醬鹵肉中沙門氏菌和單核細胞增生李斯特菌生長特性及預測模型建立

趙 楠，許曉曦,*，劉 洋，高繼銘，張書義，那紅萍，金 鳳

醬鹵肉中沙門氏菌和單核細胞增生李斯特菌生長特性及預測模型建立

趙 楠1，許曉曦1,*，劉 洋1，高繼銘1，張書義2，那紅萍1，金 鳳1

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.全國畜牧總站，北京 100125）

依據流行病學的調查結果，醬鹵肉中檢出率較高的致病菌為沙門氏菌和單核細胞增生李斯特菌。本實驗對該兩種代表性致病菌以醬鹵肉作為培養基成分在不同溫度下的生長特性進行研究，建立了不同溫度下沙門氏菌和單核細胞增生李斯特菌的生長一級模型和二級模型。在沙門氏菌和單核細胞增生李斯特菌培養溫度范圍內得出醬鹵肉制品中沙門氏菌的動力學模型為：lgN＝A+（10.2－A）×exp{－exp[e×（－3.173 1T2+2.02T+1.812）×（1.252T2－7.746T+1.22－t）/（10.2－A）+1]}；醬鹵肉中單核細胞增生李斯特菌的動力學模型為：lgN＝A+（17.9－A）×exp{－exp[e×（－9.024T2+5.774T－4.402）×（1.378T2－7.995T+1.172－t）/（17.9－A）+1]}。運用該預測模型可描述自然狀態下醬鹵肉制品中的兩種代表性致病菌數量的動態變化，為該類產品的生產、運輸、貯藏及銷售過程中的食品安全保證提供良好的理論依據，用以減少由致病菌引發的食品安全風險，并為建立醬鹵肉企業的食品安全管理體系提供科學基礎。

醬鹵肉制品；沙門氏菌；單核細胞增生李斯特菌；生長模型

醬鹵肉制品是我國具有悠久歷史的傳統肉制品，由于該類產品地方風味濃郁，而廣受消費者歡迎。但因該類產品營養豐富且大多仍采用傳統的手工或者半手工的生產方式，較適宜微生物生長繁殖，存在諸多衛生安全隱患，且導致食品安全事件的發生，對我國消費者的人身健康存在重大威脅[1-2]。由微生物引發的食品安全問題是醬鹵肉制品安全的主要原因，微生物食品安全根本上不同于化學食品安全，它可以在任何步驟中出現，因此需要預測微生物學對其進行預測[3]。預測微生物學是微生物學、統計學、工程數學和計算機技術相結合的學科，在不進行產品微生物檢測分析的情況下，描述和預測微生物在一定條件下的生長或衰亡，實現預報其貨架期等目的，從而對食品安全做出快速評估的預測方法[4]。食品中影響微生物生長及產生毒素的條件有溫度、水分活度、pH值等，食品預測微生物學就是把這些決定性因素與病原菌的生長狀況以及死亡動態結合在一起，建立數學模型[5]。

目前國外在研究預測微生物學領域取得了很大的成就，包括開發出多達十幾種的預測軟件，建立了許多微生物學方面權威的數據庫[6-13]。現階段我國學者在預測微生物學一級模型與二級模型的研究中也取得了一些成果[14-16]，但對三級模型的研究和應用較少。我國在肉制品安全方面的研究有柵欄技術等，一些學者對肉制品貯藏過程微生物規律進行研究[17-20]，也對冷鮮肉品建立了可靠的數學模型[21-23]，但在熟肉制品尤其是醬鹵肉制品模擬自然生長條件下的預測微生物學研究尚屬空白。

本實驗選取兩種肉制品中檢出率極高的沙門氏菌和單核細胞增生李斯特菌作為代表性的致病菌進行預測微生物學的研究，根據模擬自然生長條件下兩種典型致病菌生長情況，分別建立一級和二級生長動力學模型，以此動態模型可表示不同溫度下兩種典型致病菌隨時間變化的規律，為醬鹵肉制品中代表性致病菌的風險評估奠定科學理論基礎，從而預測醬鹵肉制品生產、貯運、消費過程的安全性。

1 材料與方法

1.1 材料、菌種與培養基

醬鹵肉購于哈爾濱市區內熟食店。

單核細胞增生李斯特菌、沙門氏菌均購于黑龍江省疾病預防控制中心。

沙門氏菌科瑪嘉顯色培養基、單核細胞增生李斯特菌科瑪嘉顯色培養基購于鄭州博賽生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-IFD潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；DHP-9162電熱恒溫培養箱 上海齊欣科學儀器有限公司；ALC-1100.2、ALC-310.3電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；JJ-1精密増力電動攪拌器上海浦東物理光學儀器廠；電熱手提式壓力蒸汽滅菌鍋寧波市鎮海金鑫醫療器械有限公司；YXQ-LS-18SI不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 醬鹵肉中沙門氏菌的培養及計數

無菌條件下，用接種環挑取沙門氏菌，對其斜面劃線接種到對應顯色培養基中，在30 ℃和37 ℃分別培養24 h，挑取培養基上面的顯色菌苔在無菌生理鹽水中制成菌懸液，用無菌鹽水進行適當稀釋，用涂布法涂在顯色培養基上，分別將各自放在最適溫度培養箱中培養24 h。記錄該菌懸液的菌數，冷凍后備用。對熟食店柜臺內存放超過12 h的醬鹵樣品進行切割、粉碎、打漿。將菌懸液選取適當的稀釋度適量加入處理好的醬鹵肉樣中，混勻，控制初始菌數在103～104CFU/mL，用紗布過濾掉鹽水。將裝有500 g接種好沙門氏菌的醬鹵肉樣的燒杯分別放入40、37、30、25、20、15、12、10 ℃培養箱中進行培養，根據微生物種類在不同溫度下生長速率設定不同的取樣時間，按照取樣間隔進行取樣測定菌數（40、37、30、20 ℃樣品每4 h進行一次取樣計數。25 ℃每8 h進行一次取樣計數。15、12、10 ℃每1 d進行取樣計數）。每次計數用生理鹽水進行適當稀釋，取兩種適當稀釋度，將稀釋液涂布到沙門氏菌專門顯色平板，30 ℃培養箱培養48 h進行計數[8]，并記錄。

1.3.2 醬鹵肉中單核細胞增生李斯特菌的培養及計數

無菌條件下，用接種環挑取單核細胞增生李斯特菌，對其斜面劃線接種到對應顯色培養基中，在30 ℃和37 ℃分別培養24 h，挑取培養基上面的顯色菌苔在無菌生理鹽水中制成菌懸液，用無菌鹽水進行適當稀釋，用涂布法涂在各自的顯色培養基上，分別將各自放在最適溫度培養箱中培養24 h。進行計數，記錄該菌懸液的菌數，冷凍后備用。對熟食店柜臺內存放超過12 h的醬鹵肉樣品進行切割、粉碎、打漿。將單核細胞增生李斯特菌懸液選取適當的稀釋度加入處理好的醬鹵肉樣中，混勻，控制初始菌數103～104CFU/mL，用紗布過濾掉鹽水。將稱放500 g接種好醬鹵肉樣的燒杯分別放入37、30、25、20、18、15、12、10、5 ℃培養箱中進行培養，根據微生物種類在不同溫度下生長速率設定不同的取樣時間，按照取樣間隔進行取樣測定菌數（37、30 ℃，樣品每3 h進行一次取樣計數。25、20、18 ℃每6 h進行一次取樣計數。15、10 ℃每隔1 d進行一次取樣計數，5 ℃每隔2 d進行一次取樣計數）。每次計數用生理鹽水進行適當稀釋，取兩種適當稀釋度，將稀釋液涂布到單核細胞增生李斯特菌專門顯色平板，30 ℃培養箱培養48 h進行計數[24]，并記錄。

1.3.3 醬鹵肉中兩種代表性致病菌生長模型的建立

一級模型主要表達微生物量與時間的函數關系，由于單細胞微生物呈指數生長的特性，一般用相對細胞數的對數對培養時間作圖，得到生長曲線，因S型生長曲線有4 個階段的曲線與微生物生長極為相似，所以S形函數是最常用于擬合微生物生長曲線的函數。常用來描述微生物動力學生長的S型生長曲線的模型包括Gompertz、Richards、Stannard、Schnute、Logistic、Baranyi和其他模型[6,25]。

為分析不同溫度下沙門氏菌（單核細胞增生李斯特菌）的生長數據，選取Gompertz（公式（1））、Logistic（公式（2））、Richards（公式（3））、MMF（公式（4））4 種模型進行S型曲線擬合。通過對4 種模型r值、標準差（s）和相關生物生長規律進行比較，找出最適的生長模型[4,7,26-27]。

式中：N為環境能容納的最大生物量/（CFU/mL）；N0為初始時刻生物量/（CFU/mL）；t為培養時間/h；a、b、c、d為速率參數。

對最佳一級模型進行修改，使得模型擬合度更高。二級模型表達在一級模型中的相應結果隨不同環境參數值（如溫度、水分活度、pH值等）的變化規律[28-29]。在CurveExpert軟件中擬合二次方程。通過一級模型方程式求得生長速率（v）和延滯期（λ），將v、λ值分別和相應的溫度變量值代入方式，得出m、n、p 3 個參數值。所得參數值代回原方程，完成二級模型的建立。

2 結果與分析

2.1 沙門氏菌生長模型建立

2.1.1 一級模型的建立

采用CurveExpert軟件，將實驗數據分別與4 個公式進行擬合，得出不同溫度下的擬合曲線，通過比較標準差（s）、相關系數（r）的微生物生長規律，選擇最適合的微生物預測模型，建立一級模型。實驗所得s和r如表1所示。

比較用4 個方程擬合的各個溫度下的標準差和相關系數，確定在不同溫度條件下沙門氏菌在醬鹵肉中生長的最佳擬合模型為MMF方程。但是由于Gompertz模型相對簡單，對其研究比較深入，有一系列的修正模型，修正后的Gompertz模型能夠準確地預測病原菌的生長動態，對微生物生長的生物學意義表述更為清楚。因此，選用修正后的Gompertz模型作為一級模型，進而完成二級模型。

表1 沙門氏菌在不同溫度下4 種模型進行擬合的標準差和相關系數Table 1 Standard deviation and correlation coefficients of 4 fitting models for Salmonella at different temperatures

所選用的Gompertz模型表達式為：

式中：N為t時刻的生物量/（CFU/mL）；A為t→－∞時的生物量（近似相當于t=0 時代初始菌數）/（CFU/mL）；C為從接種到穩定期增加的細菌濃度/（CFU/mL）；v為最大生長速率/（CFU/（mL·h））；λ為延滯期/h。

2.1.2 二級模型的建立

二級模型建立時，不能忽略環境因子對一級模型的影響，例如溫度、pH值等。考慮的影響因子越全面，所擬合的一級模型就越準確，與沙門氏菌實際生長情況就更接近，但是多一個影響因素，建模的難度就會增大。所以可以適當的忽略影響較小的影響因子。對于病原菌生長最大的影響因子是溫度，因此在二級模型中考察生長速率與溫度、延滯期與溫度的關系。

本實驗中，生長速率隨溫度升高表現出先增大后減小的趨勢，延滯期隨溫度變化情況與之相反。因此考慮用二次函數進行擬合，應用二次函數方程，對一級模型中參數v和λ建立關于溫度的二級模型。根據溫度對微生物生長的模型理論，二次函數模型為：

首先必須求出參數m1、n1、p1和參數m2、n2、p2，在建立一級模型時，10、12、15 ℃的實驗數據培養時間以d為單位，需要將該溫度模型的v除以24、λ乘以24，轉化成以h為單位的數值，才可用于二級模型的建立。

采用CurveExpert軟件，應用二次函數方程，對一級模型中參數v和λ建立關于溫度的二級模型。各參數擬合曲線如圖1、2所示。

圖1 沙門氏菌在不同溫度下參數v二級模型擬合曲線Fig.1 Parameter v of the second-order model for Salmonella at different temperatures

相關系數r＝0.944 3，二級模型為：

圖2 沙門氏菌在不同溫度下參數λ二級模型擬合曲線Fig.2 Parameter λ of the second-order model for Salmonella at different temperatures

相關系數r＝0.982 5，二級模型為：

2.1.3 生長動力學模型的建立

Gompertz一級模型可變形為：

式中：Nmax為最大菌數生成量，lgNmax－A=C，lgNmax值為10.2。

將式（8）、（9）及lgNmax值分別代入式（10）中，得到10～40 ℃條件下沙門氏菌的生長動力學模型為：

只需測定初始沙門氏菌數，就可以根據上式計算10～40 ℃范圍內任何培養溫度（T）、任何培養時間（t）的沙門氏菌數。

2.1.4 沙門氏菌在醬鹵肉中生長特性研究

溫度是對沙門氏菌生長重要的影響因子，溫度越高，沙門氏菌到達指數期就越快。30 ℃是沙門氏菌最適生長溫度，在最適溫度條件下沙門氏菌能較快到達指數生長期，也就是說大大縮短了延滯期。而實際情況下，微生物生長曲線的延滯期和指數期分的不是十分明顯。明顯看出溫度很低時，延滯期就很長。當溫度在10 ℃以下，沙門氏菌的生長較緩慢。通過4 種模型進行擬合生長曲線，雖然Gompertz模型不是最適模型，但是Gompertz模型是進行繼續完成二級模型的最佳模型，能夠進行深入研究，并且具有一定的生物學意義。本實驗只需能夠建立沙門氏菌二級模型，并擬合出動態模型，這樣只要測定醬鹵肉中初始沙門氏菌數，就可以根據上式計算10～40 ℃范圍內任何培養溫度（T）、任何培養時間（t）的沙門氏菌數。

2.2 單核細胞增生李斯特菌模型建立

2.2.1 單核細胞增生李斯特菌一級模型的建立

采用CurveExpert軟件，將實驗數據分別與4 個模型公式進行擬合，得出不同溫度下的擬合曲線，通過比較s、r的生物生長規律，選擇最適合的微生物預測模型，建立一級模型。實驗所得s和r見表2。

表2 單核細胞增生李斯特菌在不同溫度下進行4 種模型擬合的標準差和相關系數Table 2 Standard deviations and correlation coefficients of four fitting models for Listeria monocytogenes at different temperatures

比較用4 個方程擬合的各個溫度下的生長曲線，確定在不同溫度條件下單核細胞增生李斯特菌在鹵肉中生長的最佳擬合模型為MMF方程。但是由于Gompertz模型相對簡單，對其研究比較深入，有一系列的修正模型，修正后的Gompertz模型能夠準確地預測病原菌的生長動態，對微生物生長的生物學意義表述更為清楚。因此，本實驗選用修正后的Gompertz模型作為一級模型。進而完成二級模型。這里所選用的Gompertz模型表達式見公式（5）。

2.2.2 二級模型的建立

同沙門氏菌二級模型建立，在單核細胞增生李斯特菌二級模型中考慮生長速率與溫度、延滯期與溫度的關系。根據溫度對微生物生長的模型理論，二次函數模型為公式（6）、（7）。

在建立一級模型時5、10、15 ℃的實驗數據培養時間以d為單位，需要將該溫度的v除以24和λ乘以24，轉化成以h為單位的數值，才可用于二級模型的建立。

采用CurveExpert軟件，應用二次函數方程，對一級模型中參數v和λ建立關于溫度的二級模型。各參數擬合曲線如圖3、4所示。

圖3 單核細胞增生李斯特菌在不同溫度下參數v二級模型擬合曲線Fig.3 Parameter v of the second-order fitting model for Listeriamonocytogenes at different temperatures

相關系數r=0.922 1，二級模型為：

圖4 單核細胞增生李斯特菌在不同溫度下參數λ二級模型擬合曲線Fig.4 Parameter λ of the second-order fitting model for Listeria monocytogenes at different temperatures

相關系數r=0.969 0，二級模型為：

2.2.3 生長動力學模型的建立

單核細胞增生李斯特菌的lgNmax值為17.9，將式（12）、（13）及lgNmax值分別代入式（10）中，得到10～40 ℃條件下單核細胞增生李斯特菌的生長動力學模型為：

只要測定初始單核細胞增生李斯特菌菌數，就可以根據上式計算10～37 ℃范圍內任何培養溫度（T）、任何培養時間（t）的單核細胞增生李斯特菌數。

2.2.4 單核細胞增生李斯特菌在醬鹵肉培養基中的生長特性研究

溫度是對單核細胞增生李斯特菌生長重要的影響因子，單核細胞增生李斯特菌進入指數期時間與溫度成正相關的關系。37 ℃是單核細胞增生李斯特菌的最適生長溫度，在最適溫度條件下單核細胞增生李斯特菌能較快達到指數生長期，也就是說大大縮短了延滯期。而實際情況下，微生物生長曲線的延滯期和指數期分的不是十分明顯。溫度較低時，延滯期較長。溫度在4 ℃，單核細胞增生李斯特菌仍然可以存活，生長緩慢。所以單核細胞增生李斯特菌在低溫情況下也很難控制。雖然Gompertz模型不是最適模型，但是Gompertz模型是進行繼續完成二級模型的最佳模型，能夠進行深入研究，并且具有一定的生物意義。本實驗只要能夠建立的單核細胞增生李斯特菌的二級模型，并且擬合出動態模型，這樣只要測定醬鹵肉中初始單核細胞增生李斯特菌數，就可以根據式（14）計算5～37 ℃范圍內任何培養溫度（T）、任何培養時間（t）的單核細胞增生李斯特菌數。

3 結 論

通過Gompertz模型、Richards模型、Logistic模型和MMF模型對沙門氏菌和單核細胞增生李斯特菌生長進行擬合得出：Gompertz模型相對簡單，對其修正后又有明確的生物學意義，所以選擇Gompertz模型作為一級模型，用其修正后的模型再次對沙門氏菌和單核細胞增生李斯特菌在不同溫度下進行擬合。

根據已建立的一級模型在沙門氏菌和單核細胞增生李斯特菌培養溫度范圍內得出，醬鹵肉制品中沙門氏菌的生長動力模型為：lgN＝A+（10.2－A）×exp{－exp[e×（－3.173 1T2+2.02T+1.812）×（1.252T2－7.746T+1.22－t）/（10.2－A）+1]}；醬鹵肉中單核細胞增生李斯特菌的生長動力模型為：lgN＝A+（17.9－A）×exp{－exp[e×（－9.024T2+5.774T－4.402）×（1.378T2－7.995T+1.172－t）/（17.9－A）+1]}。

運用此動力模型只需測定初始致病菌菌數，就可以根據相應的動力模型計算適用范圍內任何培養溫度（T）、任何培養時間時間（t）的致病菌菌數。此模型應用于自然狀態下醬鹵肉制品中微生物數量描述，可對該類產品進行監控和風險評估，保障其生產、運輸、貯存及銷售過程中的食品安全。

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Typical Growth Characteristics of Salmonella and Listeria monocytogenes in Braised Pork with Soy Sauce and Establishment of Prediction Models

ZHAO Nan1, XU Xiaoxi1,*, LIU Yang1, GAO Jiming1, ZHANG Shuyi2, NA Hongping1, JIN Feng1
(1. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2. The National Animal Husbandry Station, Beijing 100125, China)

In this study, the epidemiological results showed that pathogens were detected in pot-stewed meat, and most of them were Salmonella and Listeria monocytogenes. Using pot-stewed meat as the medium for the two representative pathogens, their growth characteristics were studied at different temperatures. In addition, first-order and second-order models describing the growth of Salmonella and Listeria monocytogenes were established at different temperatures. According to the developed models, the dynamic models for predicting the growth of Salmonella and Listeria monocytogenes in pot-stewed meat in the investigated temperature range were established as lgN = A + (10.2 ? A) × exp{ ? exp[e × (? 3.173 1T2+ 2.02T + 1.812) × (1.252T2? 7.746T + 1.22 ? t)/(10.2 ? A) + 1]} and lgN =A + (17.9 ? A) × exp{ ? exp[e × (? 9.024T2+ 5.774T ? 4.402) × (1.378T2? 7.995T + 1.172 ? t)/(17.9 ? A) + 1]}, respectively. Changes in the microbial quantity of sauced meat products under natural conditions can be described with the dynamic models, which can provide a good theoretical basis for the manufaturers to reduce food safety risks caused by bacteria and establish a food safety management system for ensuring the food safety of sauced meat products during production, transportation, storage and distribution.

sauced meat products; Salmonella; Listeria monocytogenes; growth model

10.7506/spkx1002-6630-201601022

S872

A

1002-6630（2016）01-0120-06

趙楠, 許曉曦, 劉洋, 等. 醬鹵肉中沙門氏菌和單核細胞增生李斯特菌生長特性及預測模型建立[J]. 食品科學, 2016, 37(1): 120-125.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601022. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Nan, XU Xiaoxi, LIU Yang, et al. Typical growth characteristics of Salmonella and Listeria monocytogenes in braised pork with soy sauce and establishment of prediction models[J]. Food Science, 2016, 37(1): 120-125. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601022. http://www.spkx.net.cn

2015-01-28

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD28B02）

趙楠（1992—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：zhaonan0224@163.com

*通信作者：許曉曦（1968—），女，教授，博士，研究方向為乳品科學與技術。E-mail：xiaoxi_xu01@163.com