人工合成抗菌肽對口腔細菌抗菌性能的臨床研究

劉曉丹

人工合成抗菌肽對口腔細菌抗菌性能的臨床研究

劉曉丹

目的 探討人工合成抗菌肽對口腔細菌的抗菌性能。方法 選取9種人工合成抗菌肽（Brevinin、chensinin-1、chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa、Temporin-1CEb）和6種口腔細菌（白色念珠菌、具核梭桿菌、嗜酸乳桿菌、變異鏈球菌、唾液鏈球菌、血液鏈球菌）做體外實驗，分析人工合成抗菌肽對口腔細菌的抗菌性能。結果 chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa對白色念珠菌具有高抑菌率；Brevinin、chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa、Temporin-1CEb對具核梭桿菌、變異鏈球菌、唾液鏈球菌、血液鏈球菌具有高抑菌率；Brevinin、chensinin-1、chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa、Temporin-1CEb對嗜酸乳桿菌具有高抑菌率；Brevinin最小抑菌濃度：血液鏈球菌＞具核梭桿菌＞唾液鏈球菌＞變異鏈球菌＞嗜酸乳桿菌；chensinin-1最小抑菌濃度：嗜酸乳桿菌；chensinin-1b最小抑菌濃度：嗜酸乳桿菌＞唾液鏈球菌＞血液鏈球菌＞具核梭桿菌＞白色念珠菌＞變異鏈球菌；L-K5V1最小抑菌濃度：嗜酸乳桿菌＞具核梭桿菌＞變異鏈球菌＞白色念珠菌＞唾液鏈球菌＞血液鏈球菌；L-K6最小抑菌濃度：唾液鏈球菌＞血液鏈球菌＞白色念珠菌＞變異鏈球菌＞具核梭桿菌＞嗜酸乳桿菌；L-K6V1最小抑菌濃度：嗜酸乳桿菌＞血液鏈球菌＞唾液鏈球菌＞白色念珠菌＞具核梭桿菌＞變異鏈球菌；L-K6V2最小抑菌濃度：白色念珠菌＞變異鏈球菌＞唾液鏈球菌＞嗜酸乳桿菌＞具核梭桿菌＞血液鏈球菌；Temporin-1CEa最小抑菌濃度：白色念珠菌＞具核梭桿菌＞唾液鏈球菌＞嗜酸乳桿菌＞變異鏈球菌＞血液鏈球菌；Temporin-1CEb最小抑菌濃度：唾液鏈球菌＞具核梭桿菌＞變異鏈球菌＞血液鏈球菌＞嗜酸乳桿菌。結論 不同人工合成抗菌肽對口腔細菌的抗菌性能不同，Temporin-1CEa的最小抑菌濃度較小，且抑菌效果佳。

人工合成抗菌肽；口腔細菌；抗菌性能

由于抗生素的大量使用，導致很多致病菌和真菌菌株產生了不同程度的耐藥性［1-2］，所以臨床亟待尋求更為有效的抗菌藥物。抗菌肽是生物體內廣泛存在的一種抵抗外來微生物入侵和體內突變細胞而產生的多肽，具有廣譜抗菌活性［3-4］。抗菌肽具有分子小、水溶性好、穩定性高等特點。由于多數抗菌肽帶正電荷，能與帶負電荷的細菌細胞膜通過靜電吸引相結合，可通過特有的兩親性結構插入細菌細胞膜而形成孔洞，使細菌難以對抗抗菌肽而產生抗藥性。抗菌肽不僅對細胞有良好活性，對真菌也有較強的殺傷作用。近年來研究發現，人工合成抗菌肽與天然產生的抗菌肽相比，具有更高抗菌活性，可應用于臨床。但不同的人工合成抗菌肽具有的抗菌性能是不同的。因而我院開展了此研究，選取9種人工合成抗菌肽（Brevinin、chensinin-1、chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa、Temporin-1CEb）和6種口腔細菌（白色念珠菌、具核梭桿菌、嗜酸乳桿菌、變異鏈球菌、唾液鏈球菌、血液鏈球菌）做體外實驗，分析人工合成抗菌肽對口腔細菌的抗菌性能，現報道如下。

1 儀器試劑與方法

1.1藥品與試劑 菌株：白色念珠菌、具核梭桿菌、嗜酸乳桿菌、變異鏈球菌、唾液鏈球菌、血液鏈球菌，人工合成抗菌肽：包括Brevinin、chensinin-1、chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa、Temporin-1CEb，均購自于上海吉爾生化有限公司；牛肉膏蛋白胨液體培養基、水等。1.2 儀器 標準96孔微量板（Sigma公司）；超凈工作臺SW-CJ-2FD（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）；臺式恒溫振蕩器THZ-C（海門市麒麟醫用儀器廠）；分析天平CP224S（Olympus）；顯微鏡CX21FS1（Olympus）；酶標儀（Thermo）；數昱立式壓力蒸氣滅菌鍋YXO-LS-30SⅡ（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；烘箱WK891（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.3方法 人工合成抗菌肽的篩選原則為100 μm人工合成抗菌肽與105 CFU/ml菌液作用，抑菌率達90%以上，行最小抑菌濃度檢測。操作如下：通過接種環，將菌株從斜面培養基上取下，轉入10 mlLB液體培養基中，在恒溫振蕩培養箱中37 ℃過夜，使菌株處于對數生長期。用血球計數板進行計數，用LB液體培養基稀釋至2倍。將人工合成抗菌肽分別用無菌水溶解。實施分組，實驗組為抗菌肽+菌株，對照組為菌株+水、水+LB培養基、LB培養基+抗菌肽。恒溫箱中培養過夜，600 nm下測量吸光值。抑菌率（%）=1-［（抗菌肽+菌株組）吸光值-（LB培養基+抗菌肽組）吸光值］/［（菌株+水組）吸光值-（水+LB培養基組）吸光值］×100%。抑菌率達90%以上時，人工合成抗菌肽的濃度為最小抑菌濃度。

2 結果

2.1人工合成抗菌肽對口腔細菌抑制情況分析 chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa對白色念珠菌具有較高抑菌率；Brevinin、chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa、Temporin-1CEb對具核梭桿菌、變異鏈球菌、唾液鏈球菌、血液鏈球菌具有較高抑菌率；Brevinin、chensinin-1、chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa、 Temporin-1CEb對嗜酸乳桿菌具有高抑菌率。見表1。

表1　人工合成抗菌肽對口腔細菌抑制情況分析（%）

2.2人工合成抗菌肽對口腔細菌的最小抑菌濃度分析 Brevinin最小抑菌濃度：血液鏈球菌＞具核梭桿菌＞唾液鏈球菌＞變異鏈球菌＞嗜酸乳桿菌；chensinin-1最小抑菌濃度：嗜酸乳桿菌；chensinin-1b最小抑菌濃度：嗜酸乳桿菌＞唾液鏈球菌＞血液鏈球菌＞具核梭桿菌＞白色念珠菌＞變異鏈球菌；L-K5V1最小抑菌濃度：嗜酸乳桿菌＞具核梭桿菌＞變異鏈球菌＞白色念珠菌＞唾液鏈球菌＞血液鏈球菌；L-K6最小抑菌濃度：唾液鏈球菌＞血液鏈球菌＞白色念珠菌＞變異鏈球菌＞具核梭桿菌＞嗜酸乳桿菌；L-K6V1最小抑菌濃度：嗜酸乳桿菌＞血液鏈球菌＞唾液鏈球菌＞白色念珠菌＞具核梭桿菌＞變異鏈球菌；L-K6V2最小抑菌濃度：白色念珠菌＞變異鏈球菌＞唾液鏈球菌＞嗜酸乳桿菌＞具核梭桿菌＞血液鏈球菌；Temporin-1CEa最小抑菌濃度：白色念珠菌＞具核梭桿菌＞唾液鏈球菌＞嗜酸乳桿菌＞變異鏈球菌＞血液鏈球菌；Temporin-1CEb最小抑菌濃度：唾液鏈球菌＞具核梭桿菌＞變異鏈球菌＞血液鏈球菌＞嗜酸乳桿菌。見表2。

表2　人工合成抗菌肽對口腔細菌的最小抑菌濃度分析（μ mol/L）

3 討論

目前，較為常見的口腔細菌有白色念珠菌、具核梭桿菌、嗜酸乳桿菌、變異鏈球菌、唾液鏈球菌、血液鏈球菌。白色念珠菌是一種真菌，通常存在于正常人口腔、上呼吸道、腸道及陰道，一般在正常機體中數量少，不會引起疾病，當機體免疫功能或一般防御能力下降時，或正常菌群相互制約作用失調時，白色念珠菌大量繁殖并改變生長形式（芽生菌絲相）侵入細胞引起疾病。具核梭桿菌是一種革蘭陰性口腔共生菌，但它有潛力致病，有時會引起牙周病，在口腔乃至全身感染性疾病中檢出率極高，有研究顯示［5-6］，大腸癌患者相關組織中存在大量具核梭桿菌，顯示兩者之間可能存在某種關聯。嗜酸乳桿菌屬于乳桿菌屬，不僅存在于口腔中，還存在于胃及小腸中，是人體的主要益生菌之一。有研究顯示，嗜酸乳桿菌對口腔白色念珠菌有明顯的抑制作用［7］。變異鏈球菌是主要導致口腔齲齒的細菌之一，常見于牙菌斑中，可通過代謝產生的酸性物質導致齲齒的發生。唾液鏈球菌屬于口腔正常菌群，與健康者相比，口臭者口腔中唾液鏈球菌數量較少。有研究表明［8-9］，唾液鏈球菌可以產生某種細菌素，對口臭相關細菌有抑制作用。血液鏈球菌是口腔正常菌群之一，隨著牙齒的萌生早期定植牙面，通過植物血凝素樣附著素，非植物血凝素樣附著素與唾液中受體特異結合，粘附于獲得性膜上，以疏水作用維持其穩定，可與多種細菌發生聚集反應，在齦上，齦下菌斑形成中起重要作用，血液鏈球菌通過產生過氧化氫和血鏈素拮抗牙周病的可疑致病菌，是牙周主要有益菌。

諸多研究顯示［10-11］，抗菌肽在口腔科中的應用較常見，在抑制和殺死微生物抗菌活性的同時，還可以對細菌生物被膜的形成過程有一定作用，對機體免疫系統有一定調節作用。尤其是炎性反應，抗菌肽可以對炎性因子的釋放實施調控，進而控制炎性反應。目前，抗菌肽已成為生物保健、醫藥衛生、食品化工等多個領域的研究熱點。人工合成抗菌肽在臨床中的應用具有諸多優勢［12-13］。

此次研究選用了Brevinin、chensinin-1、chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa、Temporin-1CEb，對口腔細菌抗菌性能進行了分析。本研究結果顯示，9種人工合成抗菌肽對6種口腔細菌的抗菌性能是不同的。由人工合成抗菌肽對口腔細菌的最小抑菌濃度分析，Temporin-1CEa的最小抑菌濃度較小，且抑菌效果佳，具有較高臨床應用價值。以Temporin-1CEa為例進行分析，抗菌肽對炎性反應具有明顯的抑制作用。炎癥是機體對抗外界造成的傷害和感染的第一個步驟，是一個復雜程序，生物機體會釋放炎性因子和介質，將其運輸到感染部位，用于消除感染因子，而過度炎癥是有害的。抗菌肽發揮著免疫調節的功能，免疫在針對感染和炎癥的威脅時發揮著重要作用，而抗菌肽是宿主免疫系統的重要組成部分。抗菌肽還具有趨化活性，能夠充當吞噬細胞及單核細胞的趨化因子，有效刺激單核細胞與中性粒細胞趨化因子的生成，在炎性反應的發生部位聚集，幫助解除炎癥威脅。

綜上所述，不同人工合成抗菌肽對口腔細菌的抗菌性能不同，Temporin-1CEa的最小抑菌濃度較小，且抑菌效果佳。

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Clinical Research of Synthetic Antibacterial Peptide in Antibacterial Properties of Oral Bacteria

Liu Xiaodan

Objective To investigate synthetic antibacterial peptide in antibacterial properties of oral bacteria.Methods 9 kinds of synthetic antibacterial peptide（Brevinin，chensinin-1，chensinin-1b，L-K5V1，L-K6，L-K6V1，L-K6V2 and temporin lcea，Temporin-1CEb）and 6 kinds of oral bacteria（Candida albicans，Fusobacterium nucleatum，Lactobacillus acidophilus，Streptococcus mutans，Streptococcus salivarius，Streptococcus sanguinis）were used to vitro experiment.Synthetic antibacterial peptide in antibacterial properties of oral bacteria was analyzed.Results Chensinin-1b，L-K5V1，L-K6，L-K6V1，L-K6V2，Temporin-1CEa had high inhibitory rate with Candida albicans.Brevinin，chensinin-1b，L-K5V1，L-K6，L-K6V1，L-K6V2，Temporin-1CEa，Temporin-1CEb had high inhibitory rate with Fusobacterium nucleatum，Streptococcus mutans，Streptococcus salivarius，Streptococcus sanguinis.Brevinin，chensinin-1，chensinin-1b，L-K5V1，L-K6，L-K6V1，L-K6V2，Temporin-1CEa，Temporin-1CEb had high inhibitory rate with Lactobacillus acidophilus. Minimum inhibitory concentrations of Brevinin:Streptococcus sanguinis＞Fusobacterium nucleatum＞Streptococcus salivarius＞Streptococcus mutans＞Lactobacillus acidophilus.Minimum inhibitory concentrations of chensinin-1: Lactobacillus acidophilus.Minimum inhibitory concentrations of chensinin-1b:Lactobacillus acidophilus＞Streptococcus salivarius＞Streptococcus sanguinis＞Fusobacterium nucleatum＞Candida albicans＞Streptococcus mutans. Minimum inhibitory concentrations of L-K5V1:Lactobacillus acidophilus＞Fusobacterium nucleatum＞Streptococcus mutans＞Candida albicans＞Streptococcus salivarius＞Streptococcus sanguinis.Minimum inhibitory concentrations of L-K6:Streptococcus salivarius＞Streptococcus sanguinis＞Candida albicans＞Streptococcus mutans＞Fusobacterium nucleatum>Lactobacillus acidophilus.Minimum inhibitory concentrations of L-K6V1:Lactobacillus acidophilus＞Streptococcus sanguinis＞Streptococcus salivarius＞Candida albicans＞Fusobacterium nucleatum＞Streptococcus mutans.Minimum inhibitory concentrations of L-K6V2:Candida albicans＞Streptococcus mutans＞Streptococcus salivarius＞Lactobacillus acidophilus＞Fusobacterium nucleatum＞Streptococcus sanguinis.Minimum inhibitory concentrations of Temporin-1CEa:Candida albicans＞Fusobacterium nucleatum＞Streptococcus salivarius＞Lactobacillus acidophilus＞Streptococcus mutans＞Streptococcus sanguinis.Minimum inhibitory concentrations of Temporin-1CEb:Streptococcus salivarius＞Fusobacterium nucleatum＞Streptococcus mutans＞Streptococcus sanguinis＞Lactobacillus acidophilus.Conclusion Different synthetic antimicrobial peptides on the antibacterial performance of oral bacteria is different，the minimum inhibitory concentration of Temporin-1CEa is small，and the inhibitory effect is good.

Synthetic antibacterial peptide；Oral bacteria；Antibacterial property

R781.5

A 【DOI】10.12010/j.issn.1673-5846.2016.10.037

遼寧省本溪市中心醫院，遼寧本溪 117000