馬鈴薯PVY和PLRV病毒的TC-RT-PCR檢測

鄭葉葉，韓 磊，遲勝起，張劍峰

（青島農業大學農學與植物保護學院，山東 青島 266109）

病蟲防治

馬鈴薯PVY和PLRV病毒的TC-RT-PCR檢測

鄭葉葉，韓 磊，遲勝起*，張劍峰*

（青島農業大學農學與植物保護學院，山東 青島 266109）

傳統的RT-PCR技術檢測病毒需提取總RNA，RNA容易降解。利用試管捕捉反轉錄擴增（Tube capture RT-PCR，TC-RT-PCR）方法檢測了PVY和PLRV 2種病毒，實現了不需提取總RNA也可在同一反應中同時檢測2種病毒。根據已報道的引物用TC-RT-PCR的方法對PVY和PLRV的外殼蛋白基因進行了檢測。結果表明，TC-RT-PCR能夠成功的檢測出感染PVY或PLRV以及2種病毒共同侵染的樣品，擴增產物序列長度均與設計片段的長度相符，分別為781和364 bp，2種病毒擴增產物的測序結果同GeneBank中已知的序列比對后的同源性均高達97%以上。該技術為單獨或復合感染的馬鈴薯病毒的檢測提供了更加方便、高效的方法。同時測得試驗PVY病毒樣本屬于PVYNW株系。

PVY；PLRV；試管捕捉RT-PCR

病毒病是引起馬鈴薯退化的主要原因，可造成的產量損失高達80%［1］。已發現的馬鈴薯病毒多達40余種［2］，而馬鈴薯Y病毒和馬鈴薯卷葉病毒最為常見、危害最為嚴重。解決馬鈴薯退化減產的主要對策是培育和種植脫毒種薯，但仍有大量的馬鈴薯種薯并非脫毒薯，而且脫毒種薯經常發生病毒復侵染，生產中馬鈴薯病毒的檢測是保障馬鈴薯品質和產量的重要基礎，所以成為需要解決的重要問題［3］，由于田間經常發生多種馬鈴薯病毒的復合侵染［4］，每個材料就單一病毒檢測需要多次操作，增加檢測成本，國內外已有多人對馬鈴薯病毒進行了單重多重RT-PCR檢測［3-5］，并已應用在病毒檢測中。

試管捕捉RT-PCR（TubecaptureRT-PCR，TC-RT-PCR是在普通RT-PCR的基礎上建立的1種新方法。其不需提取RNA，而是利用病毒顆粒外殼蛋白與試管非特異性結合和RT-PCR擴增結合起來的1種病毒檢測和基因克隆的技術，避免了RNA的降解，可以和普通RT-PCR得到同樣的結果［6］，該技術已經應用于一些植物病毒的檢測中［7，8］。馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）具有明顯的株系分化現象。目前已被廣泛認同的株系類型有PVYO株系、PVYN株系、PVYC株系、PVYNTN株系、PVYNW株系、PVYN:O株系和PVYNA-NTN株系等。通過對PVY不同株系試驗，建立不同株系的相同檢測方法也非常重要。

本研究建立的雙重TC-RT-PCR分子檢測方法能夠一步診斷生產中單獨或復合感染馬鈴薯病毒的材料，大大提高了試驗的效率和成功率，同時初步鑒定出該PVY的株系類型。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試劑

材料：健康馬鈴薯‘Shepody’脫毒苗和同時攜帶PVY和馬鈴薯卷葉病毒（Potato leafroll virus，PLRV）的馬鈴薯‘Shepody’材料保存于青島農業大學植物病毒學實驗室。

試劑：PLRV、PVY抗體試劑包購自英國Adgen公司；RNAiso Plus、Ribonuclease inhibitor、M-MLV反轉錄酶、dNTPs、MgCl2、Taq DNA聚合酶等均購自寶生物工程（大連）有限公司（Takara）；引物由生工生物（上海）有限公司（Sangon）合成；DNA Fragment Quick Purification/Recover Kit購自北京鼎國生物技術有限責任公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 引物設計

采用張華鵬等［9］設計的引物YS/YA及RS/RA（表1）分別檢測PVY和PLRV的CP基因，擴增片段長度分別為781和364 bp。采用Rigotti和Gugerli［10］設計的引物PVYc3/f、PVY3+/3-及CP2+/1-（表1），用于鑒定PVY株系。

1.3 PVY和PLRV的普通RT-PCR

RNA提取：選取帶毒或健康馬鈴薯的莖葉及芽，用RNAiso Plus（Takara）試劑提取PVY和PLRV總RNA，具體操作見試劑盒說明。提取的RNA通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用紫外法測定其RNA含量。

表1 引物信息Table 1 Primer information

以PVY和PLRV總RNA為模板，分別用對應的引物對（YS，YA）和（RS，RA）進行RT-PCR；對照為健康馬鈴薯材料。

cDNA合成:10 μL反轉錄體系：RNA模板1 μL，3'端引物（10 μmo/L 0.5 μL，補ddH2O至5.5 μL，70℃水浴10 min后立即置于冰上冷卻2 min，加入5×RTBuffer2μL，dNTPs（2.5mmol/L）2μL，M-MLV 0.25 μL，Ribonuclease inhibitor 0.25 μL。反應條件：42℃延伸1 h，70℃變性15 min，4℃反應5 min。

PCR擴增：50 μL體系：反轉錄產物10 μL，5'端引物（10 μmol/L）0.5 μL，MgCl23 μL，Taq酶0.25μL，10×PCRBuffer5μL，補加ddH2O至50μL。反應條件：94℃預變性4 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進行30個循環；72℃延伸10 min。PCR反應結束后，取2 μL PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳，經Goldview染色后觀察結果。

1.4 樣品的制備

樣品制備如下：稱取2 g病葉或病芽，加少許液氮研碎后按1∶10（W/V）加入GEB充分研磨后，4℃、10 000 r/min離心10 min，取上清，用于TC-RT-PCR檢測。

1.5 PVY和PLRV的單重TC-RT-PCR

包被：取病毒提取液100包被0.2 mL PCR管，4℃包被過夜；PBST洗管3次，ddH2O洗2次后，室溫放置干燥后備用。

cDNA合成：10μL反轉錄體系：直接在PCR管中進行反轉錄。3'端引物（10 μmo/L）0.5 μL，補ddH2O至5.5μL，70℃水浴10 min后立即置于冰上冷卻2min，再加入5×RT Buffer 2 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL M-MLV0.25 μL，Ribonuclease inhibitor 0.25 μL。反應條件：42℃延伸1 h，70℃變性15 min，4℃反應5 min。

PCR擴增：步驟同1.3。

1.6 PVY和PLRV的雙重TC-RT-PCR

取病毒提取液100包被，具體步驟同1.4。在同一反應體系中，同時加入2種病毒的引物進行雙重TC-RT-PCR。對照反應中同時加入健康馬鈴薯RNA模板和2種病毒的引物。反應條件同單重TC-RT-PCR（步驟1.5）。

1.7 DAS-ELISA檢測

稱取2 g病葉或病芽，加少許液氮研碎后按1∶10（W/V）加入GEB充分研磨后，4℃、10 000 r/min離心10 min，取上清，用于DAS-ELISA檢測。具體步驟見抗體試劑包說明。

1.8 PVY株系的TC-RT-PCR

單引物的PVY株系的TC-RT-PCR具體步驟同1.5，所用引物分別為PVYc3/f、PVY3+/3-和CP2+/1-。

多引物的PVY株系的擴增50 μL體系中引物為PVYc3/f、PVY3+/3-和CP2+/1-，具體步驟同1.3。擴增產物送生工生物（上海）有限公司測序。

2 結果與分析

2.1 普通RT-PCR檢測PVY和PLRV

普通RT-PCR、普通雙重RT-PCR的擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳（圖1）。結果顯示，普通RT-PCR、普通雙重RT-PCR擴增產物長度分別與各自目的片段的大小相符。得到的片段即為要檢測的目的基因片段。

圖1 PVY和PLRV的普通RT-PCR產物檢測電泳Figure 1 RT-PCR product detection electrophoresis of PVY and PLRV

2.2 TC-RT-PCR檢測PVY和PLRV

圖2 PVY和PLRV的TC-RT-PCR產物檢測電泳Figure 2 TC-RT-PCR product detection electrophoresis of PVY and PLRV

單重TC-RT-PCR和雙重TC-RT-PCR的擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳（圖2）。結果顯示，單重TC-RT-PCR和雙重TC-RT-PCR擴增產物長度分別與各自目的片段的大小相符。得到的片段即為要檢測的目的基因片段。

2.3 目的片斷驗證

所有擴增產物測序結果表明，目的片段序列與PVY和PLRV設計的部分序列相同。

PVY和PLRV擴增序列與發表的CP基因進行同源性比較，顯示PVY與S74810（USA）、PVU25672（China）、EU073859（Jordan）和KR816232（Russia）的同源性均大于97%，PLRV與X77322、DQ315385、JQ420904和KC866618的同源性均大于99%，表明檢測的株系間具有很高的同源性，屬于同種病毒。TC-RT-PCR的檢測結果與普通RT-PCR結果完全一致。

2.4 ELISA、普通RT-PCR及TC-RT-PCR方法的檢測結果

分別用ELISA、普通RT-PCR及TC-RT-PCR方法檢測了22株攜帶PVY和PLRV的馬鈴薯植株，結果如下（表2、表3、圖3、圖4）：22株攜帶病毒的馬鈴薯植株中，有11株只含PVY，6株只含PLRV，3株含有PVY和PLRV兩種病毒，2株不含這2種病毒。3種檢測方法結果一致，說明TC-RT-PCR方法有實用性，能檢測感染1種病毒植株也可以檢測復合侵染的植株。

表2 PVY的ELISA檢測結果Table 2 ELISA test results of PVY

表3 PLRV的ELISA檢測結果Table 3 ELISA test results of PLRV

圖3 PVY和PLRV的普通RT-PCR產物Figure 3 RT-PCR product of PVY and PLRV

圖4 PVY和PLRV的TC-RT-PCR產物Figure 4 TC-RT-PCR product of PVY and PLRV

圖5 PVYNW株系的PCR產物Figure 5 PCR product of PVYNW

2.5 PVY株系的鑒定

采用引物PVYc3/f、PVY3+/3-及CP2+/1-進行PVY株系的TC-RT-PCR，擴增產物只有1條帶，大小為530 bp，擴增產物測序結果顯示其長度與目的片段相符（圖4）。測序結果，與PVYNW株系進行同源性比較也得到證實，表明該PVY株系與Z70238的同源性為98.51%，說明該PVY病毒屬于PVYNW株系（圖5）。

3 討論

傳統RT-PCR（Reverse Transcription-PCR）技術已被成功應用在病毒檢測上，國內外研究者在RT-PCR檢測方法上進行了多次改良［11-13］，該方法不僅快速，且特異性強、靈敏度高。但這些方法都存在病毒RNA的提取，不僅步驟繁瑣且RNA極易受外界因素干擾而降解，并且本身組織中含有的酚類、多糖和蛋白質等干擾因素，導致很難獲得高質量RNA。一般認為提取高質量RNA是RT-PCR反應的關鍵［14］，因此該技術對RNA提取過程的要求較為嚴格。TC-RT-PCR不需要提取RNA，而是利用試管非特異性捕捉病毒粒體，既簡化了操作程序、降低了操作要求又減少了成本。本研究用試管捕捉的方法，直接在試管中進行反轉錄擴增，并應用到馬鈴薯病毒PVY和PLRV檢測中。

馬鈴薯常有多種病毒的復合侵染，單重檢測已不能滿足當前的需要，采用雙重或多重TC-RT-PCR檢測病毒的復合侵染，將會進一步降低檢測成本，更加高效。

建立對同種病毒不同株系的通用檢測方法，將為檢測簡單化提供更多的幫助，本研究初步分析了所測定的PVY病毒所屬的株系類型，也為PVY病毒株系分型打下基礎。

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Detection of Potato Virus Y and Potato Leafroll Virus Using Tube Capture RT-PCR

ZHENG Yeye，HAN Lei，CHI Shengqi*，ZHANG Jianfeng*
（College of Agronomy and Plant Protection，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109，China）

To detect the virus using traditional RT-PCR technique needs extraction of RNA which degrades easily. Using tube capture reverse transcription amplification（Tube capture RT-PCR，TC-RT-PCR）method to detect two viruses，potato virus Y（PVY），and potato leafroll virus（PLRV），can be done in the same reaction system without extraction of total RNA.According to the reported primers，PVY and PLRV coat protein genes were detected with the method of TC-RT-PCR.The results showed that TC-RT-PCR successfully detected the samples infected with PVY or PLRV alone and coinfected with the two viruses，and the length of the amplified PVY and PLRV products was consistent with the length of the design fragments，781 bp and 364 bp，respectively.Sequencing of the two virus products with the sequence alignment in GeneBank homology were above 97%.The technique would provide a more convenient and efficient method for detecting potatoes for simple or complex virus infection.At the same time，the experiment found that the resulting PVY virus samples belonged to PVYNWstrain.

PVY；PLRV；tube capture RT-PCR

S532

A

1672－3635（2016）05-0296-06

2015-12-22

山東現代農業產業技術體系薯類創新團隊項目（SDAIT-16-06）；國家科技支撐計劃項目（2011BAD32B03-3）。

鄭葉葉（1989-），女，碩士研究生，主要從事馬鈴薯病毒研究。

張劍峰，教授，主要從事馬鈴薯病毒病害研究，E-mail:qauzjf@163.com；遲勝起，副教授，主要從事馬鈴薯病毒病害研究，E-mail:chishq@163.com。