固定化半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的研究

劉鑫龍王立暉 湯衛華 潘志恒 程秀瑋 孫勇民

（天津現代職業技術學院，天津300350）

固定化半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的研究

劉鑫龍*王立暉 湯衛華 潘志恒 程秀瑋 孫勇民

（天津現代職業技術學院，天津300350）

低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，GOS）是一種具有天然屬性的功能性低聚糖，是人體腸道中有益菌群極好的營養源和有效的增殖因子，對平衡腸道中的有益菌群，保障人體的發育及提高免疫力具有巨大的價值。同時，由于低聚牛乳糖不被人體胃酸、胃酶降解，難以被小腸吸收，又具有糖類的共有屬性和較好的口感，因而被廣泛用于制作高血脂、肥胖、糖尿病人的無熱量食品，成為提供甜味的主要原料之一。此外，低聚半乳糖同蛋白質共熱會發生美拉德反應，可以用于特殊性質的食品如面包、糕點等的加工，具有廣闊的開發前景。

目前，低聚半乳糖的的合成主要有3種方式：天然高聚物的水解（酸法和酶法），糖苷酶的催化合成，化學合成法。化學合成法目前只在實驗室研究中使用，不具有工業化前景。酸法降解高聚糖雖然可以獲得較高產率的半乳糖，但因為副反應較多，使產物提純工序的難度加大，應用受到了很大的限制。因此在低聚半乳糖工業化的生產中主要采用酶法合成，尤以微生物來源的β-半乳糖苷酶為主。盡管直接以β-半乳糖苷酶催化合成，反應條件溫和，產率較高，但游離酶因為只能在水溶液中使用，穩定性差，不利于連續反應，回收困難，重復利用性差等原因，限制了其廣泛應用，而將酶固定化是解決這些問題的有效方法之一。本課題組采用殼聚糖為載體，戊二醛為交聯劑固定化β-半乳糖苷酶，酶的活力回收率達70.5%。同時，固定化酶具有良好的儲存和操作穩定性，在儲存4周后，保持88.5%的酶活力；重復操作5次后，保持67.3%的酶活力，具有良好的應用前景。本文將在此基礎上研究以β-半乳糖苷酶作為催化劑，催化合成低聚半乳糖過程中各反應因素對產物得率的影響，包括底物濃度、酶用量、溫度、pH、離子添加劑等，篩選最優反應條件。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

β-半乳糖苷酶，來源于米曲霉，13.4 U/mg，Sigma公司；殼聚糖，脫乙酰度≥90%，深圳市中發源生物科技有限公司；乳糖，化學純，天津市光復精細化工研究所；戊二醛，分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

UV-5500（PC）紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；HNY2012C恒溫搖床培養箱，上海百典儀器有限公司；HH-1數顯恒溫水浴鍋，嘉興市中新醫療儀器有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1殼聚糖-戊二醛固定化酶的制備

用乙酸溶液配制體積濃度4%的殼聚糖（分子量為3×105）溶液，真空脫泡后逐滴滴入到4 mol/L的NaOH與甲醇的混合液（體積比為3∶1）中，過濾并用蒸餾水洗滌和磷酸緩沖液浸泡12 h，晾干得到殼聚糖微球。將其加入到戊二醛（10 g/L）中，常溫振蕩反應1 h后，過濾并用磷酸緩沖液洗滌。在4 ℃條件下，將洗滌后的殼聚糖微球加入到β-半乳糖苷酶溶液反應12 h。離心分離并用磷酸緩沖液洗滌沉淀，冷凍干燥后即可得到固定化的半乳糖苷酶。

1.2.2低聚半乳糖的合成

用pH7.5的0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液配制一定濃度的乳糖溶液20 mL，置于50 mL 錐形瓶中，加入一定量的β-半乳糖苷酶酶液，置于一定溫度的恒溫水浴搖床中160 r/min反應一段時間。

1.2.3分析方法

取250 μL樣品稀釋40 倍，用孔徑0.45 μm濾膜過濾后進液相色譜檢測，并根據預先繪制的乳糖、葡萄糖、半乳糖（色譜純）的標準曲線計算得到低聚半乳糖的得率。

檢測條件： Aminex HPX-87H 色譜柱，流動相為濃度0.05 mol/L的H2SO4，流速0.6 mL/min，柱溫65 ℃，示差檢測器，進樣量20 μL。

2　結果與討論

2.1乳糖質量濃度的選擇

底物乳糖質量濃度的高低不僅影響低聚半乳糖最終產量，而且對反應速率也有顯著影響。分別以20 mL質量濃度為25%、35%、40%、45%、50%、55%的乳糖溶液為底物，在40 ℃、pH7.0 、酶量為240 g/L的條件下反應，乳糖質量濃度對GOS的產率的影響如圖1所示。

圖1　乳糖質量濃度對GOS產率的影響

由圖1可知，在不同底物濃度下反應4 h后，GOS產率達到最大值。隨著乳糖溶液質量濃度的增大，GOS的生成速率也在不斷增加，反應4 h后達到反應平衡。其中底物濃度為50%時，GOS最大產率為49%。進一步增加底物濃度，產物產率沒有明顯變化。這個現象可以做出如下解釋：①乳糖分子在β-半乳糖苷酶作用下生成半乳糖基，水和糖類分子均可作為半乳糖基的受體分別生成半乳糖和低聚半乳糖，兩者作為受體的幾率基本相同，而增加初始乳糖質量濃度從另一方面而言也降低了反應體系中水的含量，促進了GOS的合成；②乳糖質量濃度增大，可增加乳糖作為受體的幾率，這是乳糖質量濃度影響GOS產率的主要原因。盡管乳糖價格低廉，但綜合分析成本，選擇質量濃度50%的乳糖為最佳底物濃度。

2.2酶用量的選擇

以50%的乳糖為底物濃度，分別以120 g/L、240 g/L、480 g/L、640 g/L、800 g/L的酶溶液為催化劑，在40 ℃、pH7.0條件下反應，考察酶用量對GOS產率的影響，結果見圖2。由圖2可知，加酶量越大，乳糖的產率越高。當酶濃度為640 g/L時，最大產物產率為60.2%。進一步增加酶用量，并不會使產率發生明顯變化。這是因為當加酶量較小時，酶催化能力不足，增加酶用量能使更多的底物分子接觸到吸附的酶分子的活性中心，提高反應速率和產物產率。這種在大量酶用量條件出現產物產率趨于平衡的現象很有代表性，與以前的研究報道完全相符。鑒于酶制劑價格較高，選擇640 g/L作為最適酶液濃度。

圖2　酶用量對GOS產率的影響

2.3反應溫度和反應pH的選擇

以50%的乳糖為底物濃度，640 g/L為酶液濃度，先后改變反應體系的pH和溫度，從而測定其對GOS產率的影響，結果如圖3和圖4所示。結果表明，固定化β-半乳糖苷酶的轉糖苷活性和水解活性的最適溫度均為40 ℃，最適反應pH為6.5，且溫度、pH 變化對酶活影響顯著，是影響β-半乳糖苷酶酶活的主要因素。這主要是因為殼聚糖載體表面的潤濕性促使酶分子表面電荷發生改變，促使弱堿性酶最適pH變為偏酸性。此外，反應溫度對于低聚半乳糖得率也有影響，通常提高溫度能夠促進低聚半乳糖的合成，但溫度如果太高也增加了酶失活的可能性，導致GOS產率降低。

圖3　pH對GOS產率的影響

圖4　溫度對GOS產率的影響

2.5離子添加劑的選擇

金屬離子能夠通過可以激活或抑制酶的活性位點影響酶的催化性能，不同金屬離子對固定化半乳糖苷酶的活性存在影響。試驗結果表明，濃度為2 mmol/L時，Mg2+的存在使低聚半乳糖的產率提高了10%以上，達到70.5%；其他金屬離子因為會破壞酶蛋白的構象導致酶失活，促使GOS產率降低。這對于提高生產效率和設備利用率都具有重要的現實意義。

2.6催化劑的重復利用性

在最優條件下，測定固定化半乳糖苷酶的重復使用穩定性。將反應后的固定化酶用pH6.5的緩沖溶液沖洗干凈后，作為催化劑重復下一輪試驗，結果如圖5所示。在重復使用第2次時出現GOS產率最大值（73%），原因可能是經過浸泡，殼聚糖的通透性和表面潤濕性得到提高，底物乳糖更容易透過與乳糖酶接觸，同時酶分子的活性中心得到激活展開，從而提高了反應速率。在固定化酶重復使用7次后，產物產率下降為64.9%，展現了良好的穩定性。

圖5　固定化酶的重復使用性

3　總結

隨著社會對功能性食品、保健食品要求的不斷提高，低聚半乳糖的重要性也逐漸得到更多的人重視。本文研究了以殼聚糖吸附與戊二醛交聯固定化的半乳糖苷酶為催化劑合成低聚半乳糖的過程，并對反應條件進行了單因素優化。試驗結果表明，固定化半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的最佳反應條件為：以質量濃度50%的乳糖為底物，溶液pH 值為6.5，反應溫度為40 ℃，體系中加入2 mmol/L的Mg2+，640 g/L的酶用量，反應4 h后，低聚半乳糖的產率為71.5%。在重復使用7次后，催化得到的GOS產率為64.9%，展現了良好的穩定性。

［1］張曉萍，段鋼. 功能性低聚糖酶法制備研究進展［J］. 2011，37（4）：159-165.

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Study on immobilized galactosidase enzymatic synthesis of galactooligosaccharides

LIU Xinlong*WANG Lihui TANG Weihua PAN Zhiheng CHENG Xiuwei SUN Yongmin
（Tianjin modern vocational and technical college，Tianjin 300350，China）

隨著社會對功能性食品、保健食品要求的不斷提高，低聚半乳糖的重要性也逐漸得到更多人的重視。研究了以殼聚糖吸附與戊二醛交聯固定化的半乳糖苷酶為催化劑合成低聚半乳糖的過程，并對反應條件進行了單因素優化。試驗結果表明，最佳反應條件為：質量濃度50%的乳糖為底物，溶液pH 值6.5，反應溫度40 ℃，體系中加入2 mmol/L的Mg2+，640 g/L的酶用量，反應4 h后，低聚半乳糖的產率為71.5%。在重復使用7次后，催化得到的GOS產率仍為64.9%，展現了良好的穩定性。

β-半乳糖苷酶；殼聚糖；交聯法；低聚半乳糖

As society continues to raise the requirements for functional foods，the importance of galactooligosaccharides gradually get more people's attention. Study on the adsorption chitosan and glutaraldehyde cross-linked immobilized galactosidase synthesis catalyst for the oligomerization process galactose，and the reaction conditions were optimized. The test results showed that the optimum reaction conditions were： mass concentration of 50% lactose as a substrate，the pH value of 6.5，the reaction temperature of 40 ℃，the system was added 2 mmol/L of Mg2+，the enzyme dosage of 640 g/L，the reaction after 4 h ，galactooligosaccharides yield of 71.5%. After repeated 7 times，GOS producing catalytic obtained was still 64.9%，showing good stability.

β-galactosidase；chitosan；crosslinking；galactooligosaccharide

TS245.5

A

1673-6044（2016）01-0020-03

10.3969/j.issn.1673-6044.2016.01.007

* 劉鑫龍，男，1988年出生，2014年畢業于河北工業大學生物工程專業，助教。

2015-12-22