熒光衍生化法測定新疆特色葡萄干中總亞硫酸鹽含量

王金霞，林江麗，鹿 毅，王吉德（.新疆大學化學化工學院，石油天然氣精細化工教育部和新疆維吾爾自治區共建重點實驗 室，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆產品質量監督檢驗研究院，新疆 烏魯木齊 830004）

熒光衍生化法測定新疆特色葡萄干中總亞硫酸鹽含量

王金霞1,2，林江麗1，鹿 毅2,*，王吉德1
（1.新疆大學化學化工學院，石油天然氣精細化工教育部和新疆維吾爾自治區共建重點實驗 室，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆產品質量監督檢驗研究院，新疆 烏魯木齊 830004）

建立熒光衍生化法快速、準確測定新疆特色葡萄干中總亞硫酸鹽的分析方法。用N-（9-吖啶基）馬來酰亞胺為 衍生化試劑，使其與葡萄干中的亞硫酸鹽發生衍生化反應產生具有強熒光的衍生化產物，采用熒光光譜儀對其進行分析檢測。結果表明，在1.0～43.2 mg/L質量濃度范圍內相關系數（R2）為0.999 3，方法的檢出限為0.50 mg/L，3 個添加水平時，平均回收率為92.2%～100.2%，相對標準偏差（n=3）不大于3.80%。利用該法對葡萄干中總亞硫酸鹽的測定結果與國標法測得結果一致，說明該方法可快速準確地對新疆特色葡萄干中總亞硫酸鹽進行測定，為干果中亞硫酸鹽殘留量的測定提供參考。

葡萄干；總亞硫酸鹽；熒光衍生化法

食品中添加亞硫酸鹽起漂白、抗氧化、防腐保鮮及防止褐變的作用[1]。葡萄干干制過程中常添加亞硫酸及其鹽類來抑制褐變，防止果粒霉變，保持葡萄干色澤亮黃[2]。但過量添加的亞硫酸鹽會對呼吸道及人體其他器官產生危害[3-4]。因此，世界各國對食品中亞硫酸鹽最大限量做了規定[5]。美國食品和藥物管理局要求對亞硫酸鹽使用量高于10 mg/kg的食品予以標明；歐美國家的食品中的SO2殘留標準小于10 mg/kg。我國農業行業標準NY/T 1041—2010《綠色食品干果》規定：葡萄干等干果中SO2的殘留量不大于50 mg/kg[6-7]。

食品中亞硫酸鹽常用的測定方法是Monier-Williams法[8]、碘量法[9]、鹽酸副玫瑰苯胺法[10]。Monier-Williams法在蒸餾中易發生焦糖化反應[11]；碘量法靈敏度不高[12]；鹽酸副玫瑰苯胺法（即國標法）是常采用的方法，但吸收液毒性大，且色素對測定結果產生干擾[13]。隨著分析科學新方法和新技術的發展，化學發光[14]、電化學[15]、酶[16]、流動注射[17]、離子色譜[18]、毛細管電泳[19]等方法逐漸應用到亞硫酸鹽的分析檢測中，這些新方法雖然檢測靈敏度高，但樣品的前處理復雜，操作繁瑣，均無法快速、準確地對基質復雜樣品中總亞硫酸鹽含量進行分析檢測。因此，建立一種樣品基質相對復雜葡萄干中總亞硫酸鹽含量快速準確的分析方法，在食品安全備受關注的當今社會具有重要的意義。

熒光法因具有靈敏度和選擇性高、線性范圍寬、準確快速和不易受到樣品中陰陽離子和色素的干擾等優點，常應用于樣品中熒光化合物的分析檢測[20-21]。本實驗利用N-（9-吖啶基）馬來酰亞胺為熒光衍生化試劑，使其與葡萄干中的亞硫酸鹽發生衍生化反應產生具有強熒光的衍生化產物，采用熒光法對葡萄干中的亞硫酸鹽含量進行分析檢測。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

葡萄干、鮮葡萄、葡萄酒、榨菜、蝦皮等 市購。

N-（9-吖啶基）馬來酰亞胺（色譜純）；乙二胺四乙酸二鈉、硼酸、無水碳酸鈉、氯化鉀、亞硫酸氫鈉均為國產分析純試劑；所有實驗用水均為電阻率18.2 MΩ/cm的超純水。

RF-5301熒光分光光度計、UV-2550紫外分光光度計日本島津公司；Coulter Avanti J-25高速離心機 美國Beckman公司；DF-101S集熱式磁力加熱攪拌器 金壇市醫療儀器廠；KQ5200E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；FW-80高速萬能粉碎機 北京市永光明醫療儀器有限公司；XS105DU分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；PHB-8型筆式pH計 上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

N-（9-吖啶基）馬來酰亞胺溶液：準確稱取1 mg N-（9-吖啶基）馬來酰亞胺溶解于4.0 mL丙酮，待用。

緩沖溶液：A溶液：稱取6.18 g硼酸、7.46 g氯化鉀和7.4 g乙二胺四乙酸二鈉，用水溶解定容至1 L容量瓶中；B溶液：稱取10.6 g碳酸鈉和7.4 g乙二胺四乙酸二鈉，用水溶解定容至1 L容量瓶中。兩溶液按照不同體積比混合，配成pH值范圍5.0～10.0的緩沖溶液。

1.2.2 樣品前處理

將冷凍的葡萄干樣品加入液氮低溫粉碎，準確稱取粉碎后的葡萄干樣品10.0 g左右，加入0.1 mol/L氫氧化鈉溶液20.0 mL，混勻，超聲提取15 min，10 000 r/min離心10 min，取上層清液定容至25 mL容量瓶中，于4 ℃冰箱保存。

1.2.3 衍生化反應及測定

準確移取樣品溶液50.0、150.0 ?L N-（9-吖啶基）馬來酰亞胺溶液和3.0 mL緩沖溶液置于反應瓶中，混勻，放置10 min，于50 ℃水浴中反應20 min后，立即放入冰水中冷卻至室溫，使衍生化反應停止。在激發波長360 nm、發射波長442 nm、狹縫寬度5 nm條件下，在380～600 nm波長處對反應體系進行熒光光譜掃描。

1.2.4 鹽酸副玫瑰苯胺法測定總亞硫酸鹽

參照GB/T 5009.34—2003《食品中亞硫酸的測定》方法，對樣品進行測定。

1.2.5 標準溶液的配制

稱取0.5 g亞硫酸氫鈉，1.85 g乙二胺四乙酸二鈉，用水定容至250 mL容量瓶，使用前用碘量法標定，于4 ℃冰箱保存至多3 d，使用時用0.1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液稀釋至所需質量濃度。

2 結果與分析

2.1 衍生化反應條件優化

圖1 緩沖液pH值（a）、物質的量比（b）和反應溫度（c）對體系熒光強度的影響Fig.1 Effect of buffer pH (a), molar ratio (b) and reaction temperature (c) on the fluorescence intensity

圖2 反應時間（a）、緩沖液體積（b）和靜置時間（c）對體系熒光強度的影響Fig.2 Effect of reaction time (a), buffer solution volume (b) and standing time (c) on the fluorescence intensity

為使亞硫酸鹽與衍生化試劑充分反應，對影響衍生化反應的緩沖液pH值、N-（9-吖啶基）馬來酰亞胺與亞硫酸物質的量比、反應溫度、反應時間、緩沖液體積和靜置時間等條件進行優化。如圖1、2所示，pH 9.0（圖1a）、N-（9-吖啶基）馬來酰亞胺亞硫酸鹽物質量比15∶1（圖1b）、反應溫度50 ℃（圖1c）、 緩沖鹽體積3.0 mL（圖2b，小于3 mL無法進行熒光檢測）、反應時間20 min（圖2a）為最佳衍生化反應條件，從圖2c可以看出，衍生化反應結束應立即進行熒光強度測試。

2.2 樣品中亞硫酸鹽超聲提取條件的優化

圖3 提取時間（a）和提取溫度（b）對樣品中亞硫酸鹽提取的影響Fig.3 Effect of extraction time (a) and temperature (b) on the extraction of sulfite from raisin

為使樣品中亞硫酸鹽充分浸提，對樣品中亞硫酸鹽的提取時間和提取溫度等提取條件進行了優化。如圖3所示，隨著提取時間的延長（圖3a），亞硫酸鹽提取量增大，熒光強度逐漸增大。提取時間15 min時，熒光強度達到最大值，說明樣品中的亞硫酸鹽被充分浸提。提取時間超過15 min后，熒光強度逐漸降低。故選擇提取時間15 min為樣品提取最佳時間。另外，從圖3b可以看出，提取溫度對樣品中亞硫酸鹽提取的影響較小。故選擇室溫作為對樣品中亞硫酸鹽提取的適宜溫度。

2.3 標準曲線、線性范圍及檢出限

用亞硫酸鹽氫鈉儲備液配制一系列不同質量濃度的標準溶液，按1.2.3節衍生化反應方法測定反應混合液的熒光強度。以亞硫酸氫鈉質量濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標，繪制標準曲線，得到亞硫酸氫鈉的線性回歸方程、線性范圍、相關系數，以3 倍空白標準偏差除以校準曲線的斜率得到亞硫酸鹽的檢出限。由表2可知，亞硫酸氫鈉與熒光強度在質量濃度1.0～43.2 mg/L范圍內呈現良好的線性關系，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）不大于3.33%。

表2 兩種方法線性方程、相關系數、線性范圍、檢出限、RRSSDD（n==33）TTaabbllee 22 RReeggrreessssiioonn eeqquuaattiioonnss aanndd ccoorrrreellaattiioonn ccooeeffffiicciieennttss,, lliinneeaarr ranges, LODs, and RSDs of the pararosaniline method and fluorescence derivatizatiioonn ((n == 33))

2.4 加標回收率

取葡萄干樣品9 份，分別按低、中、高3 個水平（0.60、1.2、2.0 mg）添加亞硫酸鹽標準溶液。按1.2.2節樣品處理方法與1.2.3節衍生化反應方法操作，測定反應混合液的熒光強度，結果見表3，加標回收率范圍為92.2 %～100.2%，RSD不大于3.80%，說明本方法滿足定量分析實驗要求。

表3 加標回收率實驗結果（ =3）Table 3 Recoveries of the fluorescence derivatization method for spiked sampples ( = 3)

2.5 實際樣品分析

采用熒光衍生化法對兩種無核葡萄干、葡萄、葡萄酒、蝦皮、榨菜中總亞硫酸鹽含量進行測定。結果見表4，兩種無核葡萄干中總亞硫酸鹽含量分別為1.31 mg/kg和3.11 mg/kg。鮮食葡萄、葡萄酒、蝦皮、榨菜中的總亞硫酸鹽含量分別為2.37、67.08、12.95、0.77 mg/kg。

表4 實際樣品中總亞硫酸鹽含量的測定（ =4）Table 4 Contents of total sulfite in real samples determined by the pararosaniline method and fluorescence derivatization ( = 4)

2.6 兩種方法的比較

為了驗證熒光衍生化法的準確性，采用熒光衍生化法和鹽酸副玫瑰苯胺法對兩種無核葡萄干、葡萄、葡萄酒、蝦皮及榨菜6 個樣品中總亞硫酸鹽含量進行測定。從表2可以看出，熒光衍生化法的線性范圍比鹽酸副玫瑰苯胺法高一個數量級，且熒光衍生化法樣品前處理所需時間不到鹽酸副玫瑰苯胺法的一半。從表4也可以看出，兩種方法的RSD不大于3.32%，說明本實驗建立的方法準確可靠。

3 結 論

建立一種熒光衍生化法測定新疆特色葡萄干中總亞硫酸鹽的分析方法。利用N-（9-吖啶基）馬來酰亞胺與葡萄干樣品中的亞硫酸鹽反應生成具有強熒光的衍生化產物，采用熒光光譜儀對新疆特色葡萄干中總亞硫酸鹽含量進行檢測，線性范圍、相關系數及RSD均較好。與鹽酸副玫瑰苯胺法相比較，線性范圍寬、檢出限低、樣品前處理所需時間較短，同時避免了有毒試劑的使用。而且熒光法檢測所需試樣量少，不易受色素的干擾，有利于大批樣品的分析檢測。利用該法對葡萄干、鮮食葡萄等5 種樣品中總亞硫酸鹽含量進行測定，其結果與國標法測定結果一致。說明該法測定結果準確可靠，重復性好，對樣品基質較為復雜的干果中總亞硫酸鹽的分析檢測具有一定的參考價值。

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Determination of Total Sulfite in Xinjiang Specialty Raisin by Fluorescence Derivatization

WANG Jinxia1,2, LIN Jiangli1, LU Yi2,*, WANG Jide1
(1. Key Laboratory of Oil and Gas Fine Chemicals Ministry of Education and Xinjiang Uyghur Autonomous Region, College of Chemistry and Chemical Engineering, Xinjiang University, ürümqi 830046, China; 2. Xinjiang Supervision and Inspection Institute for Product Quality, ürümqi 830004, China)

A rapid and accurate method for the determination of total sulfite in Xinjiang specialty raisin was developed using fluorescence derivatization. N-(9-Acridinyl) maleimide (NAM) reacted with the sulfite in raisin to form strong fluorescent derivatives, which were then detected by fluorometry. The linear range of the method was between 1.0 and 43.2 mg/L, with a correlation coefficient (R2) of 0.999 3. At three spiked levels, the average recoveries of sulfite in raisin ranged from 92.2% to 100.2% with relative standard deviations lower than 3.80% (n = 3). Furthermore, the results obtained by this method for the total sulfite content of raisin were consistent with those obtained by the pararosaniline method. These results indicate that the fluorescence derivatization method can accurately and rapidly determine total sulfite in Xinjiang specialty raisin.

raisin; total sulfite; fluorescence derivatization

10.7506/spkx1002-6630-201604038

O657.3

A

1002-6630（2016）04-0212-04

王金霞, 林江麗, 鹿毅, 等. 熒光衍生化法測定新疆特色葡萄干中總亞硫酸鹽含量[J]. 食品科學, 2016, 37(4): 212-215.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604038. http://www.spkx.net.cn

WANG Jinxia, LIN Jiangli, LU Yi, et al. Determination of total sulfite in Xinjiang specialty raisin by fluorescence derivatization[J]. Food Science, 2016, 37(4): 212-215. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604038. http://www.spkx.net.cn

2015-03-24

新疆維吾爾自治區自然科學基金項目（2013211A015）

王金霞（1989—），女，碩士研究生，研究方向為天然產物分析。E-mail：372467867@qq.com

*通信作者：鹿毅（1966—），男，教授級高級工程師，博士，研究方向為農產品成分分析及質量監控。E-mail：wangjinxia6868@163.com