響應面試驗優化超聲波輔助木瓜蛋白酶嫩化河蚌肉工藝

周 丹，文連奎，董周永，周亞軍,（.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 308；.吉林大學生物與農業工程學院，吉林 長春 300）

響應面試驗優化超聲波輔助木瓜蛋白酶嫩化河蚌肉工藝

周 丹1，文連奎1，董周永2，周亞軍2,*
（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118；2.吉林大學生物與農業工程學院，吉林 長春 130022）

為解決河蚌肉的肉質粗韌問題，提高其食用品質，利用 超聲波輔助木瓜蛋白酶對其嫩化處理。通過Box-Behnken試驗設計，建立了綜合評分與超聲功率、超聲時間、木瓜蛋白酶質量分數之間的二次回歸模型；確定超聲波輔助木瓜蛋白酶嫩化河蚌肉的最佳工藝參數為木瓜蛋 白酶質量分數6%、超聲功率150 W、超聲時間27 min，此時河蚌肉嫩化效果最佳。與木瓜蛋白酶、超聲波、CaCl2嫩化效果相比，可溶性蛋白含量提高48%，硬度和咀嚼性分別降低63%和65%。

河蚌肉；嫩化；超聲波；木瓜蛋白酶

河蚌是一種普通的淡水雙殼類動物，是中國特有資源。在我國河蚌業中，河蚌主要為了獲得珍珠，產珠后大多數河蚌肉被丟棄，帶來資源浪費和環境污染。河蚌肉營養豐富，有涼血降脂、滋陰明目等功效[1]，其蛋白含量高、脂肪含量低，是大多消費者普遍追求的健康食品[2]，但河蚌肉因肉質粗韌而一直未被充分利用。超聲波輔助木瓜蛋白酶嫩化河蚌肉是利用超聲波的空化效應及機械作用[3]使細胞結構發生改變，增加酶的接觸量，提高嫩化效果。超聲波輔助酶法主要應用于有效成分的提取[4-5]，而在肉嫩化方面的應用研究至今鮮有報道。本實驗將超聲波輔助木瓜蛋白酶用于野生河蚌肉嫩化，為蚌肉嫩化提供一種新方法，同時拓寬超聲波的應用領域，對提高蚌肉食用品質及商業價值具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

河蚌產于吉林省松原市扶余市長春嶺鎮。

碳酸氫鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鉀、氯化鈉、氫氧化鈉、無水乙醇 北京化工廠；硫酸銅天津市福晨化學試劑廠；酒石酸鉀鈉 天津市華東試劑廠；過硫酸銨、溴酚藍、丙烯酰胺 西隴化工股份有限公司；甘氨酸、十二烷基硫酸鈉、考馬斯亮藍R250 上海惠世生化試劑有限公司；N,N-甲叉雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷 上海化學試劑采購供應站分裝廠；甲醇天津市富宇精細化工有限公司；乙二胺四乙酸二鈉、1,4-二硫代蘇糖醇、四甲基乙二胺、丙三醇、冰醋酸 國藥集團化學試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

KQ-250DB數控超聲波儀 昆山市超聲儀器有限公司；pH S-25型數字酸度計 杭州東星儀器設備廠；MZS-小型實驗均質機 無錫市永如輕化設備廠；TGL-16gR型高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；JA3003A型電子天平 上海精天電子儀器有限公司；DYCA-24DN型雙垂直板電泳儀 北京六一儀器廠；TU-1810型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；CT3-50 kg質構儀 美國Brookfield公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

新鮮的河蚌清洗干凈，去除蚌殼、蚌淚及內臟，將河蚌肉切成大小薄厚均勻，質量9 g的肉塊，并與配制好的100 mL木瓜蛋白酶溶液裝在雙層聚乙烯塑料袋中，在真空度600 Pa條件下真空包裝，進行超聲處理。嫩化處理后，所有樣品貯存在4 ℃條件下備用。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 可溶性蛋白含量

可溶性蛋白含量的變化對肉的嫩度有影響[6]。參照李蘭會等[7]的方法，根據實驗條件進行適當修改，取河蚌肉9.00 g，剪碎后加入90 mL提取液（20 mmol/L K3PO4、1 mmol/L CaCl2、100 mmol/L KCl、1 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，pH 7.0），提取液貯存于0～4 ℃。用均質機將河蚌肉搗碎均勻，勻漿后倒入10 mL離心管中，在8 500 r/min條件下冷凍離心30 min，用雙縮脲法[8]測定上清液中可溶性蛋白含量。

1.3.2.2 質構特性

通過質構儀穿透法[9-10]測定河蚌肉的硬度和咀嚼性。室溫條件下檢測，每組樣品測量8 次，取平均值。

1.3.2.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

河蚌肉大分子蛋白質在超聲波輔助酶法處理條件下，部分降解為小分子蛋白和多肽，分子質量變小，用SDS-PAGE可直觀地表示這一現象[11]。濃縮膠和分離膠的質量分數分別為5%和12%。用1.0 mol/L Tris-HCl溶液（pH 7.0）將可溶性蛋白的質量濃度調整至（3.0±0.5）mg/mL，取20 μL樣品，加入5 μL 5倍稀釋的樣品緩沖液，沸水浴5 min。取5 μL處理后的液體點樣，進行凝膠電泳[12]。

1.3.2.4 感官特性評價

感官評定小組由7 名碩士研究生組成，對嫩化后河蚌肉的色澤、黏度、彈性進行感官評價[1]，感官評分標準見表1。

表1 感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standardss

1.3.2.5 蒸煮損失率

將嫩化處理后的蚌肉樣品分別放入聚乙烯塑料薄膜袋中、封口，于95 ℃水浴鍋中加熱40 min，取出后立即用流動水冷卻至室溫。用濾紙吸干蚌肉樣品表面水分，用分析天平稱量樣品加熱處理前后的質量，按下式計算蒸煮損失率。每個處理重復測量3 次，取平均值作為測量數據。

1.3.3 超聲波輔助木瓜蛋白酶嫩化蚌肉工藝優化試驗

對木瓜蛋白酶質量分數、超聲時間、超聲功率3 個主要因素，進行基于Box-Behnken設計的響應面優化試驗研究[14]，因素水平編碼見表2。以可溶性蛋白含量、質構特性、感官評價為指標對河蚌肉嫩化效果進行綜合評價，采用SPSS 17.0軟件中的因子分析，將評價指標結合得出綜合評分，探索超聲波輔助酶法嫩化蚌肉的最佳工藝參數。

表2 Box-Behnken試驗因素與水平Table 2 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.4 統計分析

采用Origin 8.1、Design-Expert 8.0.6和SPSS 17.0統計軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 各單因素對可溶性蛋白含量的影響

圖1 不同因素對可溶性蛋白含量的影響Fig.1 Effects of tenderization conditions on soluble protein content

木瓜蛋白酶是特異性蛋白水解酶，可將河蚌肉肌漿蛋白、肌原纖維蛋白、膠原蛋白和結締組織彈性蛋白降解生成其他小分子蛋白[15-16]。在超聲波作用下，可削弱肌球蛋白和肌動蛋白間相互作用，肌纖維受到破壞。將超聲波與木瓜蛋白酶同時作用于河蚌肉，超聲波處理對肌纖維蛋白產生機械物理破壞作用，同時其空化作用使線粒體、肌質網和溶酶體膜破壞，加快木瓜蛋白酶溶液的擴散和滲透，提高嫩化效果[17-18]。由圖1a可知，隨著超聲功率的增加，可溶性蛋白含量先增大后減小，功率在150 W時，可溶性蛋白含量達到最大值，比對照組（未作處理）增加30%。由圖1b可知，隨著木瓜蛋白酶質量分數的增大，可溶性蛋白含量逐漸增大，當木瓜蛋白酶質量分數達到6%時，可溶性蛋白含量逐漸平緩并趨于穩定。由圖1c可知，隨著超聲時間的延長，可溶性蛋白含量快速增大，25 min時可溶性蛋白含量達到最大，之后有緩慢減小的趨勢，結果與劉新玲等[19]的研究基本一致。由圖1d可知，隨著pH值的升高，可溶性蛋白含量逐漸增加后降低，pH值達到6.5時，可溶性蛋白含量達到最大。

2.1.2 各單因素對質構特性的影響

圖2 不同因素對質構特性的影響Fig.2 Effects of tenderization conditions on texture properties of mussel

由圖2a可知，當超聲功率在150 W時，硬度最小，咀嚼性趨于平穩。結果與Siró等[20]的研究基本一致。由圖2b可知，隨著木瓜蛋白酶質量分數的增大，硬度和咀嚼性顯著降低，當木瓜蛋白酶質量分數達到6%時，硬度和咀嚼性分別降低60%、57%，結果與蘇丹[12]的研究基本一致。由圖2c可知，超聲時間在25 min時，硬度和咀嚼性分別降低63%和66%。由圖2d可知，木瓜蛋白酶pH值對河蚌肉硬度和咀嚼性影響明顯，pH 5.5時硬度達到最小，pH 7.5時咀嚼性最小。這說明，超聲波與木瓜蛋白酶對提高蚌肉嫩度有協同作用，可有效降低蚌肉硬度和咀嚼性。

2.2 響應面試驗結果

以木瓜蛋白酶質量分數（X1）、超聲功率（X2）、超聲時間（X3）為試驗因素，應用SPSS統計軟件中因素分析將硬度、咀嚼性、彈性、感官評價以及可溶性蛋白含量擬合為響應值，設計三因素三水平的Box-Behnken優化試驗。試驗設計因素水平及結果見表3。

表3 響應面試驗設計方案及結果Table 3 Box-Behnken experimental design with experimental results

試驗數據通過Design-Expert軟件回歸分析，得到超聲波輔助木瓜蛋白酶嫩化河蚌肉綜合評分Y與影響因素關系的二次多項回歸方程：

如表4所示，該模型F值為45.32，P＜0.000 1，說明回歸方程模型極顯著；失擬項P值為0.152 6，表明該模型相對于絕對誤差不顯著，說明通過試驗得到的二次回歸方程能很好地對響應面值進行預測。模型的相關系數R2＝0.983 1，表明自變量與響應值之間的線性關系顯著，可用于試驗的理論預測。調整確定系數＝0.961 4，表明回歸方程與試驗值具有高度擬合性，說明該模型可很好解釋響應值的變化[21]。因此，該回歸模型可用來對超聲波輔助酶法嫩化河蚌肉的工藝優化。經回歸系數顯著性檢驗可知，木瓜蛋白酶質量分數、超聲功率、超聲時間的一次項和平方項、超聲功率和超聲時間交互作用均為顯著項。注：**.差異極顯著，P＜0.01；*.差異顯著，P＜0.05。

表4 回歸模型方差分析表Table 4 Analysis of variance of regression model

圖3 各因素交互影響的響應面圖Fig.3 Response surface plots showing the effects of operating parameters on tenderization efficiency

從圖3可以看出，木瓜蛋白酶質量分數、超聲功率、超聲時間3 個因素的兩兩交互作用中，超聲功率和超聲時間的交互作用顯著，并且較高的綜合評分出現在3D效果的中心區域，綜合評分由中心向邊緣逐漸減小。

通過Design-Expert軟件對各因素求導，得出超聲波輔助酶法嫩化河蚌肉的最佳工藝條件為：木瓜蛋白酶質量分數6.27%、超聲功率157.91 W、超聲時間27.17 min。在此最佳條件下，綜合評分的理論值為1.102 17。為進一步驗證響應面分析結果的可靠性，對最優條件進行實際調整，在木瓜蛋白酶質量分數6%、超聲功率150 W、超聲時間27 min的條件下進行3 次驗證實驗。得到嫩化效果的綜合評分值為0.992 34，與預測綜合評分值接近。因此，采用響應面分析優化得到的超聲波輔助酶法嫩化河蚌肉的參數準確可靠，可為河蚌肉的嫩化工藝提供理論依據。

2.3 不同嫩化方法的對比實驗結果

表5 不同嫩化方法的對比Table 5 Comparison of different tenderization methods

使用不同的嫩化方法的最佳條件，對河蚌肉嫩化處理。由表5可知，不同嫩化方法均能使河蚌肉可溶性蛋白含量、質構特性、感官評分和蒸煮損失率發生改變。超聲波-木瓜蛋白酶、木瓜蛋白酶、CaCl2、超聲波處理后河蚌肉的可溶性蛋白含量分別比對照提高48%、32%、8%、19%。其中超聲波輔助木瓜蛋白酶處理的河蚌肉可溶性蛋白含量最高。超聲波-木瓜蛋白酶處理后樣品的硬度和咀嚼性比對照組降低63%、65%，且低于其他嫩化方法。這表明超聲波-木瓜蛋白酶處理的河蚌肉更易消化。

由表5可知，超聲波-木瓜蛋白酶嫩化處理后樣品黃色均勻，外表微干不黏，新切面濕潤，彈性有較大幅度提高。木瓜蛋白酶處理后的樣品彈性提高也很明顯，但樣品變白嚴重，外表較黏，這可能是由于木瓜蛋白酶質量分數過大或作用時間過長，使蚌肉膠原蛋白和肌原纖維蛋白過度降解，從而肉的色澤和形態變差。超聲波-木瓜蛋白酶處理后的蒸煮損失率減少23%，這可能是由于超聲波處理使肌肉纖維間距和肌節變寬、細胞破裂，使水分進入到細胞中，使細胞的持水性增加，蒸煮損失率減小。

圖4 不同嫩化方法處理后河蚌肉蛋白質SDS-PAGGEE圖Fig.4 SDS-PAGE of mussel treated by different tenderization methods

由圖4可知，不同嫩化方法對河蚌肉的蛋白都有降解，與對照組相比，分子質量約為220 kD的肌動蛋白和97.2 kD的大分子蛋白消失，介于14.3～29 kD的a條帶和b條帶明顯變寬且顏色加深，且2號泳道變化最明顯，這表明，超聲波-木瓜蛋白酶處理后，河蚌肉中的肌動蛋白和膠原蛋白等大分子蛋白降解生成小分子蛋白或多肽，嫩化效果明顯。

綜上所述，超聲波-木瓜蛋白酶嫩化處理改善肌肉組織結構，提高嫩化效率，使肉的硬度和咀嚼性降低、彈性和持水性提高，使蚌肉易消化吸收。同時降低酶添加量，較大程度減輕酶對蚌肉色澤的影響，使蚌肉具有良好的感官特性。因此，超聲波-木瓜蛋白酶優于木瓜蛋白酶處理等其他嫩化方法。

3 結 論

Box-Behnken試驗設計優化出超聲波-木瓜蛋白酶嫩化河蚌肉的最佳工藝參數為木瓜蛋白酶質量分數6%、超聲功率150 W、超聲時間27 min。不同嫩化方法對比實驗表明，超聲波-木瓜蛋白酶嫩化處理后樣品可溶性蛋白含量提高48%，硬度和咀嚼性分別降低63%和65%，蒸煮損失率減少23%，持水性和彈性提高，樣品色澤和形態較好。因此，超聲波輔助木瓜蛋白酶嫩化蚌肉效果最佳，耗時最短。

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Optimization of Ultrasound-Assisted Papain Treatment for Tenderizatoin of Freshwater Mussel

ZHOU Dan1, WEN Liankui1, DONG Zhouyong2, ZHOU Yajun2,*
(1. College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2. College of Biological and Agricultural Engineering, Jilin University, Changchun 130022, China)

In order to improve the taste of freshwater mussel meat, tenderization was carried out by ultrasound-assisted papain treatment. Using Box-Behnken experimental design, a quadratic regression model was developed indicating the effect of ultrasonic power, ultrasonication time, and enzyme concentration on tenderization efficiency. Through response surface analysis of the established model, the optimal parameters that provide the best tenderness of mussel meat were determined as 6%, 150 W and 27 min for enzyme concentration, ultrasonic power and ultrasonication time, respectively. Compared with individual treatment with papain, ultrasound and CaCl2, the combined treatment resulted in a 48% increase in soluble protein content of mussel meat, with a simultaneous decrease in hardness and chewiness by 63% and 65%, respectively.

freshwater mussel; tenderness; ultrasound-assisted treatment; papain

10.7506/spkx1002-6630-201604011

TS254.9

A

1002-6630（2016）04-0062-06

周丹, 文連奎, 董周永, 等. 響應面試驗優化超聲波輔助木瓜蛋白酶嫩化河蚌肉工藝[J]. 食品科學, 2016, 37(4): 62-67.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604011. http://www.spkx.net.cn

ZHOU Dan, WEN Liankui, DONG Zhouyong, et al. Optimization of ultrasound-assisted papain treatment for tenderizatoin of freshwater mussel[J]. Food Science, 2016, 37(4): 62-67. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604011. http://www.spkx.net.cn

2015-06-08

長春市現代農業發展科技支撐計劃項目（13NK13）；吉林省現代農業重點科技攻關項目（20150204034NY）

周丹（1991—），女，碩士研究生，研究方向為農產品加工及貯藏工程。E-mail：1174774559@qq.com

*通信作者：周亞軍（1966—），男，教授，博士，研究方向為肉品科學與加工技術。E-mail：zhouruyilang@163.com