環丙沙星和鹽酸林可霉素對豬鏈球菌體外聯合抑菌試驗

吳海港，葉兆偉，張廣強

（信陽農林學院，河南信陽464000）

環丙沙星和鹽酸林可霉素對豬鏈球菌體外聯合抑菌試驗

吳海港，葉兆偉，張廣強

（信陽農林學院，河南信陽464000）

為了觀察環丙沙星和鹽酸林可霉素聯合用藥產生作用，采用環丙沙星和鹽酸林可霉素體外抑菌試驗，試驗菌株為臨床上分離的豬鏈球菌17株，采用微量稀釋法檢測兩種藥物對豬鏈球菌的最小抑菌濃度（MIC），依據最小抑菌濃度再采用棋盤稀釋法及時間-殺菌曲線判斷聯合藥敏效果。結果顯示，在17株豬鏈球菌對兩種藥物聯合藥敏試驗中呈協同作用的占64.71%，相加作用的占23.53%，無關作用的占11.76%，無拮抗作用，聯合藥敏試驗中對豬鏈球菌的平均部分抑菌指數（FIC）為0.54，說明環丙沙星和鹽酸林可霉素聯合用藥具有較好的協同作用。

環丙沙星；林可霉素；聯合用藥；豬鏈球菌

環丙沙星和鹽酸林可霉素是臨床上應用最多的抗菌藥物之一，臨床主要用于治療呼吸道及相關細菌感染性疾病。但是隨著畜牧業規模化、集約化發展，藥物的大量使用，甚至濫用已造成大量的耐藥菌株，環丙沙星和鹽酸林可霉素的臨床抗菌作用已有所下降，為延緩環丙沙星和鹽酸林可霉素耐藥菌株的產生，提高環丙沙星及林可霉素的用藥安全性及抗菌活性等，尋求新的聯合用藥技術，增加療效，抑制耐藥菌株的產生。為此，本試驗選用棋盤稀釋法測定環丙沙星和林可霉素聯合用藥對豬鏈球菌的體外抑菌效果，以期探討環丙沙星和林可霉素是否具有增效作用，為獸醫臨床疾病的控制打開新的途徑。

1材料與方法

1.1藥品環丙沙星原料（含量99.5%，由河南自然康動物藥業有限公司提供，批號：H010105）；鹽酸林可霉素原料（含量99.0%，由河南自然康動物藥業有限公司提供，批號：H0080306）；試驗前精密稱取各藥，無菌操作配制成所需濃度的藥液，分裝后置-20℃冰箱保存備用。

1.2試驗菌株豬鏈球菌17株（由信陽動物疫病監測中心提供，系臨床分離致病菌）。質控標準參考菌為鏈球菌藥敏質控株CVCC3223，購自中國獸醫藥品監察所。

1.3培養基5%犢牛血清的營養肉湯、鮮血營養瓊脂培養基按照常規方法制作，用于豬鏈球菌培養。

1.4試驗方法

1.4.1菌液的制備試驗前將菌種經培養、復壯、重新分離同一平板上性狀相似的2～3個菌落，接種到3～5mL肉湯培養基內，于37℃培養8～10 h。

為確定茵液濃度，對細菌分別作平板活菌計數：將原菌液以10-1倍稀釋，分別如下：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8；將各菌液分別取10-6、10-7、10-8的濃度以微量加樣器取100 μL到預先準備好的鮮血營養瓊脂平板中，將玻璃刮鏟在火焰上灼燒滅菌冷卻后，將菌液均勻推散在平板培養基表面（經無菌檢查合格），每個濃度涂3個平板；培養24 h后觀察，計算菌落數。

1.4.2單藥最小抑菌濃度（MIC）測定方法采用12×8的96孔V型孔底的微孔稀釋板，每排的1～12孔各加入50 μL 5%犢牛血清的營養肉湯，再取50 μL 4倍終濃度的藥液從第1孔做倍比稀釋至11孔，稀釋完第11孔后棄去50 μL，12孔為無藥對照。再加50 μL稀釋好的菌液于每排的1～12孔，使最終每孔菌液濃度為1×105CFU/mL，37℃孵育18～24 h后觀察結果。試驗時每種藥物對每種菌做3排重復，同時以標準菌CVCC3223做質量控制。

1.4.3聯合藥敏試驗采用棋盤微量稀釋法以各藥對應各種菌MIC值確定藥物稀釋度，采用7個稀釋度，藥物最高濃度為其MIC的2倍，依次對倍稀釋為1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32倍濃度，兩種藥物的稀釋分別在96孔板上按橫列和縱列進行聯合，接種菌量為1×105CFU/mL，37℃孵育18～24 h后觀察結果。

1.5結果判定以FIC作為聯合藥敏試驗的判定依據。

FIC指數的計算公式：

（FIC：≤0.5協同作用；0.5～1相加作用；1～2無關作用；＞2拮抗作用）。

1.6體外藥效動力學評價選取17株鏈球菌中的13-5株為試驗菌株，測定環丙沙星和鹽酸林可霉素單用及聯合用藥（1∶1）的時間-殺菌曲線。環丙沙星和鹽酸林可霉素單藥取1MIC濃度，聯合用藥取最佳抑菌點濃度，對照管不含藥物，分別將菌液和藥液混合，使菌液終濃度為1×105CFU/mL，37℃培養，分別于0、1、2、4、.6、8、10、12 h取0.1 mL培養液進行活菌計數，繪制時間-殺菌曲線。

2結果

2.1環丙沙星和鹽酸林可霉素單用體外藥敏試驗結果環丙沙星和鹽酸林可霉素單用及聯合用藥的體外藥敏試驗結果見表1，從表1可以看出，單用環丙沙星對豬鏈球菌的MIC值為8～256 μg/mL，鹽酸林可霉素單用時對豬鏈球菌的MIC值為16～256 μg/mL。

2.2環丙沙星和鹽酸林可霉素聯合藥敏試驗結果環丙沙星與鹽酸林可霉素聯合藥敏試驗結果由表1可以看出，17株菌中有11株呈協同作用，所占比例64.71%；4株為相加作用占23.53%；2株為無關作用占11.76%；無拮抗作用。環丙沙星與鹽酸林可霉素聯用對豬鏈球菌FIC的平均值分別為0.54，具有較好的協同作用。

表1環丙沙星和林可霉素單用及聯合應用藥敏試驗

表2兩藥聯用對豬鏈球菌FIC構成比

2.3時間-殺菌曲線測定結果環丙沙星和鹽酸林可霉素單用及聯合用藥對豬鏈球菌13～5的時間-殺菌曲線見圖1，從圖1可以看出，在1 h時，環丙沙星組、鹽酸林可霉素組及聯合用藥組都出現菌數下降趨勢，但差異不大。從4 h開始，鹽酸林可霉素組菌數開始出現上升趨勢。在10 h時環丙沙星和鹽酸林可霉素的菌數差異不顯著，但低于對照組，減少約103倍，而聯合用藥組和對照組相比減少約105倍。在12 h時，和對照組相比，環丙沙星減少約103倍，鹽酸林可霉素減少約102倍，而聯合用藥組減少約106倍，可見兩藥合用有較好的協同作用。

圖1環丙沙星和鹽酸林可霉素單用及聯合對豬鏈球菌的時間-殺菌曲線

3討論

環丙沙星是第3代喹諾酮類抗生素，是一種廣譜的抗生素，其作用機理主要是抑制細菌的DNA回旋酶而發揮快速殺菌作用。鹽酸林可霉素對常見革蘭陽性菌有較強抗菌活性。可作為耐青霉素、紅霉素替代藥物，其作用機制主要是作用于核糖體的50S亞基，阻止肽鏈的延長，從而抑制細菌細胞的蛋白質合成［1］。體外藥敏試驗發現豬鏈球菌對環丙沙星的MIC值為8～256 μg/ mL，對鹽酸林可霉素的MIC值為16～256 μg/mL，與文獻報道MIC值相比［2-4］，豬鏈球菌對環丙沙星和林可霉素表現出一定的耐藥性，往往臨床治療豬鏈球菌病時效果不佳，造成養殖過程中用藥劑量加大，易導致食品動物中的藥物殘留。

環丙沙星和鹽酸林可霉素體外藥敏試驗及時間-殺菌曲線表明，兩者連用對豬鏈球菌具有協同或相加作用，其協同增效機制可能是通過不同途徑阻斷細菌蛋白質的合成，起到抑菌和殺菌的作用，試驗結果表明，兩者合用可提高療效、減少耐藥發生和降低毒副反應，因此臨床中治療由豬鏈球菌引起的感染，可以采用環丙沙星和鹽酸林可霉素聯合用藥，可有效殺滅細菌同時減緩耐藥的發生。但是由于兩種抗生素聯合使用對某些或某一種細菌起到協同或相加作用，并不是對所有的細菌均能起到增效作用［5-6］，因此在臨床使用中不能隨意將兩種抗生素進行聯合用藥，具體應用情況還要以實驗室結果為依據。

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S858.28

B

0529-6005（2016）08-0108-02

2015-03-02

信陽市科學計劃項目（140052）

吳海港（1982-），男，講師，碩士，主要從事獸醫藥理學研究及教學，E-mail：haigang413@126.com