穿入現象在自身免疫性肝炎中的臨床意義

卞兆連　秦剛　陳琳　邵建國　苗琪　馬雄

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·論著·

穿入現象在自身免疫性肝炎中的臨床意義

卞兆連秦剛陳琳邵建國苗琪馬雄

目的研究自身免疫性肝炎(Autoimmnue hepatitis, AIH)中發生穿入現象的概況以及其臨床意義。方法H&E染色后在顯微鏡下觀察，AIH患者肝組織是否存在細胞穿入現象；通過Ishak評分系統對每一例AIH患者肝內炎癥及纖維化評分，并對每例患者行界面性肝炎、漿細胞浸潤以及玫瑰花結等情況的評估；隨后，通過統計學分析AIH患者肝組織中發生穿入現象的比例，并分析穿入現象與肝內炎癥及纖維化的關系以及與AIH特征性病理表現之間的關系。結果57.3% AIH患者肝組織中發現穿入現象，穿入現象發生后宿主肝細胞嗜伊紅染色；隨著AIH患者肝內炎癥及纖維化的加重，穿入現象的發生比例逐漸增高，差異有統計學意義；發生穿入現象的AIH患者肝內界面性肝炎較無穿入組明顯加重，同樣在發生穿入組患者肝內玫瑰花結的發生率增加，而與漿細胞浸潤無明顯相關性。結論穿入現象可能是診斷AIH的重要病理學特征，并可能是AIH患者肝細胞損傷的機制。

穿入現象；自身免疫性肝炎；界面性肝炎；玫瑰花結

自身免疫性肝炎(Autoimmnue hepatitis, AIH)臨床表現為不同程度的肝功能損傷，主要以丙氨酸氨基轉移酶(ALT)升高為主，血清自身抗體陽性，高免疫球蛋白G和(或)γ-球蛋白血癥，隨著疾病不斷發展，可進展為肝硬化、肝功能衰竭等終末期肝病，嚴重影響患者預后及生活質量。AIH的臨床表現多種多樣，一般表現為慢性、隱匿性起病，但也可表現為急性發作，甚至表現為急性肝功能衰竭。AIH的病理學特征表現主要包括中-重度界面性肝炎、玫瑰花結以及淋巴-漿細胞浸潤。2015年我國《自身免疫性肝炎診治專家共識》提出穿入現象是繼上述三種特征性病理改變之后的另一種特征性的病理表現，對AIH的診斷及鑒別診斷有重要價值[1]。穿入現象，于1956年由Humble等首次提出，是指一個活細胞進入另一個活細胞的現象；與傳統的“吞噬”概念明顯不同，穿入是發生在兩個活細胞之間，而吞噬是指吞噬已經死亡的細胞或其碎片的生理過程[2]。目前研究顯示，穿入可發生于腫瘤細胞之間、免疫細胞與腫瘤之間或者免疫細胞和正常細胞之間[3]。Sandilands等[4]研究發現，淋巴細胞可穿入體外培養的人肝細胞，后續研究陸續發現穿入現象可見于自身免疫性肝炎、藥物性肝炎、病毒性肝炎等[5-7]。2008年AIH簡化診斷標準中將細胞穿入現象作為AIH組織學表現之一[6，8]，2015年我國《自身免疫性肝炎診治專家共識》也提出穿入現象在AIH診斷及鑒別診斷中的價值，揭示了穿入現象在AIH中的重要地位，但穿入現象在AIH中的臨床意義及價值仍不明確。本研究致力于闡述AIH中，細胞穿入現象的臨床價值及意義。

資料和方法

一、標本來源和主要試劑

收集2008年至2015年在南通市第三人民醫院及上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院，行肝穿刺組織病理學檢查的AIH患者，共計75例，其中男性12例，女63例。AIH的診斷標準參照1999年修訂的自身免疫性肝炎積分系統，所有患者均為確定性診斷，評分≥18分。蘇木素染色液及伊紅染液購自上海研域化學試劑有限公司。

二、蘇木素-伊紅染色法

肝穿刺標本經過4%甲醛溶液固定后，石蠟包埋切片至4 μm厚；常規脫蠟水化，隨后經過蘇木素染色液及伊紅染液浸染，透明后，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并統計。

三、 統計學分析

計量資料使用均數±標準差表示，組間比較應用非參數檢驗；計數資料使用n(%)表示，組間比較使用χ2檢驗。應用Graphpad prism 6行統計學分析，P<0.05為差異有統計學意義。

結　　果

一、自身免疫性肝炎患者肝組織病理情況分析

共收集75例AIH患者，其中男性12例，女性63例，男女發病率近1:6，平均發病年齡49.7歲。對肝穿刺活檢病理組織行Ishak評分系統評分。根據炎癥評分高低將患者分為3個等級,分別為<6分、6～12分以及>12分。<6分27例，6～12分4例，>12分7例。根據纖維化程度不同將患者分為2個等級，≤2分以及≥3分，分別為34和41例患者。

二、AIH患者中主要以淋巴細胞穿入肝細胞為主

在AIH患者肝組織中，細胞穿入主要是發生在淋巴細胞與肝細胞之間，被淋巴細胞穿入的肝細胞胞質嗜伊紅染色，提示肝細胞可能進入凋亡前期，即將發生細胞凋亡(圖1)。75例AIH患者中43例(57.3%)發生淋巴細胞穿入肝細胞，提示淋巴細胞穿入肝細胞現象在AIH中較為常見。

AIH患者穿入現象

三、自身免疫性肝炎中，淋巴細胞穿入肝細胞的臨床意義

75例AIH患者中Ishak評分<6分共27例，8例(29.6%)發生淋巴細胞穿入肝細胞；6～12分共41例患者，28例(68.3%)發現穿入現象；>12分共7例，肝組織中均發現淋巴細胞穿入肝細胞現象，各組間差異有統計學意義(P<0.05)。該結果提示在AIH患者中，隨著肝內炎癥逐漸加重，淋巴細胞穿入肝細胞的發生比率也明顯增加。進一步分析肝纖維化與穿入現象之間的關系。根據Ishak評分系統將AIH患者分為輕度纖維化及明顯纖維化兩組，≤2分為輕度纖維化組，不會出現P-P纖維橋接；而≥3分時視為明顯纖維化組，肝內至少出現P-P纖維橋接，甚至出現肝硬化等嚴重改變。結果顯示34例輕度肝纖維化患者中，12例(35.3%)肝組織內發生淋巴細胞穿入肝細胞現象；而41例明顯肝纖維化患者組中，31例(75.6%)發現淋巴細胞穿入肝細胞現象，兩組間差異有統計學意義(P<0.05)。

四、穿入現象與界面性肝炎、玫瑰花結、漿細胞浸潤之間的關系

AIH特征性的病理學改變主要包括界面性肝炎、玫瑰花結以及漿細胞浸潤三個方面。2008年國際自身免疫性肝炎小組制定的簡化標準中提及穿入現象是AIH的表現之一，那么它與傳統的AIH病理學特征之間是否存在相關呢？將所有AIH患者分為二組，分為無穿入現象組(n=32)及有穿入現象組(n=43)，結果顯示在無穿入組患者中肝內界面性肝炎(0.91±0.34)相對較輕，而在有穿入現象組肝內界面性肝炎明顯加重(1.84±0.27)，差異有統計學意義(P<0.01)；分析兩組患者間漿細胞浸潤是否存在差異，未發現穿入組患者中30例(93.8%)發現漿細胞，而穿入組中42例(97.7)發現漿細胞，統計學分析兩組間漿細胞浸潤無差異(P>0.05)；進一步分析有無穿入現象組間玫瑰花結發現率是否存在差異，結果顯示無穿入組中4例(12.5%)發現玫瑰花結，而穿入組患者中11例(25.6%)發現玫瑰花結，結果分析顯示兩組患者肝組織中玫瑰花結發現率有統計學差異(P<0.05)。

討　　論

1925年，Lewis首次發現細胞進入細胞的現象，并將其定義為一個活細胞自發進入另一個活細胞的現象[9]，其與傳統的“吞噬”概念完全不同，主要表現在以下二個方面，①發生的主題不同：穿入發生在兩個活細胞間，而吞噬發生在活細胞與凋亡細胞/細胞碎片之間；②結局不相同：發生穿入的細胞仍能存活一段時間，可發生分裂，甚至可從宿主細胞中“逃脫”，而吞噬的結局是以消除凋亡細胞或細胞碎片為最終的結局[3]。目前研究顯示，細胞進入細胞現象可以發生在多種類型細胞之間，而根據細胞類型的不同，分為兩大類：①Emperipolesis(穿入)指兩種不同細胞間的相互作用，如免疫細胞與腫瘤細胞之間；② Entosis主要適用于同種細胞之間，如腫瘤細胞之間。Emperipolesis這一概念是由Humble等[2]在研究淋巴細胞和其他細胞相互作用的過程中提出的。進一步的研究發現，淋巴細胞可穿入多種類型的細胞，如：巨核細胞、成纖維細胞和乳腺癌細胞等[10-12]。早在1978年，Sandilands等[4]報道了穿入現象在肝臟方面的研究，發現體外培養的淋巴細胞可穿入正常人肝臟細胞(張氏肝細胞)。最近研究發現，其他種類的淋巴細胞系也可穿入肝細胞，如人T淋巴瘤細胞、淋巴因子激活的殺傷細胞等[13]。在多種疾病中也存在穿入現象，例如自身免疫性貧血、實體腫瘤、神經母細胞瘤、多發性骨髓瘤、白血病等[10，14，15]。穿入現象是肝臟炎癥性疾病的一個重要病理學特征，在疾病的診斷及鑒別診斷方面具有一定的參考價值，在多種肝臟炎癥性疾病如AIH、病毒性肝炎和藥物性肝損傷中均可發生[5-7]，其中AIH的發現率明顯高于其他肝臟炎癥性疾病，提示穿入現象在AIH的診斷中有一定的價值。本研究發現，57.3%的AIH患者肝組織中有淋巴細胞穿入肝細胞現象，提示淋巴細胞穿入肝細胞是重要的病理學特征，可能是繼玫瑰花結、漿細胞浸潤、界面性肝炎之后成為AIH特征性的病理改變，在AIH的診斷及鑒別診斷中發揮重要作用。進一步的研究發現，在AIH中，發生穿入現象的宿主肝細胞胞質嗜伊紅染色，提示宿主肝細胞已經發生早期凋亡，這可能是AIH患者肝組織中肝細胞損害的機制之一。

目前認為，AIH發病基礎是機體免疫耐受被打破，自身反應性T細胞在肝臟局部聚集，造成器官特異的自身免疫性肝損害，而肝細胞是主要的靶細胞[16]。在AIH發病過程中，CD8、CD4陽性T細胞、漿細胞以及單核/巨噬細胞在匯管區浸潤，引起界板處肝細胞損傷為主要特征[17]。白介素-17可通過促進肝細胞分泌白介素-6等細胞因子參與AIH的發病機制[18]。最近研究發現，AIH患者肝組織中發生穿入的細胞主要是CD8陽性T細胞[19]，而CD8陽性T細胞是AIH中主要的效應細胞，結合本研究發現發生穿入的宿主肝細胞發生早期凋亡，提示穿入現象可能在AIH肝細胞損傷的發病機制中發揮重要作用。

綜上所述，AIH患者淋巴細胞穿入肝細胞較為常見，并且隨著肝內炎癥的加重，穿入現象發生逐漸增加，提示穿入現象可能在AIH的發病過程中發揮重要作用。進一步研究發現，穿入現象與界面性肝炎以及玫瑰花結的發生相關，隨著穿入現象的出現，界面性肝炎加重，玫瑰花結的發生率也增加，提示穿入現象可能是AIH重要的病理學特征，是AIH發病過程中肝細胞損害的重要機制之一。

[1]中華醫學會肝病學分會，中華醫學會消化病學分會，中華醫學會感染病學分會. 自身免疫性肝炎診斷和治療共識(2015). 肝臟，2015，24：969-982.

[2]Humble JG, Jayne WH, Pulvertaft RJ. Biological interaction between lymphocytes and other cells. Br J Haematol, 1956, 2: 283-294.

[3]Overholtzer M, Brugge JS. The cell biology of cell-in-cell structures. Nat Rev Mol Cell Biol, 2008, 9:796-809.

[4]Sandilands GP, Reid FM, Gray KG, et al. Lymphocyte emperipolesis revisited. I. Development of in vitro assay and preliminary characterisation of the lymphocyte subpopulation involved. Immunology, 1978, 35:381-389.

[5]Dienes HP. Viral and autoimmune hepatitis. Morphologic and pathogenetic aspects of cell damage in hepatitis with potential chronicity. Veroff Pathol, 1989, 132:1-107.

[6]Hennes EM, Zeniya M, Czaja AJ, et al. Simplified criteria for the diagnosis of autoimmune hepatitis. Hepatology, 2008, 48:169-176.

[7]Suzuki A, Brunt EM, Kleiner DE, et al. The use of liver biopsy evaluation in discrimination of idiopathic autoimmune hepatitis versus drug-induced liver injury. Hepatology, 2011, 54:931-939.

[8]Qiu D, Wang Q, Wang H, et al. Validation of the simplified criteria for diagnosis of autoimmune hepatitis in Chinese patients. J Hepatol, 2011, 54:340-347.

[9]Yang YQ, Li JC. Progress of research in cell-in-cell phenomena. Anat Rec (Hoboken), 2012, 295:372-377.

[10]Larsen TE. Emperipolesis of granular leukocytes within megakaryocytes in human hemopoietic bone marrow. Am J Clin Pathol, 1970, 53:485-489.

[11]Sinkovics JG, Shullenberger CC, Howe C, et al. Cell destruction by lymphocytes. Lancet, 1966, 287:1215-1216.

[12]Saxena S, Beena KR, Bansal A, et al. Emperipolesis in a common breast malignancy. A case report. Acta Cytol, 2002, 46:883-886.

[13]Chen YH, Wang S, He MF, et al. Prevalence of heterotypic tumor/immune cell-in-cell structure in vitro and in vivo leading to formation of aneuploidy. PLoS One, 2013, 8:e59418.

[14]Natori H, Natori K, Naito K, et al. Emperipolesis by megakaryocytes in RAEB in T (refractory anemia with excess of blasts in transformation). Rinsho Ketsueki, 1988, 29:1504-1510.

[15]Djaldetti M, Strauss Z. Emperipolesis by megakaryocytes in patients with non-Hodgkin's lymphoma and megaloblastic anemia. J Submicrosc Cytol, 1982, 14:407-413.

[16]Weiler-Normann C, Lohse AW. Autoimmune hepatitis: A life-long disease. J Hepatol, 2013, 58:5-7.

[17]Longhi MS, Ma Y, Mieli-Vergani G, et al. Aetiopathogenesis of autoimmune hepatitis. J Autoimmun, 2010, 34:7-14.

[18]Zhao L, Tang Y, You Z, et al. Interleukin-17 contributes to the pathogenesis of autoimmune hepatitis through inducing hepatic interleukin-6 expression. PLoS One, 2011, 6:e18909.

[19]Miao Q, Bian Z, Tang R, et al. Emperipolesis Mediated by CD8 T Cells Is a Characteristic Histopathologic Feature of Autoimmune Hepatitis. Clin Rev Allergy Immunol, 2015, 48:226-235.

(本文編輯：錢燕)

Clinical significance of emperipolesis in autoimmune hepatitis

BIANZhao-lian,QINGang,CHENLin,SHAOJianguo,MIAOQi,MAXiong.

NantongThirdPeople'sHospital,NantongInstituteofLiverDisease, 99MiddleQingnianRoad,Jiangsu, 226006China. 2DivisionofGastroenterologyandHepatology,RenjiHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaotongUniversity，ShanghaiInstituteofDigestiveDisease,shanghai, 200001ChinaCorrespondingauthor:

ObjectiveTo investigate the incidence and clinic significance of emperipolesis in autoimmune hepatitis (AIH) patients in China. MethodsA histological evaluation by hematoxylin-eosin staining in all AIH patients was performed. Assessment of Ishak score was carried out for intrahepatic inflammation or fibrosis, as well as evaluation of interface hepatitis, plasma cell infiltration and rosette formation in the liver. Then the incidence of emperipolesis was analyzed statistically in patients with AIH. Furthermore, the relation of emperipolesis with intrahepatic inflammation or fibrosis and other pathological characteristics of AIH were analyzed. ResultsThe presence of emperipolesis was observed in 57.3% AIH cases which was with hepatocyte eosinophilic stained. The incidence of emperipolesis showed positive correlations with the aggravation of intrahepatic inflammation or fibrosis. Histologically, patients with emperipolesis had higher incidences of interface hepatitis and rosette formation as compared with patients without emperipolesis. ConclusionEmperipolesis might be an important pathological hallmark for AIH, which might even illustrate a novel mechanism of hepatocyte damage in AIH.

Emperipolesis; Autoimmune hepatitis; Interface hepatitis; Rosette

南通市科技局(MS22015105，HS2014061)；江蘇省衛計委科技項目(H201453)

226006南通市第三人民醫院南通市肝病研究所(卞兆連，秦剛，陳琳，邵建國)；上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院消化內科上海市消化疾病研究所(苗琪，馬雄)

馬雄，Email：maxiongmd@163.com

2016-07-16)