紫薯花青素的提取及其在VC含量測定中的應用

郭彩華，盧珍華，伍 菱，陳昭華，陳慶綢，熊何健*

（集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021）

紫薯花青素的提取及其在VC含量測定中的應用

郭彩華，盧珍華，伍 菱，陳昭華，陳慶綢，熊何健*

（集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021）

從紫薯中提取花青素，該花青素在530 nm波長處有特征吸收峰，分子質量范圍在850～1 020 u之間。利用紫薯花青素替代GB/T 6195—1986《水果、蔬菜維生素C含量測定法（2，6-二氯靛酚測定法）》測定夏橙和西紅柿中VC含量。結果表明：夏橙和西紅柿中VC的含量分別為（25.33±0.34）、（20.41±0.32） mg/100 g；紫薯花青素法的加標回收率為95.4%～98.6%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.18%～1.22%；2，6-二氯靛酚法的加標回收率為96.5%～98.7%，RSD為0.86%～0.88%。建立的利用紫薯花青素替代GB/T 6195—1986中2，6-二氯靛酚測定水果、蔬菜中VC含量的方法具有安全、廉價的特點，其準確度與2，6-二氯靛酚法滴定法相當。

紫薯；花青素；GB/T 6195—1986；2，6-二氯靛酚；VC

紫薯（Ipomoea batatas）又稱黑薯，薯肉呈紫色至深紫色，富含淀粉、蛋白質、果膠、維生素及多種礦物質，同時還含有花青素。一般成熟紫薯中花青素類色素的含量為0.2%～0.8%，有些品種能高達1.2%。國內外對紫薯花青素的提取以及生理活性進行了一系列的研究，有關此類色素的分子結構和組分分析的研究也取得了一定的進展［1-6］。紫薯色素易溶于水，屬非脂溶性色素［7］，其存在形式是花色苷，花色苷是花青素（花色素）與糖以糖苷鍵結合而成的一類化合物，紫薯花色苷色素中的主體結構吡喃環上有一個四價氧原子［8-12］。方夏等［13］報道大紅月季花色素可以代替中性紅指示劑在酸堿滴定中充當酸堿指示劑，但關于紫薯花青素充當氧化劑的應用研究還沒見報道。本實驗探討從紫薯中提取制備花青素的方法，研究花青素的基本性質，分析其代替GB/T 6195—1986《水果、蔬菜維生素C含量測定法（2，6-二氯靛酚滴定法）》［14］中所用的2，6-二氯靛酚定量測定VC的效果。2，6-二氯靛酚為有機合成色素，價格昂貴，且會刺激人體的眼睛、呼吸道和皮膚。而紫薯花青素具有資源豐富、安全性好的優點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫薯 廈門市集美區新華都超市，購買時間為3—7月，個體質量為（250±50） g。

夏橙、西紅柿 廈門市集美區菜市場，購買時間為5—7月。夏橙個體質量為（200±20） g；西紅柿個體質量為（180±10） g。

2，6-二氯靛酚、細胞色素c 美國Sigma公司；Sephedex G-25凝膠 美國GE Healthcare公司；藍葡聚糖2000 美國Pharmacia公司；抗壞血酸（純度≥99.7%）國藥集團化學試劑有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

CARY50紫外-可見分光光度計 美國Varian公司；Milli-Qcentury超純水系統 美國Millipore公司；SY-1-2型電熱式恒溫水浴鍋（箱） 天津歐諾儀器股份有限公司；SG260-A榨汁攪拌器 順德市方勝電器實業有限公司；UV-5200紫外-可見分光光度計 廈門柏嘉生物科技有限公司；DHG-9146A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；pH計 奧豪斯儀器（上海）有限公司；湘儀 L-550離心機 廈門億辰科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紫薯花青素的提取工藝流程

紫薯洗凈后削皮、切塊、粉碎，加入體積分數0.2% HCl溶液浸泡，先浸泡1 h再攪拌提取2 h，于4 000 r/min離心5 min，取上清液，即為色素粗提液，再濃縮處理，于80 ℃水浴12 h，所得濃縮液過Sephadex G-25柱進行純化，收集過濾液，再次濃縮處理，于80 ℃條件下水浴12 h，最后于烘箱中60 ℃干燥3 h，獲得紫薯花青素制品。

1.3.2 紫薯花青素分子質量分布的測定

采用分子排阻色譜法［15-16］測定紫薯花青素分子質量分布，分別將已知分子質量的藍葡聚糖2000（2 000 000 u）、細胞色素c（13 000 u）、VB12（1 350 u）、溴酚藍（670 u）、考馬斯亮藍G250（854 u）溶解于超純水中，各自的質量濃度為4.0 g/L。上Sephadex G-25凝膠柱（1.0 cm×25 cm），以超純水洗脫，上樣量0.5 mL，流速0.5 mL/min，自動部分收集儀收集洗脫液，根據顏色，計算各自的洗脫體積。藍葡聚糖2000的洗脫體積記作V0，細胞色素c、VB12、溴酚藍、考馬斯亮藍G250的洗脫體積記作Ve，繪制分子質量標準曲線。根據紫薯花青素溶液的洗脫體積，確定紫薯花青素分子質量的分布。

1.3.3 紫薯花青素基本性質研究

1.3.3.1 紫薯花青素的光譜性質

用移液管分別移取2.5、5.0、12.5 mL的色素粗提液于25 mL容量瓶中，用體積分數0.2%的HCl溶液定容至刻度。利用CARY50紫外-可見分光光度計，在室溫下以0.2% HCl溶液做基線校正，于200～700 nm波長范圍內對色素粗提稀釋液進行光譜掃描。

1.3.3.2 pH值對紫薯花青素色澤的影響

用廣泛緩沖液（pH 2.6～12.0），每升混合液內含檸檬酸6.008 g、磷酸二氫鉀3.89 g、硼酸1.769 g、巴比妥5.266 g，每100 mL混合液滴加一定量的0.2 mol/L NaOH溶液即得到所需的pH值。將紫薯花青素制品分別溶于不同pH值的緩沖液中，測定所得液體的pH值并注意觀察花青素的色澤變化。

1.3.3.3 紫薯花青素與氧化劑和還原劑的反應

配制0.01 mol/L pH 2.0的HCl溶液，以此作為溶劑，配制質量分數0.05%、0.1%、0.2%、0.5%的Na2SO3溶液，和體積分數0.05%、0.1%、0.2%、0.5% 的H2O2溶液。將配制好的溶液分別倒入已編號的燒杯中，稱取一定量的紫薯花青素制品置于相應的燒杯中并用玻璃棒攪拌至溶解。以溶于0.01 mol/L鹽酸溶液的花青素為對照組。置于室溫避光的環境下放2 h，測定530 nm波長處的吸光度。

1.3.4 紫薯花青素滴定法的精密度和準確度

為了探究紫薯花青素能否替代GB/T 6195—1986《水果、蔬菜維生素C含量測定法（2，6-二氯靛酚滴定法）》中的2，6-二氯靛酚，進行了替代后的精密度和準確度分析（簡稱紫薯花青素滴定法）。

1.3.4.1 精密度實驗

稱取100 g的夏橙和西紅柿可食部分，放入SG260-A榨汁攪拌器中，加體積分數1% 100 mL的HCl溶液做浸提劑，迅速搗成勻漿后4 000 r/min離心處理3 min，上清液過濾，移取40 mL過濾液于200 mL容量瓶用1% HCl溶液稀釋至刻度。吸取6 份10 mL稀釋液放入6 個50 mL錐形瓶中，分別用已用標準VC標定過的2，6-二氯靛酚溶液滴定，直至溶液呈粉紅色15 s不褪色為止。另吸取6 份10 mL稀釋液放入6 個50 mL錐形瓶中，分別用已用標準VC標定過的紫薯花青素溶液滴定，直至溶液呈粉紅色15 s 不褪色為止。同時用1% HCl溶液做空白實驗。

1.3.4.2 準確度實驗

取夏橙和西紅柿稀釋液（制備方法同1.3.4.1節），用2，6-二氯靛酚溶液滴定法測定，用mg/100 g可食部分表示本底值。向夏橙和西紅柿的100 g可食部分得到的過濾液中分別添加標準VC，使最終標準VC的加入量為10、20、30 mg/100 g可食部分，此液稱為混合液。取40 mL混合液于200 mL容量瓶用1% HCl溶液稀釋至刻度。余下步驟參照GB/T 6195—1986。

1.3.4.3 夏橙和西紅柿中VC含量的計算

配制標準抗壞血酸溶液，根據GB/T 6195—1986所描述的方法和公式（1）計算2，6-二氯靛酚和紫薯花青素的滴定度，再根據公式（2）計算夏橙和西紅柿的VC含量。

式中：T為每毫升2，6-二氯靛酚或紫薯花青素溶液相當于抗壞血酸的毫克數/（mg/mL）；ρ為抗壞血酸的質量濃度/（mg/mL）；V為吸取抗壞血酸的體積/mL；V1為滴定抗壞血酸溶液所用2，6-二氯靛酚或紫薯花青素溶液的體積/mL；V2為滴定空白所用2，6-二氯靛酚或紫薯花青素溶液的體積/mL。

式中：V為滴定樣液時消耗2，6-二氯靛酚或紫薯花青素溶液的體積/mL；V0為滴定空白時消耗2，6-二氯靛酚或紫薯花青素溶液的體積/mL；T為2，6-二氯靛酚或紫薯花青素溶液的滴定度/（mg/mL）；A為稀釋倍數；m為樣品質量/g。

2 結果與分析

2.1 紫薯花青素的提取工藝參數及結果

通過預實驗得到的提取紫薯花青素的關鍵工藝參數：1）料液比：加入的體積分數0.2% HCl溶液，以1∶20（m/V）效果好，即1 g的紫薯加入20 mL鹽酸溶液；2）鹽酸浸泡：在40 ℃的水浴條件下，先浸泡1 h后再攪拌提取2 h（每隔15 min，攪拌1 min）；3）濃縮處理：浸泡液放在燒杯中在恒溫水浴鍋中進行敞開濃縮，設定溫度80 ℃，時間12 h；4）過柱純化：將獲得的濃縮液經Sephadex G-25柱（3.0 cm×60 cm），上樣量3.0 mL，用0.2% HCl溶液作為洗脫劑，流速2 mL/min，自動部分收集儀收集洗脫液，每管收集2 mL。重復10 次，合并顏色為紫紅色的洗脫液，再次敞開蒸發得到純化的色素液；5）紫薯花青素的制備：將純化的色素液置于烘箱中干燥（60 ℃干燥3 h），得到紫薯花青素制品。

本實驗所用的方法屬于溶劑提取法。溶劑提取法是國內外關于花青素提取方面報道最多的，花青素在酸性條件下穩定性較好，利用鹽酸化甲醇、檸檬酸、酒精、鹽酸水溶液等提取劑都能得到較好的提取結果［7-12，17］。本實驗以0.2% HCl溶液為提取劑和過柱用的洗脫劑，既是為了好的提取效果也是為了減少對環境的污染；在80 ℃恒溫水浴鍋中敞開蒸發進行濃縮，避免了減壓濃縮時由于紫薯中存在的皂苷類易起泡蒸發而引起的色素損失。用Sephadex G-25柱純化色素粗提液，優點在于Sephadex G-25是具有分子篩性質的固定相，與色素之間沒有化學反應，能提高色素的得率。100 g紫薯經稀鹽酸浸提、過柱、濃縮、干燥后，可得（0.65±0.07） g花青素制品，為膏狀的紅褐色色素。

2.2 紫薯花青素的分子質量

在分子排阻色譜法實驗中，繪制的分子質量標準曲線為y=-1.339x+5.539（R2=0.998 3），其中x為紫薯花青素分子質量的對數值（lg Mr），y為Ve/V0。根據花青素溶液的洗脫體積，參考分子質量標準曲線，確定花青素分子質量的范圍，主要在850～1 020 u之間。

2.3 紫薯花青素的基本性質

2.3.1 花青素的光譜性質

圖1中的3 條曲線分別表示不同花青素質量濃度下的吸收光譜特征。紫薯花青素的紫外-可見吸收光譜結果說明色素在紫外波長下有大量的吸收，這與花色苷的結構相符合。在可見光區域，波長為530 nm處有一特征吸收峰，說明所提取的紫薯花青素的最大吸收波長在530 nm處。

2.3.2 pH值與紫薯花青素溶液顏色的關系

紫薯花青素在不同的介質中表現出不同的顏色，是因為不同的pH值環境使花青素存在形式發生了變化［18］，從而呈現出不同的顏色。正因為紫薯花青素在不同pH值環境中如此的表現，使它具備了充當酸堿指示劑的基本特征。由表1可知，紫薯花青素溶液在酸性溶液（pH 1.0～5.0）中呈紅色，在堿性溶液（pH 9.0～10.0）中呈藍綠色，這與2，6-二氯酚靛酚在酸、堿兩性中所呈現的顏色非常相似。染料2，6-二氯靛酚的顏色受介質的酸度影響，在堿性溶液中呈深藍色，在酸性介質中呈淺紅色［14］。

2.3.3 紫薯花青素與氧化劑和還原劑的反應結果

以Na2SO3為還原劑，H2O2為氧化劑來考察還原劑和氧化劑對花青素顏色穩定性的影響。由圖2可知，隨著Na2SO3質量分數的增加，色素溶液的顏色有著明顯的變化，從原先的艷紅色漸漸變為無色，當Na2SO3質量分數為0.5%時，A530mn值只有0.077±0.013，肉眼觀察為無色。相比之下H2O2的加入對色素溶液的影響沒那么大，由圖3可知，在H2O2的體積分數為0.5%時，A530mn值為0.424±0.028。盡管Wesche-Ebeling等［19］研究發現H2O2可引起花色苷的降解，但對花青素顏色穩定性的影響比Na2SO3還是小得多。

由于亞硫酸鈉還原性極強，而紫薯花青素可以充當氧化劑，在與亞硫酸鈉的氧化還原反應中得到了電子，導致紫薯花色苷色素中主體結構吡喃環上的四價氧原子的化合價降低。紫薯花青素能充當氧化劑的特性，與GB/T 6195—1986中的2，6-二氯靛酚也相似，2，6-二氯靛酚的顏色也取決于其氧化還原狀態，氧化態在酸性介質中為紅色，還原態變為無色［14］。由上文可知，對照組是紅色，而當加入的Na2SO3質量分數為0.5%時，紫薯花青素變為無色，說明花青素此時處于還原態。

2.4 紫薯花青素滴定法的精密度和準確度

2.4.1 方法精密度

取夏橙和西紅柿稀釋液各12 份，6 份利用2，6-二氯靛酚滴定法測定，另6 份利用紫薯花青素滴定法進行測定。在測定中發現紫薯花青素與VC的反應完全、迅速，耗時與GB/T 6195—1986中2，6-二氯靛酚的作用時間相當。測定結果見表2。

由表2可知，兩種方法平行樣測定都有較好的重現性。花青素替代GB/T 6195—1986中2，6-二氯靛酚測定的夏橙和西紅柿中VC含量分別為（25.33±0.34）、（20.41±0.32） mg/100 g；而2，6-二氯靛酚測定夏橙和西紅柿中VC的含量分別為（25.28±0.46）、（20.25±0.21） mg/100 g。精密度實驗的相對標準偏差2，6-二氯靛酚法為1.04%～1.82%，紫薯花青素法為1.35%～1.59%，均小于2%，說明用紫薯花青素替代GB/T 6195—1986中2，6-二氯靛酚是可行的，替代后重現性高。

2.4.2 方法準確度

為了確認方法的可靠性，進行了加標回收實驗，結果見表3。紫薯花青素法的加標回收率在95.4%～98.6%，相對標準偏差為1.18%～1.22%；2，6-二氯靛酚法的加標回收率在96.5%～98.7%，相對標準偏差為0.86%～0.88%。兩種方法測定的結果十分接近。食品中VC含量的測定方法有滴定法、光度分析法、高效液相色譜法和電化學法［20］。滴定法最為經典，滴定法中又以GB/T 6195—1986法最為簡便、快速。高效液相色譜法和電化學法是近年來發展的新方法，王艷穎等［21］報道高效液相色譜測定草莓中VC含量，其加標回收率為97.4%～102.1%，相對標準偏差小于3%；孫德坤等［22］報道的褪色光度法測定果蔬中VC含量的方法其回收率94.03%～98.90%；王佳露等［23］等建立了極譜法測定VC含量的方法，實驗中對芒果中的VC含量進行7 次平行實驗，相對偏差為0.665%，回收率為93.4%～95.8%；左國強等［24］利用高錳酸鉀褪色光度法測定梨中VC含量，其回收率為101%～105%，相對標準偏差為1.13%；胡文娜等［25］利用黃瓜、柑橘等果蔬對Ag/聚L-甲硫氨酸復合修飾電極法測定VC含量的準確度進行了驗證，回收率為95.6%～98.3%，相對標準偏差為1.1%～3.0%。本實驗結果與文獻的數據相比較，從精密度和準確度分析紫薯花青素滴定法用于水果、蔬菜中VC含量的檢測是可行和可靠的。

3 結 論

100 g紫薯經稀鹽酸浸提、過柱、濃縮、干燥等工藝處理后可得花青素為0.65 g。以紫薯為原料提取花青素，具有資源豐富、提取簡便、色彩鮮艷、對環境無污染、安全性好的優點。

花青素替代GB/T 6195—1986中2，6-二氯靛酚測定夏橙和西紅柿中VC含量，結果表明精密度實驗的相對標準偏差小于2%，替代后重現性高。紫薯花青素法和2，6-二氯靛酚法的加標回收率結果接近，花青素替代GB/T 6195—1986中2，6-二氯靛酚后的方法準確度高。

本實驗所建立的利用紫薯花青素替代GB/T 6195—1986中2，6-二氯靛酚測定水果、蔬菜中VC含量的方法具有安全、廉價、準確度與2，6-二氯靛酚法滴定法相當的特點。

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Anthocyanins from Purple Sweet Potato （Ipomoea batatas） and Its Application in VC Quantification

GUO Caihua， LU Zhenhua， WU Ling， CHEN Zhaohua， CHEN Qingchou， XIONG Hejian*
（College of Food and Biological Engineering， Jimei University， Xiamen 361021， China）

Anthocyanins were extracted from purple sweet potato （Ipomoea batatas） using an environmentally friendly process. The anthocyanins exhibited characteristic absorption peak at 530 nm， having a molecular weight in the range of 850-1 020 u. The content of vitamin C in Valencia orange and tomato was determined by a new titration method using the anthocyanins extracted from purple sweet potato in place of 2，6-dichloroindophenol as described in the Chinese national standard GB/T 6195-1986. The results showed that vitamin C was （25.33 ± 0.34） mg/100 g in Valencia orange and （20.41 ± 0.32） mg/100 g in tomato. The spiked recoveries of VC with purple sweet potato anthocyanins ranged from 95.4% to 98.6%，with relative standard deviation （RSD） of 1.18%-1.22%， while those with 2，6-dichloroindophenol titration were between 96.5% and 98.7% with RSD of 0.86%-0.88%. The anthocyanin titration method was safe and low-cost with an accuracy equivalent to that of 2，6-dichloro-indophenol titration.

Ipomoea batatas； anthocyanins； GB/T 6195-1986； 2，6-dichloroindophenol； vitamin C

10.7506/spkx1002-6630-201609025

TS255

A

1002-6630（2016）09-0134-05

郭彩華， 盧珍華， 伍菱， 等. 紫薯花青素的提取及其在VC含量測定中的應用［J］. 食品科學， 2016， 37（9）： 134-138. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609025. http：//www.spkx.net.cn

GUO Caihua， LU Zhenhua， WU Ling， et al. Anthocyanins from purple sweet potato （Ipomoea batatas） and its application in VC quantification［J］. Food Science， 2016， 37（9）： 134-138. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609025. http：//www.spkx.net.cn

2015-08-16

福建省自然科學基金資助項目（2013J01134）

郭彩華（1963—），女，副教授，碩士，主要從事食品生物化學研究。E-mail：chguo@jmu.edu.cn

*通信作者：熊何健（1968—），男，研究員，碩士，主要從事食品化學與營養研究。E-mail：hjxiong@jmu.edu.cn