yù)實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)在該波長(zhǎng)下牛蒡子苷、牛蒡子苷元的出峰情況良好,故采用該波長(zhǎng)。文獻(xiàn)[13—14]中報(bào)道綠原酸在324 nm和327 nm波長(zhǎng)處都有較強(qiáng)的吸收峰,根據(jù)實(shí)驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn),等量綠原酸注入HPLC系統(tǒng)后,采用327 nm為波長(zhǎng)使吸收峰更大一些,故選用327 nm。

3.3流動(dòng)相的選擇

查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),牛蒡子苷及牛蒡子苷元的流動(dòng)相采用一定比例的甲醇-水效果良好,但比例差別比較大。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了不同比例的甲醇-水作為流動(dòng)相的出峰情況,發(fā)現(xiàn)當(dāng)甲醇與水的體積比為1∶1時(shí),牛蒡子苷和牛蒡子苷元分別在6.9 min和16 min左右出峰,且樣品中兩種物質(zhì)分離度良好,故采用甲醇-水(體積比為1∶1)作為檢測(cè)牛蒡子苷和牛蒡子苷元的流動(dòng)相。由于綠原酸在牛蒡子苷及牛蒡子苷元的條件下出峰效果不理想,故根據(jù)文獻(xiàn)采用乙腈-0.4%的磷酸水(體積比為13∶87)作為測(cè)定綠原酸含量的流動(dòng)相,實(shí)驗(yàn)證明效果良好。

4　結(jié)語(yǔ)

牛蒡子是清肺消炎丸的重要組成成分,具有驅(qū)熱、宣肺、利咽、消腫等生理功能[15]。牛蒡子中含有木脂素類(lèi)、萜類(lèi)、揮發(fā)油和脂肪酸、酚酸衍生物等多種化學(xué)成分,其中對(duì)抗炎作用起主要貢獻(xiàn)的包括牛蒡子苷元、牛蒡子苷等木脂素類(lèi)化合物以及綠原酸等酚酸衍生物。程彬峰等[16]對(duì)清肺消炎丸的抗炎機(jī)制進(jìn)行了研究,從中共鑒定了包括牛蒡苷、綠原酸在內(nèi)的55種化合物,并認(rèn)為主要有木脂素類(lèi)、酚酸類(lèi)、類(lèi)固醇和硫炔類(lèi)作用于炎癥反應(yīng)的9條不同通路從而參與清肺消炎丸的抗炎作用。研究表明,牛蒡子苷在人體內(nèi)分解為牛蒡子苷元發(fā)揮抗炎作用,而牛蒡子苷元可能是通過(guò)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答對(duì)活化巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞包括TNF-α、NO產(chǎn)生及淋巴細(xì)胞增殖起到抗炎作用；綠原酸則是通過(guò)抑制COX-2、NF-κBp65發(fā)揮抗炎作用。因此,清肺消炎丸中抗炎成分的抗炎機(jī)制是多重的。

在藥物的生產(chǎn)過(guò)程中需要對(duì)牛蒡子的質(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格的控制,進(jìn)而控制牛蒡子苷、牛蒡子苷元和綠原酸的含量,以在最適合的劑量下發(fā)揮最佳抗炎效果。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知,本文具有專(zhuān)屬性高、精確性好、重復(fù)性好等特點(diǎn),且操作簡(jiǎn)單、便捷,可快速對(duì)清肺消炎丸中這3種物質(zhì)的含量進(jìn)行定量分析,為清肺消炎丸和牛蒡子的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

致謝：在項(xiàng)目完成的過(guò)程中,感謝南開(kāi)大學(xué)設(shè)備處的胡寧老師,徐召老師對(duì)相關(guān)儀器設(shè)備的大力支持和幫助。

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Determination of content of three anti-inflammatory ingredients in Qingfei Xiaoyan Wan by using HPLC method

Cui Qingxin, Liao Chengmei, Chen Zhikai, Ma Fang, Tao Jin

(College of Pharmacy,Nankai University,Tianjin 300071,China)

By using the method of high performance liquid chromatography (HPLC) to quantitatively determine the content of arctii,arctigenin and chlorogenic acid in Qingfei Xiaoyan Wan.The chromatographic column is Symmetry? C18 color table. The mobile phase for arctii and arctigenin is methanol-water (50:50),the detection wavelength is 280 nm; for the chlorogenic acid was acetonitrile-0.4% phosphoric acid (13:87),the detection wavelength is 327 nm. The contents of arctii,arctigenin and chlorogenic acid were 4.07 mg/g(n=3),0.19 mg/g (n=3) and 0.076 mg/g(n=3)respectively in Qingfei Xiaoyan Wan. It shows that there is a good linear relationship between the peak area and sample size of arctii,arctigenin and chlorogenic in the range of 1.94-9.70 μg,0.20-1.00 μg and 0.05-0.25 μg, respectively. The recovery rates were arctii 102.59% (RSD=1.69%,n=5),arctigenin 98.17 %( RSD=1.52%,n=5) and chlorogenic acid 98.33% (RSD=1.46%,n=5). The method used in this study is simple,accurate,sensitive, and has strong specificity and good repeatability. And it can be used to quantitatively determine the content of the material in Qingfei Xiaoyan Wan.

qingfei xiaoyan wan; arctiin; arctigenin; chlorogenic acid；HPLC

10.16791/j.cnki.sjg.2016.10.015

2016-04-22修改日期：2016-05-23

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (81503214, 81173638)

崔慶新(1982—)，男,山東泰安，博士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)樗幬锓治?E-mail：cuiqingxin@nankai.edu.cn

R284.1

A

1002-4956(2016)10-0055-04