響應面試驗優化復合酶法提取青蛇果多酚工藝及其抗氧化活性

張 迪，劉 洋，李書藝,2,（.武漢輕工大學食品科學 與工程學院，湖北 武漢 430023；2.武漢輕工大學 湖北省農產品加工與轉化重點實驗室，湖北 武漢 430023）

響應面試驗優化復合酶法提取青蛇果多酚工藝及其抗氧化活性

張 迪1，劉 洋1，李書藝1,2,*
（1.武漢輕工大學食品科學 與工程學院，湖北 武漢 430023；2.武漢輕工大學 湖北省農產品加工與轉化重點實驗室，湖北 武漢 430023）

以高酸度蘋果、富含原花青素的青蛇果為原料，采用單因素試驗和Box-Behnken試驗設計優化了復合酶輔助提取青蛇果多酚的工藝參數。結果表明：最適多酚提取的復合酶為纖維素酶和果膠酶（質量比2∶1）、酶解溫度62 .5 ℃、提取時間82.9 min、pH 3.7，多酚得率最高可達5.07%。統計學分析顯示，所選響應面模型合適，并能廣泛用于青蛇果多酚的分析和預測。同時，酶法輔助提取青蛇果多酚的粗提物還具有較好的Fe3＋還原能力和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力，其對DPPH自由基的半數抑制濃度（IC50值）為22.72 ?g/mL，可以作為一種良好的食品添加劑和抗氧化劑深度開發利用。

青蛇果；多酚；復合酶法；響應面設計；抗氧化性

我國是世界上蘋果產業規模最大的國家，2012年我國蘋果栽培面積和總產量分別達到2.3×104km2和3.8×107t[1]。蘋果中含有豐富的植物纖維、可溶性糖、礦物質、蘋果酸、維生素、蛋白質和多酚類物質。其中多酚類物質主要為酚酸（如綠原酸）、原花青素（兒茶素、表兒茶素及其聚合物）和黃酮（以槲皮素為主），因其對蘋果汁顏色、風味，如苦澀味、收斂性等的影響，越來越受到人們的關注[2-4]。研究表明，蘋果多酚不僅具有抗衰老、抗腫瘤、抑菌等的生物活性，還可作為食品添加劑和抗氧化劑用于肉制品，特別是腌制品中[5-6]。近年來，為了提高蘋果及其加工副產物中多酚的有效利用，研究者們已通過多種途徑，如有機溶劑提取、超聲波、微波輔助提取等試圖提高蘋果多酚的得率和活性[7-8]，但始終無法避免大量有機試劑如甲醇和乙醇的使用，造成了不可避免的環境污染和能源浪費。基于蘋果產業的發展現狀和蘋果多酚的多重功效，研究開發蘋果酚類物質對改善我國蘋果加工企業的產品結構，增加企業、果農經濟效益固然意義深遠，但尋找更加綠色、低碳、環保的生產工藝，才真正符合現代農業高效安全制造和可持續發展的原則。

生物酶法（主要是纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等及其復合酶類）作為提取生物活性成分的新技術已十分成熟，并得到廣泛的應用[9-10]。相對于超聲、微波法在大規模生產時的局限性，酶處理方法在成本和使用上更加簡便，對設備和工藝的要求也較少[11]。酶反應條件溫和，選擇性強，但目前為止仍未見用于蘋果多酚的提取和制備中。青蛇果（Malus domestica Borkh.）是一種高酸度的蘋果，源自美國，且富含原花青素[12-13]；肖俊松等[4]研究表明，青蛇果原花青素以低聚體為主，可通過TSK HW-40 s樹脂對原花青素B2和C1的純品進行制備。因此，本課題采用生物酶法定向可控地制備了青蛇果多酚，通過響應面試驗設計優化了復合酶低能耗分離提取多酚的條件工藝，并對粗提物的抗氧化活性進行研究。以期為進一步開發和利用蘋果資源、提高蘋果產業附加值提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青蛇果購于本地超市，原產地秘魯。

纖維素酶（10 000 U/g）、果膠酶（30 000 U/g）合肥Biosharp生物科技有限公司；福林-酚試劑 美國Sigma公司；無水乙醇、沒食子酸、鐵氰化鉀等（均為分析純） 國藥集團試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-2100分光光度計 美國尤尼科公司；水浴鍋鄭州長城科工貿有限公司；冷凍離心機 長沙平凡儀器儀表有限公司；旋轉蒸發儀 德國Buchi公司。

1.3 方法

1.3.1 青蛇果多酚的提取

取5 g去核青蛇果切塊，放入0.1%的硫酸氫鈉溶液中浸泡數分鐘，然后取出在研缽中將其搗碎，并轉移至燒杯中。向燒杯中加入50 mL蒸餾水，50 ℃水浴加熱60 min，再通過200目濾布過濾，粗濾液于4 000 r/min離心10 min，上清液通過旋轉蒸發儀低溫濃縮（至15 mL）后為青蛇果多酚粗提液，冷凍干燥可得蛇果粗提物粉末[4]。

1.3.2 粗提液多酚含量的測定

多酚含量的測定采用Folin-Ciocalteu法[14]，以沒食子酸為標準品，在760 nm波長測定反應液吸光度，樣品多酚含量以沒食子酸的相對值表示，每個樣品重復測定3 次。

式中：K為青蛇果多酚得率/%；ρ為所測樣液的多酚含量/（mg/mL）；n為稀釋倍數；V為提取液體積/mL；m為青蛇果質量/g。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 酶種類及其質量濃度對多酚得率的影響

在青蛇果多酚的酶法制備過程中，影響多酚得率最重要的因素是酶的種類和有效質量濃度。為研究這一因素對多酚得率的影響規律，本試驗對反應條件進行了設置：控制酶解反應溫度60 ℃、酶解pH 4，然后分別選擇不同質量濃度的纖維素酶、果膠酶以及兩種酶的復合酶，使之與青蛇果進行持續90 min的酶反應。對提取液進行同1.3.1節的過濾、離心和濃縮后，測定其多酚含量和得率，從而得到最優的復合酶配比。

1.3.3.2 酶解時間對多酚得率的影響

選取最優復合酶，控制其他反應條件（如酶解溫度、pH值）同1.3.3.1節，分別測定酶解時間為30、60、90、120、150 min時青蛇果多酚的得率。

1.3.3.3 酶解溫度對多酚得率的影響

選取最優復合酶，控制其他反應條件（如酶解時間、pH值）同1.3.3.1節，分別測定酶解溫度為30、40、50、60、70 ℃時青蛇果多酚的得率。

1.3.3.4 pH值對多酚得率的影響

選取最優復合酶，控制其他反應條件（如酶解溫度、時間）同1.3.3.1節，分別測定pH值為2、3、4、5、6時青蛇果多酚的得率。

1.3.4 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上對最優復合酶的酶解時間（A）、酶解溫度（B）和pH值（C）3 個因素進行響應面設計，以期優化青蛇果多酚的復合酶提取工藝，試驗設計方案見表1。對各因素水平條件下青蛇果提取液的多酚含量進行測定，并以計算所得青蛇果多酚的得率為響應值進行統計學回歸分析。

表1 復合酶提取青蛇果多酚的響應面試驗因素水平Table 1 Coded levels and corresponding actual values of factors used in in Box-Behnken design

1.3.5 青蛇果多酚的抗氧化活性

1.3.5.1 Fe3＋還原能力

采用普魯士藍法[15]，配制4 mmol/L鐵氰化鉀溶液、10%三氯乙酸溶液、2 mmol/L FeCl3溶液和pH 6.5的磷酸緩沖液。多酚可通過還原Fe3＋為Fe2＋，與鐵氰化鉀螯合形成一種藍色化合物，螯合物含量越高，該溶液在700 nm波長處的吸光度就越大，即表示樣品還原Fe3＋生成Fe2＋的能力越強。以蒸餾水替代樣品為空白，相應質量濃度VC為陽性對照。

1.3.5.2 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力

DPPH自由基是一種以氮為中心的化學性質相對穩定的自由基，可用來評價多酚的抗氧化能力[16]。將 青蛇果多酚粗提物配制成不同質量濃度的樣品溶液（20、40、80、100、200、400 μg/mL），取樣液2 mL加入等體積2 mmol/L DPPH溶液，充分混勻，于25 ℃避光反應30 min。取出后，測定其在517 nm波長處的吸光度。用蒸餾水作空白，VC為陽性對照。計算DPPH自由基的清除率，如式（2）所示。并以清除率達到50%時提取物的質量濃度表示其抗氧化能力，即IC50值（半數抑制濃度）。

式中：A0為空白對照組的吸光度；A1為樣品反應組的吸光度。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 酶種類及其質量濃度對多酚得率的影響

根據福林-酚法，各因素水平條件下青蛇果多酚提取液的多酚含量可通過沒食子酸標準曲線：y＝0.008 5x＋0.045 6（R2＝0.997 6）進行計算。結果表明（表2），不同種類和配比的酶在質量濃度不同（即酶活不同）的情況下，對青蛇果多酚的得率影響顯著，且多酚得率隨酶質量濃度的提升呈現先增大后略有減少的趨勢。果膠酶、纖維素-果膠復合酶（質量比1∶1、1∶2、2∶1）均在質量濃度為2.05 mg/mL時，使青蛇果多酚的得率達到最大；而纖維素酶的質量濃度達到2.55 mg/mL時，多酚得率才出現峰值。其中，由質量濃度2.05 mg/mL的復合酶（質量比2∶1）輔助提取時，青蛇果多酚的得率最高達到5.35%。因此本研究擬定質量濃度為2.05 mg/mL的纖維素-果膠復合酶（質量比2∶1）為最優復合酶，并進行后續試驗。

表2 酶種類和質量濃度對青蛇果多酚粗提液多酚得率的影響Table 2 Effect of enzyme type and concentration on the yield of polyphenols from Granny Smith apple

2.1.2 酶解時間對多酚得率的影響

圖1 酶解時間對青蛇果多酚得率的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on extraction yield of polyphenols from Granny Smith apple

由圖1可見，在90 min的提取時間內，隨著酶解時間的延長，青蛇果多酚的得率逐漸上升；而90 min后得率逐步下降。可能與 酶發揮作用的最適反應時間和溫度有關，提取時間越長未必越適合酶活力的發揮。因此，理想的青蛇果酶解時間為90 min，此時多酚得率最高。

2.1.3 酶解溫度對多酚得率的影響

圖2 酶解溫度對青蛇果多酚得率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on extraction yield of polyphenols from Granny Smith apple

由圖2可見，低于60 ℃時，隨著溫度的升高，酶活性也升高，多酚得率也隨之提高；但溫度超過60 ℃后，多酚得率開始下降，說明當溫度升高到一定程度時，酶蛋白開始受熱變性，使酶的活性降低，從而降低了多酚得率。因此擬確定青蛇果多酚提取的最佳酶解溫度應約為60 ℃。

2.1.4 pH值對多酚得率的影響

圖3 pH值對青蛇果多酚得率的影響Fig.3 Effect of pH on extraction yield of polyphenols from Granny Smith apple

由圖3可見，當提取液pH 2.0～4.0時，青蛇果多酚得率隨著pH值升高而提高，在pH值大于4.0后青蛇果多酚得率隨著pH值的升高而下降。結果表明復合酶在pH 4.0條件下活性較好，因此將酶解最佳pH值定為4.0，此時青蛇果多酚的得率最高。

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗設計與結果

單因素試驗結果顯示 ，當纖維素酶和果膠酶質量比2∶1（添加量2.05 mg/mL）、酶解時間90 min、酶解溫度60 ℃、pH 4.0時，青蛇果多酚有最大得率。青蛇果多酚提取的響應面試驗設計方案與結果 如表3所示。根據1.3.4節中的設計將酶解時間、酶解溫度和pH值作變換，以青蛇果多酚得率為響應值（Y），共設17 個試驗點，其中12 個為析因點，1 個為中心點，試驗進行了5 次，以估計誤差。利用Design-Expert 9.0軟件對表3數據進 行多元回歸擬合，得到多酚得率對以上因素的二次多項回歸模型為：Y＝5.14－0.031A＋0.017B－0.006 25C－0.015AB＋0.063AC－0.045BC－0.11A2－0.08B2－0.052C2。

表3 青蛇果多酚提取響應面試驗設計與結果Table 3 Experimental design for response surface analysis and corresponding results of polyphenol extraction from Granny Smith apple

2.2.2 回歸模型的方差分析

表4 多酚得率二次多項式回歸模型的方差分析Table 4 Analysis of variance of the regression model for the extraction yield of polyphenols from Granny Smith apple

對酶輔助提取青蛇果多酚的數學模型進行方差分析，以檢驗方程的有效性和各因素的偏回歸系數，回歸模型的方差分析如表4所示。經統計學分析可知，該試驗選用的模型極顯著（P＜0.01），方差的失擬項不顯著（P＝0.358 4＞0.05），即模型選擇合適；同時，所選模型的校正決定系數R2=0.922 9，表明此模型能解釋92.29%的結果值變化，僅有總變異7.71%不能用該模型解釋，基本可用于復合酶輔助提取青蛇果多酚得率的分析和預測。表4顯示，在此試驗設計中，除二次項AC、C2顯著（P＜0.05），A2、B2極顯著（P＜0.01）外，其余項均不顯著。

2 .2.3 響應面交互作 用分析與最佳提取條件的確定

圖4 各因素交互作用對多酚得率影響的響應面與等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots of the effects of various hydrolysis conditions on the extraction yield of polyphenols from Granny Smith apple

如圖4所示，通過對3 個曲面的觀察可以預測和檢驗變量的響應值以及確定變量之間的 相互關系[17]，響應面越陡，反映出各因素之間的兩兩交互作用越顯著。同樣，等高線的形狀也可反映出交互效應的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[18]。由響應面的陡峭程度可知，酶解時間對青蛇果多酚得率的影響最大，其次是浸提液pH值和酶解溫度，這與方差分析結果一致。等高線圖顯示，固定酶解溫度60 ℃時，酶解時間與pH值的交互作用最顯著（圖4b）；相較而言，當浸提液pH 4時，酶解溫度與酶解時間的交互作用較弱（圖4a）。

根據Box-Behnken試驗分析的結果和二次多項回歸方程，利用Design-Expert 9.0 軟件，可獲得青蛇果多酚的最佳酶輔助提取條件，即酶解時間82.9 min、酶解溫度62.5 ℃、pH 3.7。在此條件下，青蛇果多酚得率最高，為5.15%。為驗證此模型的可靠性，在最優條件下進行3 次平行實驗，結果表明，青蛇果多酚的實測平均得率為5.07%；與理論預測值相比，其相對誤差約為1.55%，說明模型可以較好地反映出青蛇果多酚提取的條件，也再次證明了通過響應面法對復合酶提取青蛇果多酚的工藝參數進行優化是可行的。

2.3 青蛇果多酚的抗氧化活性

圖5 不同質量濃度青蛇果多酚對FFee33＋的還原能力Fig.5 Ferric ion reducing capacities of different concentration levels of polyphenols from Granny Smith apple

2.3.1 青蛇果多酚對Fe3＋的還原能力測定青蛇果多酚對Fe3＋的還原力，實際上是對提取物的供電子能力進行檢驗，還原力較強的物質理論上也能更好地提供電子；一般條件下，抗氧化活性與樣品的還原能力有明顯的相關性，抗氧化能力的強弱能夠通過還原能力的強弱間接反映出來[19]。如圖5所示，不同質量濃度的多酚樣品和VC均對Fe3＋具有一定的還原能力。雖然相同質量濃度條件下青蛇果多酚的還原能力不如VC，但不難看出，即使是未經深度純化和富集的多酚粗提物，隨著質量濃度的增大，Fe3＋還原力也呈現不斷增高的趨勢，表現出青蛇果多酚的抗氧化性和開發前景。

2.3.2 青蛇果多酚對DPPH自由基的清除能力

圖6 不同質量濃度青蛇果多酚對DPPH自由基的清除能力Fig.6 DPPH radical scavenging activities of different concentration levels of polyphenols from Granny Smith apple

自由基通常指化學性質較活潑的物質，但存活期限極短；而DPPH自由基不同，其為化學性質非常穩定的自由基。因此，可通過DPPH自由基分析法，對抗氧化劑清除自由基的能力進行評價[20]。如圖6所示，青蛇果多酚和VC均對DPPH自由基均有較強的清除力，隨著樣品質量濃度的增加，青蛇果多酚對DPPH自由基的清除率逐漸增強并與VC接近，最大時可達90%以上。同時，數據處理表明青蛇果多酚粗提物清除DPPH自由基的IC50值約為22.72 μg/mL，屬于具有較強抗氧化活性的一類物質，可深度開發。

3 討 論

通過生物酶法提取植物中的生物活性成分，實 際上是在傳統的溶劑提取方法的基礎上，根據植物細胞壁的構成，利用酶反應所具有的高度專一性特點，選擇相應的酶，將細胞壁的組成成分水解或降解，使有效成分充分暴露出來并溶解、混懸于溶劑中，從而提高得率[21-22]。蘋果，特別是青蛇果中含有大量果膠質和纖維素類物質，而青蛇果多酚幾乎被以纖維素和果膠為主要構成的細胞壁所包圍[23-24]，因此本實驗選用纖維素酶和果膠酶對蘋果果肉進行酶解，并基于以上原理建立了復合酶法提取青蛇果多酚的工藝，以期得到較高的得率。采用復合酶輔助提取青蛇果肉多酚的最佳工藝條件為：纖維素酶和果膠酶復配（添加量2.05 mg/mL，質量比2∶1）、酶解溫度62.5 ℃、水解時間82.9 min、pH 3.7。在此條件下，青蛇果多酚的得率可達5.07%，與傳統非酶法提取的青蛇果多酚相比提高了近50%（1.3.1節所得為傳統提取法蛇果多酚的粗提液，其多酚得率僅為3.47%）。更值得一提的是，酶法輔助整個提取過程無試劑污染，實現了綠色提取，符合低碳經濟的原則。且其工藝較為簡單，操作方便起來快捷、制備率較高，而且對環境污染較小，適用于蘋果多酚的大規模工業生產。

另外，本實驗還對復合酶提取青蛇果多酚的抗氧化活性進行了研究。結果顯示，該多酚粗提物的Fe3＋還原能力和DPPH自由基清除能力均不如陽性對照VC，但它們始終處于同一數量級。一般來說，欲得到純度更高的植物多酚，粗提物還需經過多級柱層析的富集和純化，如AB-8、XAD-7HP、LX-1等[3,5]，均是適于分離純化蘋果多酚的樹脂填料。上述水提青蛇果多酚的得率已可達到5%以上，倘若進一步純化，其多酚含量或純度至少會提升10～20 倍[25-26]。因此，本方法所優化提取的青蛇果多酚實際上是一種良好的天然抗氧化劑的前體物質，極具深入研究和開發的價值。

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Optimization of Multi-Enzymatic Extraction of Polyphenols from Granny Smith Apple and Their Antioxidant Activity

ZHANG Di1, LIU Yang1, LI Shuyi1,2,*
(1. College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China; 2. Hubei Provincial Key Laboratory for Agricultural Products Processing and Conversion, Wuhan Polytechnic University, Wu han 430023, China)

Granny Smith apple, an apple cultivar with high acidity, is rich in polyphenols, such as procyanidins. In this study, the extraction of polyphenols from Granny Smith apple by multi-enzymatic hydrolysis was optimized by the combined use of single factor method and Box-Behnken design. A mixture of cellulose and pectinase (2:1, m/m) was found to be the most efficient enzyme for the extraction of polyphenols. The maximum yield of polyphenols of 5.07% was obtained when the enzymatic extraction was done at 62.5 ℃ for 82.9 min with an initial pH of 3.7. According to the statistical analysis, the response surface model developed could be used to analyze and predict the extraction of polyphenols from Granny Smith apple effectively. Additionally, the polyphenols extracted from Granny Smith apple exhibited significant Fe3+reducing capacity and DPPH free radical scavenging activity and the half-inhibition concentration (IC50) for scavenging of DPPH free radical was 22.72 ?g/mL, showing that the extract is a good source of antioxidants, and could be further utilized and explored as a useful food additive or antioxidant.

Granny Smith apple; polyphenol; multi-enzymatic extraction; response surface methodology; antioxidant activity

10.7506/spkx1002-6630-201604009

TS201.2

A

1002-6630（2016）04-0051-07

張迪, 劉洋, 李書藝. 響應面試驗優化復合酶法提取青蛇果多酚工藝及其抗氧化活性[J]. 食品科學, 2016, 37(4): 51-57.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604009. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Di, LIU Yang, LI Shuyi. Optimization of the multi-enzymatic extraction of polyphenols from Granny Smith apple and their antioxidant activity[J]. Food Science, 2016, 37(4): 51-57. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201604009. http://www.spkx.net.cn

2015-06-24

武漢輕工大學本科生創新創業訓練計劃項目（CXXL20151003）

張迪（1993—），男，學士，研究方向為天然產物化學。E-mail：zd1208@126.com

*通信作者：李書藝（1987—），女，講師，博士，研究方向為功能食品與食品營養學。E-mail：lishuyisz@sina.com