西部散養肉牛病毒性腹瀉病毒流行及遺傳變異

陳 銳，范學政，朱元源，鄒興啟，徐 璐，張乾義，王 琴，趙啟祖

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西部散養肉牛病毒性腹瀉病毒流行及遺傳變異

陳 銳，范學政，朱元源，鄒興啟，徐 璐，張乾義，王 琴，趙啟祖

（中國獸醫藥品監察所，北京100081）

【目的】牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）是一種可導致養牛業出現重大經濟損失的常見病原體。該文以中國西部散養肉牛為研究對象，擬通過血清學方法和生物信息分析，評估BVDV在中國散養肉牛中的整體流行狀況，探究國內流行的BVDV基因多樣性，為制定針對BVDV的合理防控措施和疫苗的研發提供理論依據與素材。【方法】2014—2015年分別從云南、新疆、甘肅和內蒙古4省（區）采集散養肉牛的血清樣本共1 332份，利用BVDV抗體檢測試劑盒進行檢測，統計不同地區散養肉牛BVDV抗體陽性率。將抗體陰性的血清樣本進行BVDV抗原檢測，抗原陽性或可疑血清接種MDBK細胞，連續盲傳五代分離病毒。根據BVDV 5'-UTR保守序列設計引物，經RT-PCR擴增5'-UTR序列并測序。利用Sequencher4.2、BLAST、ClustalX、MEGA5.2等軟件對序列進行生物信息學分析，繪制流行毒株系統進化樹，確定分離毒株的基因型。【結果】4省（區）散養肉牛BVDV整體抗體陽性率為33.93%。血清抗體陽性率從高到低依次為內蒙71.43%，新疆57.69%，甘肅第16.54%，云南10.0%。BVDV抗原整體陽性率為1.58%，新疆抗原陽性率最高。研究共分離13株BVDV流行毒株，分別命名為甘肅120、內蒙1369、伊犁霍清12953、伊犁霍清12960、伊犁霍清12981、博州精河13001、博州精河13023、博州精河13033、新疆奇臺13041、新疆奇臺13042、新疆奇臺13191、新疆奇臺13220、新疆奇臺13251。進化樹分析顯示新疆地區散養肉牛中流行的主要是BVDV-1q和BVDV-1f，內蒙地區流行的主要是BVDV-1m，甘肅地區流行的是一種新的基因亞型BVDV-1u。【結論】通過血清學方法檢測發現，雖然4個省（市、自治區）散養肉牛整體抗體陽性率低于國內平均水平，但情況卻不盡相同。內蒙古和新疆抗體高陽性率表明BVDV在這些地區散養肉牛中已經廣泛流行，必須采取適當措施將其危害性降到最低。從基于5'-UTR序列繪制的系統進化樹可以看出，不同地區散養肉牛感染的BVDV基因亞型有所不同。總體看來，BVDV在散養肉牛中的分布呈現多樣性，跨物種、跨地域傳播和高突變性等特點，這些都使疫苗免疫策略面臨嚴峻的挑戰。研究通過對各地區散養肉牛的隨機大量采樣、檢測和分析，客觀評價BVDV在散養肉牛中的流行情況，為更好的制定預防策略提供參考依據。

BVDV；散養肉牛；ELISA；陽性率；基因分型

0 引言

【研究意義】牛病毒性腹瀉病（BVD）是危害養牛業的重大經濟性疾病之一，在世界各國普遍流行[1]。感染牛通常表現為發熱、不同程度的腹瀉、免疫抑制或白細胞減少并時常伴有繼發感染，母畜妊娠期間感染甚至會流產或產下病毒血癥牛（即持續性感染牛，PI牛），因此會對牛的生產性能和繁殖性能造成嚴重影響。近幾年來，隨著中國社會經濟的快速發展，居民生活質量的不斷提高，肉牛產業進入了快速發展的階段。雖然肉牛養殖規模化程度在不斷提升，但是散養戶及小規模養牛戶仍是目前國內肉牛養殖業的主體。據報道[2-3]，中國西北地區的甘肅、新疆，北部的內蒙古以及南部的云南肉牛的存欄量位居全國前列，其經濟收益也在當地居民總收入中占重要比例。隨著重大動物疫病的逐步控制，這些慢性消耗性疫病對養殖業的影響逐漸顯現，為了有效預防控制BVDV，需要對其流行狀況進行調研。【前人研究進展】牛病毒腹瀉性病毒（BVDV）是由囊膜包被的核衣殼及核酸組成，是黃病毒科瘟病毒屬的代表種[4]，于1954年在細胞培養物中首次被分離并命名。根據病毒對培養細胞有無致病變性，可以將BVDV分為致細胞病變型（CP）和非致細胞病變型（NCP）兩個生物型。同時，基于5′-UTR、Npro或E2基因的部分序列，可將BVDV分為BVDV-1和BVDV-2兩個基因型。一些研究發現不同基因型BVDV病毒能夠產生交叉保護力[5-7]，但也有一些研究論證了BVDV基因型與分離毒株間只存在部分交叉免疫保護[8]。到目前為止，至少發現了17種BVDV-1（1a—1t）[9-12]亞型和4種BVDV-2（2a—2d）[13-14]亞型。國內報道主要流行的是BVDV-1b，BVDV-1m，BVDV-1q[15]。【本研究切入點】由于散養肉牛分布不集中、流動快、混群飼養等原因，有關中國散養肉牛中BVD流行狀況和流行毒株的報道寥寥無幾。2014—2015年，對云南、新疆、甘肅和內蒙古4省（區）健康散養肉牛流行性腹瀉病進行監測，共采集血清樣本1 332份。【擬解決的關鍵問題】本研究首次以不同地區散養肉牛為調查對象，擬通過血清學檢測方法對新疆、甘肅、內蒙和云南4個地區散養肉牛中BVD的流行情況進行摸底，大致掌握這些地區散養肉牛BVDV感染狀況，為評估全國散養肉牛BVDV感染水平以及制定合理的預防程序提供理論依據。同時，對分離病毒進行基因分型，來幫助闡明不同毒株間的遺傳演化關系，追溯病毒傳播來源和預測預報病毒的流行趨勢，從而為BVDV疫苗的研制積累素材。

1 材料與方法

試驗于2014年至2015年6月在中國獸醫藥品監察所檢測技術研究室實驗室完成。

1.1 樣品收集與保存

2014—2015年從中國云南、新疆、甘肅和內蒙古4省（區）采集多批散養肉牛血液，共收集1 332份血清樣本（表1）。其中云南樣品主要來自保山瓦馬、保山舊城和大理云龍；新疆樣品采集于伊犁霍清、奇臺和博州精河；甘肅樣品來自河西走廊地區；內蒙古樣品來自錫盟草原。血液樣本4 000 r/min離心15 min，取上清于滅菌的1.5 mL離心管中，-20℃保存備用。

表1 4個省（區）采集的健康散養肉牛血液樣品

1.2 BVDV抗體和抗原ELISA檢測

利用商品化BVDV抗體檢測試劑盒（IDEXX，99-44000）對每批血清樣本進行檢測，計算 S/P值，算出樣本陽性率。S/P值小于0.20的被檢樣品判定為BVDV抗體陰性，S/P值大于或等于0.20但小于0.30的被檢樣品判定為BVDV抗體可疑，S/P值大于或等于0.30的被檢樣品，判定為BVDV抗體陽性。

研究已經證明了抗體陽性率與抗原陽性率之間是負相關的關系[15]，血清抗體水平高的樣品，抗原檢測均為陰性，血清抗體陰性或可疑的樣品，抗體檢測為陽性居多，研究中進一步證明了這一點。本研究選擇了S/P≤0.6的陽性血清以及抗體陰性的血清樣本進行BVDV抗原檢測（IDEXX，99-43830）。

1.3 病毒分離

將0.5 mL BVDV陽性或可疑血清樣本接種單層MDBK細胞，37℃吸附1 h后棄去，加入5 mL 2%FBS 的MEM維持液（含100 IU·mL-1青霉素，100 μg·mL-1鏈霉素）在5%CO2培養箱中繼續培養3 d。反復凍融3次，收獲病毒上清液。連續盲傳5代，利用IDEXX抗原檢測試劑盒鑒定是否分離到病毒。

1.4 RT-PCR

1.4.1 對抗原陽性的細胞培養液抽提病毒基因組總RNA（QIAGEN，74104）。

1.4.2 利用SuperScript@III反轉錄試劑盒（invitrogen，18080-044）進行反轉錄（RT）獲得病毒cDNA。

1.4.3 基于BVDV 5'UTR設計分型引物[14]，上游引物：5′-CATGCCCATAGTAGGAC；下游引物：5′-CCA TGTGCCATGTACAG。

1.4.4 聚合酶鏈式反應。PCR反應體系50 μL：cDNA模板2 μL，上、下游引物各2.5 μL， PrimeSTAR @Max DNA Polymerase（2×）25 μL，滅菌蒸餾水18 μL。

PCR反應條件：98℃變性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸20 s，30個循環，72℃延伸10 min。反應結束后加入10 μL 6×Loading Buffer，然后將PCR產物在0.8%瓊脂糖凝膠中（5%Goldview核酸染料），120 V電壓電泳30 min，然后在凝膠成像系統中觀察結果并拍照保存，回收280 bp左右片段，膠回收純化。

1.5 測序

將純化的PCR產物采用正反雙向測序，利用Sequencher 4.2分析軟件進行比對分析，獲得不同分離毒株的5′-UTR序列。

1.6 構建系統進化樹

利用Clustal X生物信息軟件對序列進行同源性分析，然后通過Mega5.0構建系統進化樹，分析分離病毒的遺傳演化關系。

2 結果

2.1 血清抗體陽性率

從4個省（區）采集血清樣本共1 332份，其中抗體陽性血清共452份，可疑樣本10份，陽性率為33.93%。但不同省（區）血清的BVDV抗體陽性率存在較大差異，其中云南僅為10%，而內蒙古高達71.43%（表2）。

表2 4個省（區）散養肉牛BVDV Ab陽性率

2.2 血清抗原陽性率

對4個省（區）篩選后的血清樣本進行抗原檢測，共檢出21份抗原陽性血清，17份可疑血清，陽性率為1.58%。其中，新疆血清陽性率最高（表3）。

表3 不同省區散養肉牛BVDV Ag陽性率

2.3 病毒分離

將21份抗原陽性血清和17份可疑血清分別接種單層MDBK細胞后，連續盲傳5代。收獲后通過IDEXX抗原檢測試劑盒進行檢測。陽性樣本進行RT-PCR，送測序。其中，11份新疆血清、1份內蒙血清和1份甘肅血清分離得到病毒，并測序成功。許多抗原陽性樣本病毒分離不成功的原因可能是在運輸和儲存過程中血清被污染導致病毒降解，以致傳代過程中病毒丟失。

2.4 構建系統發育樹

BVDV 5'UTR包含保守序列和高變序列，可以作為BVDV基因分型的依據[15]。從基于5'UTR序列構建的系統進化樹（圖1）可以看出，所有分離毒株均為BVDV-1型。其中，新疆地區散養肉牛中主要流行BVDV-1q（8/11，77.78%）和BVDV-1f（3/11，22.22%）。內蒙地區流行的毒株為BVDV-1m。甘肅地區流行的毒株是一種新的亞型BVDV-1u，該亞型目前還沒得到權威認可，但中國已于2012年、2013年[15]在多個省（市、區）多個物種中分離到此毒株。所有這些分離毒株的同源性達81%—99%。另外，臨床分離的1q、1f、1m和1u與其參考序列的同源性分別為94%—97%、93%—94%、94%—99%和95%—96%。

圖1 基于5′UTR序列（288 bp）利用鄰位法構建的遺傳進化樹

3 討論

從整體血清BVDV抗體陽性率來看，33.93%與DENG等[15]對中國奶牛、肉牛、牦牛和水牛4個不同品種牛調查的58.09%（801/1379，2015年）結果偏低。一方面是由于樣本采集對象和采集時間有差異，另一方面是樣本采集區域的不重疊性（其報道的河南、遼寧和江蘇的陽性率均達到80%以上）。此外，王淑娟等[16]對新疆等11個省（市）的奶牛場血清學調查顯示BVDV抗體總陽性率達69.1%，明顯高于本研究中散養肉牛的33.93%，這表明散養肉牛整體BVDV感染水平較規模化奶牛場較輕。但是，王文等[17]通過對采自新疆10個地區大型牛場和散養戶牛群血清進行BVDV 抗體檢測，結果顯示這些地區牛群中都不同程度的存在BVDV的感染，最高陽性率達100%，最低陽性率為55%，平均陽性率為86.7%，而本調查中新疆地區散養肉牛56.79%的陽性率也在本范圍中。內蒙古作為中國四大牧區之一，是奶制品重要的輸出地，奶牛飼養量在全國居于首列。同時，內蒙與多個省（市）毗鄰，動物跨省交易頻繁，這些都為BVDV的傳播創造了條件。2013年，童欽等[18]對6個集約化奶牛場的509份血清進行了BVDV抗體檢測，平均陽性率為58.35%。2014年，李智勇等[19]對內蒙古地區17個大、中、小奶牛場的2 391份血清樣品進行了BVDV 抗體檢測，平均陽性率為88.9%（2125/2391），14個奶牛場的抗原陽性率為3.6%（8/222）。2015年，姚偉[20]對遼寧地區規模化奶牛場血清型調查結果顯示，BVDV抗體平均陽性率為74.0%。這些數據充分表明內蒙古及周邊地區奶牛BVDV感染已十分嚴重，這無疑對散養肉牛生存環境造成巨大挑戰。甘肅省與以往報道情況一致，BVDV相對較潔凈。云南省整體陽性率較低，但兩批血清樣品BVDV抗體陽性率差異較大。這是由于2014年12月采集的362份樣品來自保山瓦馬和保山舊城，2015年8月采集的178份樣品來自大理云龍，同一省份不同地區散養肉牛BVDV感染情況有所不同。

BVDV作為單股RNA病毒，具有很高的突變率。因此，不同國家甚至同一國家的不同區域BVDV基因型分布有很大差異。在美國主要流行的是BVDV-1a、BVDV-1b和BVDV-2a[21]，歐洲許多國家主要流行1a、1b、1d、1e和1f[22-23]，日本和韓國主要流行BVDV-1b[24-25]，澳大利亞則主要流行BVDV-1c[26]。中國地域遼闊，疾病流行情況十分復雜，BVDV-1和BVDV-2的許多亞型已在不同物種中被發現，并呈現多樣性分布。本研究在新疆地區分離到的病毒主要為BVDV-1q和BVDV-1f亞型，此前高善典等在該地區雙峰駝中分離到BVDV-1q[27]，這說明BVDV-1q已經在新疆地區跨物種傳播。而BVDV-1f首次在該地區檢測到，ZHONG等[28]早前在新疆七個地區商品化肉牛和奶牛中分離到的主要是BVDV-1b和BVDV-1c亞型毒株，通過BLAST比對發現這些序列與斯洛文尼亞分離到的BVDV-1f毒株有很高的同源性，所以不排除BVDV通過貿易或其它途徑實現了跨境傳播，亦可能是原有毒株發生了突變。甘肅地區分離到的是一種新基因亞型BVDV-1u，該型毒株最早于2012年分離于四川成都（NCBI:JQ799141），后DENG等[15]在廣西、湖北、青海等地分離到該亞型毒株。甘肅與四川、青海毗鄰，散養肉牛流動性大且牲畜交易頻繁，所以不難解釋甘肅肉牛中可以分離到BVDV-1u毒株。內蒙地區分離的毒株屬于BVDV-1m亞型，該亞型在中國很多省（市）已經分離到，是目前國內BVDV最流行的亞型之一。DENG等[15,29]分別從內蒙地區的肉牛血清和胎牛血清中分離到過BVDV-1m，同時在內蒙相鄰的黑龍江、吉林、遼寧和寧夏等地[29-30]也都分離到了BVDV-1m毒株，所以可以確定BVDV-1m是內蒙地區的主要流行毒株且該毒株較穩定，變異程度低。

散養肉牛整體BVDV感染水平較規模化奶牛場輕，但不同省（市）差異明顯，要整體布控重點防范。同時，BVDV流行毒株的異質性也應引起重視。在歐洲，主要采取持續感染牛的篩選與淘汰措施凈化牛群[31-32]，而美國則傾向于通過免疫接種控制該疾病[26]。根據中國目前國情，加之成本效益分析，疫苗免疫是首選方法，研制出針對中國BVDV流行毒株的疫苗任務緊迫。此外，也要加強散養肉牛的管理，盡量避免牛羊等動物的混群放養，切斷病毒跨物種傳播的途徑。

4 結論

通過血清學方法檢測發現，雖然4個省（市、自治區）散養肉牛整體抗體陽性率低于國內平均水平，但情況卻不盡相同。內蒙古和新疆抗體高陽性率表明BVDV在這些地區散養肉牛中已經廣泛流行，必須采取適當措施將其危害性降到最低。從基于5′-UTR序列繪制的系統進化樹可以看出，不同地區散養肉牛感染的BVDV基因亞型有所不同。總體看來，BVDV在散養肉牛中的分布呈現多樣性，跨物種、跨地域傳播和高突變性等特點，這些都使疫苗免疫策略面臨嚴峻的挑戰。本試驗研究的意義在于通過對各地區健康散養肉牛的隨機大量采樣、檢測和分析，來客觀評價BVDV在散養肉牛中的流行情況，為更好的制定預防策略提供參考依據。

致謝：感謝金宇保靈、新疆田康、中牧蘭州實驗動物檢驗室及保山生物藥廠的趙麗霞、王焰、馬愛榮和彭正啟在本次試驗采樣過程中提供的諸多幫助！

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（責任編輯 林鑒非）

Prevalence Study and Phylogenetic Analysis of Bovine Viral Diarrhea Virus in Free-roaming Beef Cattle in Western China

CHEN Rui, FAN Xue-zheng, ZHU Yuan-yuan, ZOU Xing-qi, XU Lu, ZHANG Qian-yi, WANG Qin, ZHAO Qi-zu

(China Institute of Veterinary Drugs Control, Beijing 100081)

【Objective】Bovine viral diarrhea virus(BVDV) is commonly recognized as an important pathogen for the cattle and causes significant economic losses in the cattle industry worldwide. To assess the overall prevalence of BVDV in Chinese free- roaming beeves, the free-roaming beeves in the Western China were used in the present study by the methods of serological and bioinformatic analysis. Then, the genetic diversity of BVDV was analyzed. This study will provide a theoretical basis for the development of reasonable prevention and control, and for the vaccine development. 【Method】 A total of 1 332 sera were collected in Yunnan, Xinjiang, Gansu and Inner Mongolia from 2014 to 2015. These samples were analyzed by the commercial antibody (Ab) detection kits, and the Ab positive rate of BVDV in various regions were summarized up. Meanwhile, the positive or suspicious samples, whose S/P were less than 60%, were further detected by the Ag detection kit. Then, to isolate BVDV, the positive samples were inoculated into the MDBK cells and passaged by five generations. In addition, the primer designed based on the 5′-UTR of BVDV which has low frequency variability was used to analyze the genetic diversity of BVDV. Then the nucleotide sequences were analyzed by the bioinformatic softwares, including Sequencher4.2, BLAST, ClustalX and MEGA5.2. Finally, the genotypes and phylogenetic analysis of sequenced BVDV were confirmed based on the primers.【Result】Results showed that the average Ab positive rate of BVDV was 33.93% in the four detected provincial regions. Among them, that in the Inner Mongolia was the highest (71.43%), that in Xinjiang taking the second place (57.69%), that in Gansu was the third (16.54%) and that in Yunnan was the lowest (10.0%). The average Ag positive rate of BVDV was only 1.58%, that in Xinjiang was the highest. In this study, a total of 13 BVDV strains were isolated, they were named as Gansu 120, Mongolia 1369, Yilihuoqing 12953, Yillihuoqing 12960, Yilihuoqing 12981, Bozhoujinghe 13001, Bozhoujinghe 13023, Bozhoujinghe 13033, Xinjiangqitai 13041, Xinjiangqitai 13042, Xinjiangqitai 13191, Xinjiangqitai 13220, and Xinjiangqitai 13251, respectively. The polygenetic analysis indicated that these isolates could be mainly classified into four subtypes: BVDV-1q and BVDV-1f (isolated in Xinjiang), BVDV-1m (isolated in Inner Mongolia) and BVDV-1u which was a new subtype isolated in Gansu.【Conclusion】The serological analysis indicated that, although the free-range beef cattle overall Ab positive rate in the four provinces (autonomous regions) was lower than the national average, their situation was different. The high Ab positive rate of Inner Mongolia and Xinjiang indicated that BVDV is prevalent in the free-roaming beeves, and it is essential to minimize the damage by valuable controlling methods. The phylogenetic tree based on 5′-UTR sequence indicated that various genotypes of BVDV were existed in various regions. Overall, the diversity, cross-species transmission, cross-regional transmission and high mutation rate of BVDV make a great challenge for the immunity of vaccine. The significance of this study is to evaluate the prevalence of BVDV in free-range beef cattle through the method of healthy cattle random sample detection and analysis in various regions, and provide the reference for the prevention strategies.

bovine viral diarrhea virus (BVDV); free-roaming beef cattle; enzyme linked immunosorbent assay (ELISA); positive rate; genotyping

2015-12-31；接受日期：2016-06-05

農業部公益性行業（農業）科研專項（P2015003086）

陳銳，Tel：17090086568；E-mail：chenrui2635@163.com。通信作者趙啟祖，Tel：13810789573；E-mail：zhaoqizu@163.com