天冬氨酸激酶代謝調控的研究進展

楊宇亭，閔偉紅

（吉林農業大學食品科學與工程學院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118）

天冬氨酸激酶代謝調控的研究進展

楊宇亭，閔偉紅*

（吉林農業大學食品科學與工程學院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118）

在微生物發酵合成天冬氨酸族氨基酸的代謝途徑中，天冬氨酸激酶（aspartokinase，AK）是限制碳源和氮源流速的限速酶，是決定能否獲得高產天冬氨酸族氨基酸的關鍵之一。本文介紹了AK的重要性、不同來源AK的整體結構、效應結合位點的特點和調控機制研究進展，并對AK代謝調控的發展做出展望，為進一步明確AK代謝調控機制，促進天冬氨酸族氨基酸產業化發展提供參考和依據。

天冬氨酸激酶；合成途徑；效應結合位點；調控機制

氨基酸是含氮化合物和蛋白質中關鍵的化學成分，它們的代謝是植物、微生物生長和發育的基礎[1]。對氨基酸和氮代謝機理的研究能夠提高我們對于植物、微生物中代謝途徑方面的理解[2]。氨基酸生物合成途徑在植物和微生物體內普遍存在（圖1）。其中，天冬氨酸家族的氨基酸合成途徑中，可合成4 種必需氨基酸：異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸[3]。這4 種必需氨基酸在動物飼料和人類食物中極具營養價值[4]。氨基酸代謝途徑是由大量的關鍵酶和中間體參與形成的一個復雜的調控網絡[5]。其中一些關鍵酶如天冬氨酸激酶（aspartokinase，AK，EC2.7.2.4）、高絲氨酸脫氫酶（homoserine dehydrogenase，HSDH，EC1.1.1.3）、二氫吡啶二羧酸合成酶（EC4.1.2.52）和蘇氨酸合成酶（EC4.2.99.2）已在植物、微生物中得到分離、純化和表征[6]。這幾種酶大多數已被證明是許多基因調控的同工酶形式[7-8]。在這些酶當中，AK是在結構和變構性質方面最具代表性的同工酶。

圖1 天冬氨酸族氨基酸生物合成途徑[9]Fig.1 Biosynthesis pathway of aspartic acid family amino acids[9]

1 AK在天冬氨酸族氨基酸合成途徑中的作用

由于天冬氨酸族氨基酸合成途徑在人體內不存在，因此人和哺乳動物只能通過飲食獲取異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸4 種必需氨基酸。所以通過一定手段達到植物和微生物中必需氨基酸高產具有重大意義。AK是天冬氨酸族氨基酸合成途徑中第一個關鍵酶，并在該合成途徑中起到至關重要的作用。雖然在不同種生物體，AK以不同形式存在，但其在天冬氨酸族氨基酸合成途徑中，都將三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的磷酸基團轉移到天冬氨酸上，使天冬氨酸磷酸化合成天冬氨酸β半醛。在合成終產物時，AK會受到終產物的反饋抑制控制。因此，解除終產物對AK的反饋抑制，有助于提高AK的活性，使整個通路更加順暢，提高必需氨基酸的產量。

AK在植物、微生物代謝合成途徑中普遍存在。在詹氏甲烷球菌中，以天冬氨酸為底物的代謝途徑中，AK是以只對蘇氨酸敏感的同工酶形式存在[10]。在一些細菌中，如谷氨酸棒桿菌和集胞藻，這兩種菌種中AK在合成途徑中都以對蘇氨酸（Thr）和賴氨酸（Lys）敏感的形式存在。在大腸桿菌和擬南芥中，AK致力于蘇氨酸、賴氨酸和蛋氨酸的合成[11-12]。然而，變構酶的調控網絡二者之間是完全不同。在大腸桿菌中，一個賴氨酸敏感的單官能團的AK（AKIII）[13]和蘇氨酸敏感的雙功能團AK-HSDH I參與變構控制。擬南芥中存在3 種單官能團形式AK（AK1、AK2 和AK3），還有兩個雙功能團AKHSDH（I、II）[14]。

2 AK結構分類

通過對不同生物體中AK結構和生化特性研究表明，無論AK變構調節的多樣性還是協同反饋作用，都與其分子結構有重要關系。AK晶體結構的分類方法有兩種。

第一種分類方法根據亞基數量分為三類[15]（表1）。第一類（I類型）包含同源二聚體酶和同源四聚體酶，它們都含有一個催化結構域和兩個ACT結構域（圖2a、b）。Kotaka等[16]描述了大腸桿菌Escherichia coli AKIII兩種狀態下的晶體結構。一是不活躍的帶有反饋抑制劑賴氨酸的T狀態。二是結合天冬氨酸和腺苷二磷酸（adenosine diphospate，ADP）的R狀態。并分析了其中起到重要作用的ACT結構域。在2014年，Manjasetty等[17]對丙酮丁醇梭菌天門冬氨酸激酶的晶體結構中結合位點、催化和調控機理進行分析，發現該AK是一種重要的變構酶，并對醫藥方面研究有重要作用。第二類（II類型）是α2β2型異四聚體酶，其每個α亞基內有一個催化結構域和兩個ACT結構域，每個β亞基含有兩個ACT結構域。Kato等[18]為了闡明AK的反饋抑制調控機制，通過同源建模的方法構建了一種新型的AK，它是以具有α2β2型四聚體結構的枯草芽孢桿菌AKII和黃棲熱菌AK為模型構建的。Yoshida等[19]確定了谷氨酸棒桿菌AK（Corynebacterium glutamicum，AKcg）的3 種形式：一種是與賴氨酸和蘇氨酸抑制絡合形式；一種是僅與蘇氨酸復合的活性形式；一種是與兩個賴氨酸和一個蘇氨酸反饋抑制抗性突變體（S301F）復合形式。AKcg就是典型的第二類AK，其中α和β亞基都含有ACT1-ACT2結構域。與第一類AK不同的是，每個α亞基上的ACT1與β亞基上的ACT2相互作用，形成8 段折疊和4 段螺旋[20]。第三類（III類型）是同源二聚體酶，結構代表是集胞藻（Synechocystis AK，AKsy）[21]。與第一類不同的是，其每個亞基含有一個催化結構域和4 個ACT結構域。Yoshida等[22]確定了嗜熱菌中AK蘇氨酸調節亞基的晶體結構，在缺少蘇氨酸的情況下，嗜熱菌比其他菌種更具熱穩定性。由于大腸桿菌天冬氨酸激酶（Escherichia coli AK，AKec）和詹氏甲烷球菌天冬氨酸激酶（Methanococcus jannaschii AK，AKmj）的四聚化使催化區域間催化能力比AKcg和AKsy催化區域催化能力減弱[23-24]。

第二種分類方法將AK根據亞基同源性分為AKα和AKβ兩類（表1）。Robin等[21]對藍藻中AK晶體結構AKβ具體分析，證明其是一種新型的二聚體結構。AKα與AKβ有顯著區別。顯著差異為AKβ催化結構域的N-末端序缺少約60 個氨基酸殘基的兩個螺旋。由于缺少這段氨基酸序列，使AKβ亞基催化結構域的α2和α3螺旋間相互作用形成二聚體結構。

圖2 3 種類型AK晶體結構Fig.2 Crystal structures of three classes of AK

表1 不同菌種中天冬氨酸激酶的數量、分類及晶體結構Table 1 Classification， domain organization and number of AKs

3 效應結合位點的形成及特點

AK的變構效應是由包含2 個或4 個ACT的調控域所形成。ACT結構域是調控域最關鍵的結構。該結構最初發現存在于3 種變構酶（AK（A）、分支酸變位酶（C）和預本酸脫氫酶（T））中[25]。

I類型AK的變構效應結合位點由相同ACT結構域之間的相互作用產生，并且能結合兩種相同的氨基酸。AKat和AKec的晶體結構顯示，兩個ACT1相互作用產生兩個等效的賴氨酸結合位點[26]。而在AKmj中，兩個ACT2的相互作用產生兩個相等的蘇氨酸結合位點[27]。因此，AKI只有兩個ACT域在氨基酸結合時有功效，另外兩個只能起到結構作用。

II類型AK是通過使兩個不同氨基酸結合不同的ACT域之間的相互作用產生的結合位點[28]。在AKcg中，每個ACT1結合β亞基產生一個賴氨酸結合位點，ACT2與α亞基相結合產生蘇氨酸結合位點。然而，每一個α亞基與ACT1結合或者β亞基與ACT2相結合僅生成一個蘇氨酸結合位點。在這種情況下，賴氨酸結合位點是空置的。

III類型AK是兩個不同的ACT域（ACT1與ACT4和ACT2與ACT3）的相互作用在效應結合口袋處產生兩個非等價的結合位點。

4 AK的調控機制

無論是在植物、微生物中天冬氨酸激酶都具有復雜的變構調控機制[28]。例如，在植物擬南芥中有5 種AK，其中3 個是受賴氨酸和S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）反饋抑制的單官能團AK，另外兩個AK是結合有HSDH雙官能團并受由蘇氨酸和亮氨酸的反饋抑制[29]。在大腸桿菌中含有3 個AK同工酶，其中2 種屬于雙官能AK，另一種屬于單官能團AK。然而，只有其中的兩個涉及變構控制。在枯草芽孢桿菌也發現3 種二聚體AK[30]。詹氏甲烷球菌和嗜熱菌僅包含一個AK且能合成蘇氨酸[31]，而在集胞藻屬和谷氨酸棒桿菌的途徑導致兩個蘇氨酸和賴氨酸的合成[32]。

在結構上看天冬氨酸激酶具有復雜的調控機制，AK是一個四聚體，由兩個α亞基和兩個β亞基構成，形成α2β2四聚體結構，并且由等物質的量的α和β亞基組成。α亞基包含兩個結構域，即N末端的催化結構域和C末端的調控結構域。β亞基與α亞基的調控結構域相同，由兩個ACT結構域基序組成，ACT結構域是天冬氨酸激酶的別構劑結合位點，ACT結構域含有兩個蘇氨酸結合位點，一個賴氨酸結合位點。α亞基與AK的催化活性和調控功能有關，而β亞基對AK的穩定性起重要作用。

最近，有研究對不同類型的AK（單官能團或雙官能團）和它們的親緣關系的進化進行了描述[17]。棒桿菌AK變構調節過程中，不僅涉及下游代謝產物中的天冬氨酸衍生的氨基酸，其中，一些天冬氨酸激酶衍化的次級代謝產物為氨基酸的合成提供了前體。這表明，在氨基酸生物合成途徑中天冬氨酸激酶是用于平衡不同植物的相對通量的一個重要的檢查點。

5 編碼AK的基因克隆

Shaul等[33]首次通過轉基因手段，使兩種煙草植物產生脫敏的AK，并在大腸桿菌中表達，發現兩種轉基因植物蘇氨酸產量過剩。實現了通過潛在的基因工程手段增加氨基酸在植物體內的積累。Ferreira等[34]從不成熟的種子中純化得到AK和HSDH，并證明了這兩種酶在種子中被蘇氨酸和賴氨酸協同抑制。Curien等[35]對AKat進一步劃分，發現擬南芥單官能團AK基因組包含3 個基因。其中AK2和AK3僅由賴氨酸抑制，而AK1由賴氨酸和SAM協同抑制。同時還分析了3 種AK基因分別與抑制劑的抑制機制。

6 AK的定點突變及酶抑制機制

定點突變技術是在傳統聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術的基礎上，利用軟件分析酶的三維晶體結構，并針對酶的關鍵位點設計引物，在DNA擴增的過程中通過改變其組成和順序，以便達到對酶的氨基酸序列改造的目的。定點突變技術的應用與發展為AK抑制機制的研究開辟了道路。定點突變技術不僅可以改變基因序列中特定的核苷酸，還可以對氨基酸代謝中酶功能區域的基因序列進行定點突變，從而產生一系列突變子。

Bareich等[36]首次利用定點突變技術手段，分析了釀酒酵母中天冬氨酸激酶基因序列中的幾種保守殘基參與酶促反應的重要作用，尤其K18和H292對于研究天冬氨酸激酶活性有重要意義。2003年Marco-Marín等[37]對大腸桿菌中AKIII的關鍵氨基酸殘基進行定點突變，通過三維建模分析了C末端結構域是結合賴氨酸并對其調控的關鍵區域。

2006年Yoshida等[38]利用定點突變等技術分析了嗜熱菌（Thermus thermophilus）中AK與蘇氨酸反饋抑制機制。并在蘇氨酸存在的情況下進行結晶。Chen Zhen等[32]綜合分子動力學和協同進化對天冬氨酸激酶的變構抑制進行分析為氨基酸生產做出可靠指標預測。Malothu等[39]攜帶天冬氨酸激酶基因的質粒PBR322在谷氨酸棒桿菌中表達，發酵96 h后，賴氨酸產量達到3.5 mg/mL，比普通菌種發酵提高了0.6 mg/mL。

近幾年吉林農業大學食品科學與工程學院發酵工程實驗室通過定點突變技術和高通量篩選等生物信息學手段對北京棒桿菌天冬氨酸激酶進行深入研究。通過對三維晶體結構分析了與Lys、Thr抑制劑附近的關鍵殘基，選定了8 個位點進行飽和定點突變，獲得高活力突變株25 株（表2）。其中，任軍[40]對北京棒桿菌AK高活力突變體菌株G359K和V360N進行詳細酶學性質表征，并證明解除了Lys對AK的抑制作用。李慧穎[9]對北京棒桿菌AK中D274進行飽和突變，并對突變體進行酶學性質表征，其中D274Y被證明解除Thr對AK的抑制作用。2014年，郭永玲[41]對北京棒桿AK的T361位點和A362進行飽和定點突變，并對突變株進行高通量篩選，得到酶活力高的突變株，其中T361N、A362I解除了Lys抑制作用，并且酶活力分別提高47.99 倍和34.6 倍。2014年，朱運明等[42]對北京棒桿菌AK的Gly377位點進行突變，并篩選獲得高活力突變體G377F，并對突變體進行酶學性質進行表征，其解除Lys抑制作用，酶活力提高17.05 倍。李慧穎等[43]成功構建AK突變體R169H。該突變體是受Lys和Thr反饋抑制調節，經分析突變體中R169與E92間氫鍵消失，能夠影響亞基間聚合度，減弱代謝產物對AK的反饋抑制作用，從而使R169H中AK的酶活力提高4.71 倍。

表2 關于北京棒桿菌AK高活力突變株及解除抑制劑抑制作用的報道Table 2 Reports on mutation of Corynebacterium pekinense for high AK activity and inactivation of AK inhibitors

7 結 語

AK具有多樣性，并且都具有變構調節的特點，這一特點對提高必需氨基酸代謝生產具有重要的意義。目前蘇氨酸、賴氨酸已經工業化生產，而甲硫氨酸的生產還沒有產業化。因此，在植物和微生物中，天冬氨酸激酶復雜的調控機制的研究對于分析天冬氨酸族氨基酸代謝途徑以達到必需氨基酸的高產有舉足輕重的作用[44]。

在不同種天冬氨酸激酶中，不同組織的ACT結構域之間的相互作用影響著AK中催化結構域和調節結構域的功能[46]。這就可以解釋為什么初始結構導致酶的抑制作用不同。因此，通過改變酶的構象解除抑制劑對酶的抑制作用是勢在必行的。在后基因組時代，通過將高通量篩選、定點突變等新型分子生物學技術和蛋白質工程新型理論設計應用到氨基酸生產途徑中，改造發酵途徑從而提高氨基酸產量。對某個己知基因特定堿基進行定點改變、缺失或者插入，可以改變對應的氨基酸序列和蛋白質結構，對突變基因的表達產物進行研究有助于人類了解蛋白質結構和功能的關系。這種技術和理論已經在實驗室有了系統的實驗和成果。生物學技術已經取得了很大的進步，在氨基酸生產菌種改良上也有了一些應用。但它的深入發展還需要能充分整合各組學信息的新方法和更準確分析模擬代謝和調控網絡的新算法[47]。

吉林農業大學食品科學與工程學院發酵工程實驗室根據生物學信息基礎和定點突變及其高通量篩選等技術，對北京棒桿菌AK進行異源表達、純化、酶學性質的研究，多方位分析其抑制劑附近調控位點的抑制機制對酶活性的影響。AK的調控是復雜的，具有龐大的調控網絡，其中不僅有直接調控的位點，遠程調控位點也有著重要的作用。因此將繼續進行遠程調控位點的突變，對AK與抑制劑的抑制機制進一步研究。對AK的研究除了研究基因的結構與功能關系之外，還能夠通過改變特定的氨基酸獲得突變蛋白質，研究蛋白質的結構與功能，從微觀水平上闡明正常狀態下基因的調控機理、疾病病因和機理。

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Review of Research on Metabolic Regulation of Aspartokinase

YANG Yuting, MIN Weihong*
(National Engineering Laboratory on Wheat and Corn Further Processing, College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Aspartate kinase (aspartokinase, AK) is a rate-limiting enzyme controlling the carbon and nitrogen flux into the biosynthesis pathways of amino acids of the aspartic acid family in microorganisms. It is a key enzyme to determine the ability to obtain aromatic aspartic amino acids. This article describes recent progress in understanding the importance of aspartatekinase, the general structure of aspartatekinases from different species, features of their binding sites and their regulatory mechanisms. Moreover, future research trends in this area are foreseen. The aim of this review is to provide further understanding of the mechanism of metabolic regulation of aspartatekinase and accordingly promote the industrial development of aspartic acid family amino acids.

aspartatekinase; biosynthetic pathway; binding sites; regulatory mechanisms

10.7506/spkx1002-6630-201607048

Q71

A

1002-6630（2016）07-0270-06

楊宇亭, 閔偉紅. 天冬氨酸激酶代謝調控的研究進展[J]. 食品科學, 2016, 37(7): 270-275. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607048. http://www.spkx.net.cn

YANG Yuting, MIN Weihong. Review of research on metabolic regulation of aspartokinase[J]. Food Science, 2016, 37(7): 270-275. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607048. http://www.spkx.net.cn

2015-07-24

吉林省自然科學基金項目（20130101139JC）

楊宇亭（1991—），女，碩士研究生，研究方向為發酵微生物的選育與代謝調控。E-mail：15948022712@163.com

*通信作者：閔偉紅（1971—），女，教授，博士，研究方向為發酵工程、糧食科學與深加工技術。E-mail：minwh2000@163.com