煙草親和性解鉀PGPR菌株篩選及其促生效果研究

龔文秀,曹媛媛,倪海婷,孫樂妮,唐欣昀

安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥230000

煙草親和性解鉀PGPR菌株篩選及其促生效果研究

龔文秀,曹媛媛,倪海婷,孫樂妮,唐欣昀

安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥230000

【目的】為篩選具有煙草親和性的解鉀PGPR菌株，考察PGPR對(duì)煙草生長(zhǎng)和葉片鉀含量的作用。【方法】采用解鉀細(xì)菌培養(yǎng)基和煙草凝集素雙重篩選技術(shù)，從健康煙草幼苗根際土壤中篩選具有高促生潛力的煙草親和性解鉀PGPR，測(cè)定菌株解鉀能力，選取優(yōu)良解鉀菌株進(jìn)行盆栽接種試驗(yàn)，調(diào)查PGPR對(duì)煙株生長(zhǎng)影響，并測(cè)定葉片含鉀量。【結(jié)果】煙草親和性細(xì)菌占全部菌株數(shù)量的84.11%；18株P(guān)GPR的解鉀能力、產(chǎn)IAA、產(chǎn)鐵載體能力較強(qiáng)；其中7株P(guān)GPR能顯著促進(jìn)煙草幼苗根系生長(zhǎng)發(fā)育，促進(jìn)根系和地上部分干物質(zhì)量積累，具有較大的促生長(zhǎng)潛力。11株P(guān)GPR能促進(jìn)植株對(duì)鉀素的吸收，使煙草葉片含鉀量顯著高于施用同樣水平鉀肥的對(duì)照，達(dá)到施用100%鉀肥處理的水平。經(jīng)綜合評(píng)價(jià)，TK11、TK32、TK54、TK84、TK89 共5株高效煙草親和性菌株具有進(jìn)一步研究和應(yīng)用的潛力。5株高效PGPR經(jīng)鑒定分屬5個(gè)屬，具有豐富的多樣性。【結(jié)論】煙草凝集素可作為篩選高效專用PGPR的有效工具，獲得的5株優(yōu)良PGPR為研發(fā)煙草專用生物鉀肥提供了可靠材料。

煙草；解鉀能力；親和性；PGPR；葉片鉀含量

我國(guó)烤煙平均鉀含量?jī)H為1.3%[1]，遠(yuǎn)低于優(yōu)質(zhì)煙含鉀量高于2.5%的要求[2]，不能滿足生產(chǎn)高品質(zhì)煙草的需求。鉀素影響煙葉的生長(zhǎng)、品質(zhì)和可用性[3]，煙葉含鉀量與根際土壤速效鉀含量極顯著正相關(guān)[4]。硫酸鉀和硝酸鉀等化學(xué)鉀肥施用促進(jìn)了煙草的生產(chǎn)，但作物對(duì)化肥的平均利用率只有30%左右。施用硫酸鉀使硫素進(jìn)入土壤，過(guò)量的SO42-會(huì)抑制煙草生長(zhǎng)[5]，影響煙葉燃燒性和烤煙品質(zhì)[6]。過(guò)量使用化肥導(dǎo)致資源、能源的浪費(fèi)，并產(chǎn)生嚴(yán)重的環(huán)境污染。

植物根際促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是一類存活在植物根際，可促進(jìn)植物生長(zhǎng)、防治病害、增加作物產(chǎn)量的有益菌群[7]。PGPR可以合成促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)發(fā)育的吲哚-3-乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）[8,9]和具有生物防治相關(guān)性的鐵載體（Siderodhore）[10,11]，并能夠溶解土壤中的礦物態(tài)元素[12,13]等。土壤中全鉀含量很高，但作物可直接吸收利用的速效鉀僅占全鉀的1%～10%；鉀素多以鉀長(zhǎng)石、伊利石等礦石形態(tài)存在，不能被作物直接吸收。已有一些研究利用土壤中解鉀細(xì)菌制作生物肥料施到田間，增加土壤中速效鉀濃度，減少鉀肥的施用量。但是，由于生物肥料和目標(biāo)作物之間缺乏親和性，兩者不能相互識(shí)別進(jìn)而產(chǎn)生穩(wěn)定的關(guān)系，解鉀細(xì)菌不能有效地在作物根部定居，造成施用效果波動(dòng)。因此，需要篩選到與目標(biāo)作物具有親和性的PGPR，以生產(chǎn)目標(biāo)作物專用的生物肥料。凝集素（Lectin）是一種具有識(shí)別專一性的糖結(jié)合糖蛋白。植物凝集素參與細(xì)胞-細(xì)胞識(shí)別[14]，可以介導(dǎo)植物促生細(xì)菌定殖于植物根部和抵御病原菌對(duì)植物的侵害[15]。目前為止尚沒有關(guān)于對(duì)煙草具有親和性的專用解鉀細(xì)菌的研究和應(yīng)用。

本研究以凝集素為介導(dǎo)篩選煙草親和性解鉀PGPR，考察煙草PGPR的解鉀能力等促生生理活性，了解其對(duì)煙草生長(zhǎng)和葉片鉀含量的影響，以期獲得具有煙草親和性的解鉀PGPR，為研究特定作物專用生物肥料、保護(hù)農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境和實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

煙草樣品：從煙草大田挖取健康煙草苗完整根系及根際土壤。

兔血：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院提供。

煙草種子：云煙97品種，由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供。

黃褐土（g·kg-1）：總氮1.11，有機(jī)質(zhì)21.33，有效磷(P2O5) 0.0315，速效鉀(K2O) 0.154。

有機(jī)基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)土：購(gòu)于淮安市春山基質(zhì)肥廠。

1.2 培養(yǎng)基、試劑

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、解鉀細(xì)菌培養(yǎng)基[16]、細(xì)菌解鉀作用試驗(yàn)培養(yǎng)基[12]、MKB培養(yǎng)基[10]、含0.5 g·L-1L型色氨酸的King B培養(yǎng)基[17]、鉀長(zhǎng)石（標(biāo)準(zhǔn)品）、CAS檢測(cè)液[18]、Salkowski’s反應(yīng)液[19]。

1.3 煙草凝集素提取及活性

取5 g煙草種子置于清水中室溫浸泡10 h，搓種除去種皮蠟質(zhì)，研磨，4 ℃條件下提取凝集素。種子中加入25 mL預(yù)冷石油醚，脫脂14 h；加50 mL預(yù)冷PBS （磷酸鹽緩沖液：0.01 mol·L-1，pH 7.2，0.15 mol·L-1NaCl，下同），混勻，浸提24 h；吸取中間水相，10000 r·min-1離心20 min，上清即為粗提液；冰浴，待石油醚揮發(fā)完全后，0.2 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，4℃保藏備用。

按文獻(xiàn)[20]方法用PBS配成2% 血細(xì)胞懸液，4℃保存?zhèn)溆谩２捎貌Ｆz測(cè)凝集素的凝血活性，在玻片凹形孔中加20 μL凝集素粗提液，再加20 μL 2%血細(xì)胞懸液，混勻，室溫靜置10 min，低倍鏡檢。用PBS代替凝集素溶液做空白對(duì)照。對(duì)有凝血活性的煙草凝集素進(jìn)行凝血效價(jià)檢測(cè)[21]。

1.4 煙草根際細(xì)菌篩選

稱取1 g帶有微量根際土壤的煙草苗幼根，加到100 mL無(wú)菌生理鹽水中，加入50 μL吐溫-80，120 r.min-1振蕩1 h。制備解鉀細(xì)菌培養(yǎng)基（制霉菌素終濃度30 mg.L-1），采用稀釋平板法分離解鉀細(xì)菌菌株，28 ℃培養(yǎng)72 h；挑取水滴狀、透明圈較大的菌株，分離純化，選取長(zhǎng)勢(shì)較好的菌株保藏，待進(jìn)一步研究。

1.5 凝集素親和性菌株篩選

將分離保藏的煙草根際土壤細(xì)菌接種至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，160 r·min-128 ℃下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，離心收集菌體，蒸餾水洗滌后制成終濃度為108CFU·mL-1菌懸液備用。取干凈載玻片，在玻片凹形孔中加20 μL凝集素粗提液，再加入等量菌懸液，混勻，室溫下保濕反應(yīng)30 min后自然干燥，結(jié)晶紫簡(jiǎn)單染色后鏡檢。煙草凝集素浸提緩沖液代替煙草凝集素粗提液做空白對(duì)照。選取煙草凝集素親和性陽(yáng)性菌株保藏備用。

1.6 煙草根際細(xì)菌促生長(zhǎng)特性評(píng)估

參考盛下放等的試驗(yàn)方法[12]，利用細(xì)菌解鉀作用試驗(yàn)培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶試驗(yàn)，過(guò)氧化氫灰化法處理發(fā)酵液，采用火焰分光光度計(jì)法測(cè)定PGPR解鉀能力。參考王平等[10]方法測(cè)定煙草根際促生細(xì)菌產(chǎn)鐵載體能力。參照文獻(xiàn)[8]方法，利用 King B液體培養(yǎng)基（含0.5 g.L-1L型色氨酸）培養(yǎng)各菌株，采用Salkowski比色法，測(cè)定煙草根際促生細(xì)菌合成 IAA能力。

1.7 根際促生細(xì)菌對(duì)煙草幼苗的促生長(zhǎng)作用

浸種：煙草種子用蒸餾水室溫浸泡8～10 h，去掉漂浮的種子和雜質(zhì)；消毒：將洗凈的種子用75%乙醇處理30 s，無(wú)菌蒸餾水洗凈，再置于10% H2O2中浸泡8 min，無(wú)菌蒸餾水清洗；催芽：置于28 ℃人工氣候箱中光暗比16 : 8催芽至煙草種子露白。

菌液處理種子：將供試菌株接種至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，28 ℃ 160 r·min-1培養(yǎng)至穩(wěn)定期。菌液處理露白的煙草種子45 min，無(wú)菌蒸餾水清洗3次。同時(shí)取滅菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基同等條件處理露白煙草種子作對(duì)照。

花盆（? 96 mm×110 mm）中裝有150 g有機(jī)基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)土，第盆播種5～10顆種子，最終保留2株煙草苗，設(shè)3次重復(fù)；煙草置于25 ℃，光暗比16 : 8的條件下培養(yǎng)32 d至長(zhǎng)出第5片真葉、根系活躍、發(fā)育較完整時(shí)取出完整植株。使用EPSON Perfection V700/750根系掃描儀掃描植株根系，采用WinRHIZO根系分析專業(yè)版軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；分別將地上部分和地下部分烘干至恒重，測(cè)干重。

1.8 根際促生細(xì)菌對(duì)煙草葉片鉀含量的影響

采用盆栽法檢測(cè)煙草PGPR對(duì)煙草葉片鉀含量的影響。所有土壤施肥（g·kg-1土） CO(NH2)20.676、(NH4)2HPO40.0369，第盆裝黃褐土2.5 kg，土壤含水量以田間持水量的50%計(jì)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。設(shè)置2個(gè)鉀肥施用梯度（g KCl /kg土）：CK1 0.134，CK2 0.267，實(shí)驗(yàn)組0.134，以CK2鉀肥施用量為參考（100%），CK1和實(shí)驗(yàn)組鉀肥施用量為50%。

煙草種子消毒、催芽同1.7，第盆播種5～10顆種子。實(shí)驗(yàn)組第盆加1 mL菌懸液（同前）處理種子，對(duì)照組第盆加1 mL滅菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基處理種子，覆土；3 d后出苗整齊，第盆留1株苗。盛花期打頂后，收獲煙草植株，烘干至恒重。采用火焰分光光度計(jì)法[22]測(cè)煙草中部葉葉片含鉀量,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

1.9 煙草根際促生菌株鑒定

據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[23]和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第9版[24]，對(duì)篩選得到的煙草根基促生細(xì)菌菌株進(jìn)行形態(tài)和生理生化鑒定。采用PCR技術(shù)擴(kuò)增各菌株16S rDNA，PCR產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)合形態(tài)及生理生化特征判定種屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

煙草凝集素凝集兔血細(xì)胞如圖1所示，在視野范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組兔血細(xì)胞凝集成團(tuán)，分布不均勻，而空白對(duì)照組兔血細(xì)胞均勻分布，結(jié)果表明煙草凝集素具有凝血活性。經(jīng)檢測(cè)，煙草粗凝集素提液凝集兔血細(xì)胞的最高效價(jià)為26。

煙草凝集素凝集煙草PGPR活性如圖1所示，在視野范圍內(nèi)，部分菌株凝聚成團(tuán)，呈陽(yáng)性，而空白對(duì)照組細(xì)菌均勻分布。

利用解鉀選擇培養(yǎng)基從健康煙草苗根部初步篩選獲得101株解鉀菌。根據(jù)煙草凝集素對(duì)煙草PGPR的親和性差異，85株對(duì)煙草凝集素呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，占篩選PGPR總數(shù)84.11%，這些菌株即為對(duì)煙草具有親和性的特異性菌株。

2.2 煙草根際細(xì)菌促生長(zhǎng)特性測(cè)定

測(cè)定85株煙草凝集素凝集反應(yīng)陽(yáng)性菌株的促生長(zhǎng)特性，85株供試PGPR均有不同程度的解鉀能力。挑選出18株具有較強(qiáng)解鉀能力的菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

18株供試PGPR培養(yǎng)液中鉀含量遠(yuǎn)高于對(duì)照組，菌株之間解鉀能力存在顯著差異，供試PGPR發(fā)酵液中鉀含量相對(duì)增加量在36.96%～253.55%之間。不同PGPR菌株產(chǎn)鐵載體能力和IAA能力也存在明顯差異。

圖1 煙草凝集素與兔血細(xì)胞和PGPR菌株的凝集反應(yīng)Fig.1 Agglutination of tobacco lectin with rabbit blood cells and strains

表1 18株菌的促生長(zhǎng)特性Tab.1 Plant growth-promoting traits of 18 strains

續(xù)表1

2.3 煙草根際細(xì)菌促生長(zhǎng)研究

觀察各菌株對(duì)煙草幼苗生長(zhǎng)的影響（表2），發(fā)現(xiàn)13株P(guān)GPR顯著促進(jìn)根系干物質(zhì)量積累，其中9株效果極顯著；7株P(guān)GPR顯著促進(jìn)地上部分干物質(zhì)量積累，其中2株效果極顯著；7株P(guān)GPR顯著促進(jìn)植株總干物質(zhì)量積累，其中3株效果極顯著。6株P(guān)GPR顯著促進(jìn)根系干物質(zhì)量積累，但沒有顯著促進(jìn)地上部分干重積累；7株P(guān)GPR促生效果顯著，顯著促進(jìn)植株根系和地上部分干物質(zhì)量積累，占菌株數(shù)量的38.89%。

進(jìn)一步分析試驗(yàn)菌株對(duì)煙草幼苗根系生長(zhǎng)發(fā)育的影響，結(jié)果見表3。考察了PGPR菌株對(duì)根系的總表面積、總體積、總長(zhǎng)度、平均直徑、根尖數(shù)、分枝數(shù)共6個(gè)指標(biāo)的影響程度，發(fā)現(xiàn)11株顯著促進(jìn)總根長(zhǎng)增加，其中9株作用極顯著；13株顯著促進(jìn)根系總表面積和總體積增加，其中10株作用極顯著；3株顯著促進(jìn)根系平均直徑增大，其中2株作用極顯著；9株顯著促進(jìn)根系根尖數(shù)增加；7株顯著促進(jìn)根系分枝數(shù)增加，其中4株作用極顯著；11株顯著促進(jìn)根系交叉數(shù)增加，其中7株作用極顯著。12株P(guān)GPR顯著促進(jìn)指標(biāo)達(dá)到3個(gè)及以上，占總菌株數(shù)量的66.67%。

供試菌株對(duì)煙草幼苗的根系數(shù)量的影響見表4。5株P(guān)GPR明顯促進(jìn)煙草根系總數(shù)量的增加，2株達(dá)到顯著水平，3株達(dá)到極顯著水平。進(jìn)一步分析表明這種效果是表現(xiàn)在對(duì)根系二級(jí)側(cè)根的影響方面，而對(duì)一級(jí)側(cè)根數(shù)量影響不顯著。

試驗(yàn)結(jié)果初步說(shuō)明煙草PGPR能有效促進(jìn)煙草根系發(fā)育，促進(jìn)煙草生長(zhǎng)和干物質(zhì)量的積累。分析IAA和煙草幼苗根系之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)IAA與考察指標(biāo)均不相關(guān)，可能是PGPR多個(gè)促生長(zhǎng)特性同時(shí)影響植物根系的生長(zhǎng)發(fā)育。

表2 PGPR對(duì)煙草幼苗干物質(zhì)積累量的影響Tab. 2 Effects of tobacco PGPR on dry matter accumulation of tobacco seedlings

表3 PGPR對(duì)煙草幼苗根系生物量的影響Tab.3 Effects of tobacco PGPR on root parameters of tobacco seedlings

表4 PGPR對(duì)煙草幼苗根系數(shù)量的影響Tab.4 Effects of tobacco PGPR on root number of tobacco seedlings

2.4 菌株對(duì)葉片鉀含量的影響

試驗(yàn)菌株對(duì)煙草葉片含鉀量的影響見表5。PGPR處理煙草葉片含鉀量高于同樣施50%鉀肥的CK1，其中14株效果顯著，10株效果極顯著；13株P(guān)GPR處理煙草葉片含鉀量高于施100%鉀肥的CK2，效果與CK2相當(dāng)。初步說(shuō)明，煙草PGPR可以代替部分鉀肥提高煙草葉片含鉀量。

表5 煙草PGPR對(duì)煙草葉片含鉀量的影響Tab.5 Effects of tobacco PGPR on potassium content of tobacco leaves

分析18株P(guān)GPR的解鉀能力與煙葉含鉀量之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)二者之間無(wú)顯著相關(guān)性。解鉀能力不是唯一影響煙葉含鉀量和煙草根際土壤鉀素營(yíng)養(yǎng)的因素，PGPR的其他特性也影響煙草對(duì)鉀素的吸收和利用。

分析分類學(xué)上相近屬內(nèi)菌株的解鉀能力（發(fā)酵液鉀素濃度）和葉片鉀含量的關(guān)系，以降低PGPR其他特性對(duì)煙草葉片含鉀量的影響，結(jié)果如表6所示。芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬細(xì)菌的解鉀能力與煙草葉片含鉀量顯著正相關(guān)（P＜0.05）；假單胞菌屬和鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌的解鉀能力與煙草葉片含鉀量中度負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)0.5≤|r|＜0.8。

2.5 親和性菌株鑒定

18株煙草PGPR形態(tài)特征及部分生理生化特征研究及16s rDNA鑒定，結(jié)果如表7所示。18株煙草PGPR分屬7個(gè)屬，具有豐富的多樣性。

表7 煙草PGPR鑒定結(jié)果Tab.7 Identi fi cation of tobacco PGPR

3 討論

凝集素與微生物的根際定殖密切相關(guān)。Antonyuk等認(rèn)為麥胚凝集素在固氮螺菌和植物之間的通訊中起到重要作用[25]，Yegorenkova等研究發(fā)現(xiàn)巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)在小麥根部的定殖可能涉及麥胚凝集素與細(xì)菌多糖之間的識(shí)別和交聯(lián)[26]。夏覓真和齊飛飛等研究PGPR在棉花根際的定殖證實(shí)凝集素可作為篩選特異親和性的高效PGPR菌株工具，可以篩選易于在特定植物根際定殖的PGPR菌株[27,28]。本研究利用解鉀細(xì)菌培養(yǎng)基和煙草凝集素雙重技術(shù)，從健康煙草幼苗根際初步篩選獲得煙草親和性PGPR，結(jié)果顯示煙草凝集素特異親和陽(yáng)性菌株數(shù)量占初篩菌株的84.11%，獲得大量煙草親和性菌株。本研究獲得18株具有解鉀活性的煙草PGPR菌株，分屬7個(gè)屬，其中芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillussp.)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)為已經(jīng)報(bào)道的解鉀細(xì)菌類群[12,16,27-30]；而微桿菌屬(Microbacteriumsp.)[31]、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonassp.)[32]、短小桿菌屬(Curtobacteriumsp.)、鏈霉菌屬(Streptomycessp.)[33]等4屬為本試驗(yàn)首次證明具有較強(qiáng)的解鉀活性。本研究結(jié)果大幅度增加了解鉀細(xì)菌的類群范圍，說(shuō)明植物根際解鉀細(xì)菌資源具有豐富的多樣性。因此采用煙草凝集素能夠獲得大批對(duì)煙草具有親和性的可在其根際定殖的PGPR菌株。

植物根系與營(yíng)養(yǎng)的吸收利用直接相關(guān)，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要的作用，最終影響著地上部分的生長(zhǎng)發(fā)育。根系表面積及根尖數(shù)影響根系對(duì)土壤養(yǎng)分的吸收利用。PGPR可以產(chǎn)生植物激素（IAA、CTK、GA等），對(duì)根構(gòu)型有明顯調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)根尖細(xì)胞周期蛋白基因的表達(dá)、驅(qū)動(dòng)側(cè)根發(fā)生和伸長(zhǎng)[8,9]。PGPR促進(jìn)礦質(zhì)元素的釋放[13]、產(chǎn)生鐵載體[11]等活性也與植物的根際營(yíng)養(yǎng)密切相關(guān)。本試驗(yàn)考察了煙草PGPR菌株對(duì)根系的總表面積、總體積、總長(zhǎng)度、平均直徑、根尖數(shù)、分枝數(shù)共6個(gè)指標(biāo)的影響程度，發(fā)現(xiàn)12株顯著促進(jìn)指標(biāo)達(dá)到3個(gè)以上，7株煙草PGPR顯著促進(jìn)二級(jí)側(cè)根數(shù)量的增加。13株P(guān)GPR顯著促進(jìn)根系干物質(zhì)量積累，其中有7株P(guān)GPR能顯著促進(jìn)煙草幼苗根系、地上部分和植株總干重積累。試驗(yàn)獲得7株具有顯著促生效果的PGPR菌株，占總菌株數(shù)量的38.89%。

解鉀細(xì)菌能釋放土壤礦物鉀，提高土壤中速效鉀含量[12]。根際土壤速效鉀與煙葉含鉀量極顯著正相關(guān)[4]。使用18株P(guān)GPR菌株接種處理的煙草葉片含鉀量均高于施用50%鉀肥的對(duì)照，其中14株效果顯著，13株煙草PGPR處理的煙草葉片含鉀量在不同程度上高于施用100%鉀肥的對(duì)照，說(shuō)明解鉀PGPR菌株能夠促進(jìn)煙草對(duì)土壤鉀素的吸收和利用。試驗(yàn)獲得11株P(guān)GPR能促進(jìn)植株對(duì)鉀素的吸收，大幅度提高煙草葉片含鉀量。

綜合評(píng)價(jià)對(duì)煙草生長(zhǎng)和葉片含鉀量的影響等特性，TK11、TK32、TK54、TK84、TK89 共5株高效煙草親和性菌株具有優(yōu)良的促生生理活性和促生效果，具備在煙草栽培生產(chǎn)中應(yīng)用的潛力。經(jīng)鑒定，這5株高效PGPR分屬5個(gè)屬，其中芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus sp.)是常見煙草高效解鉀菌[29,30]；而鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonassp.)、短小桿菌屬(Curtobacteriumsp.)等為本試驗(yàn)首次證明具有較強(qiáng)解鉀活性的類群。

4 結(jié)論

采用凝集素作為介導(dǎo)復(fù)篩煙草PGPR的方法具有可行性，本方法可提高獲得易于在目標(biāo)植株根部定殖的PGPR概率，大量獲得對(duì)目標(biāo)作物具有專一性的優(yōu)良PGPR菌株。綜合評(píng)價(jià)對(duì)煙草生長(zhǎng)和葉片含鉀量的影響等特性，TK11、TK32、TK54、TK84、TK89 共5株高效煙草親和性菌株具有進(jìn)一步研究和應(yīng)用的潛力。5株優(yōu)良PGPR為研發(fā)煙草專用生物鉀肥提供可靠材料，但不同PGPR菌株促生效果有差異，土壤差異可能會(huì)影響解鉀細(xì)菌的使用效果，需要進(jìn)一步考察這些菌株在田間栽培使用中的表現(xiàn)，以提供可靠的煙草專用解鉀生物肥料菌株。

致謝

安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院朱英華老師和武麗老師對(duì)本試驗(yàn)多次給予指導(dǎo)，特此致謝。

[1] 李強(qiáng), 周冀衡, 何偉, 等. 中國(guó)烤煙含鉀量的區(qū)域特征研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，37(2)：119-125.

[2] 石屹, 王樹聲, 竇玉清. 對(duì)提高我國(guó)北方煙葉含鉀量的思考[A]. 跨世紀(jì)煙草農(nóng)業(yè)科技展望和持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略研討會(huì)論文集[C]. 北京：中國(guó)商業(yè)出版社，1999.

[3] Tso T C. Production, physiology and biochemistry of tobacco plant[M]. Ideals, Inc., Beltsville, USA. 1991.

[4] 鄭勁民, 查錄云, 謝德平, 等. 河南煙區(qū)土壤供鉀特性與煙葉含鉀量[J]. 煙草科技，1994，5：29-32.

[5] 周冀衡. K+與伴陰離子(SO42-、Cl-)對(duì)煙草生長(zhǎng)和有關(guān)生理代謝的影響[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，1994，2(2)：46-53.

[6] 胡國(guó)松, 鄭偉, 王震東, 等. 烤煙營(yíng)養(yǎng)原理[M]. 北京：科學(xué)出版社，2000.

[7] 胡江春, 薛德林, 馬成新, 等. 植物根際促生菌 (PGPR) 的研究與應(yīng)用前景[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2004，15(10)：1963-1966.

[8] Senthilkumar M, Madhaiyan M, Sundaram S P, et a1.Intercellular colonization and growth promoting effects of Methylobacterium sp. with plant-growth regulators on rice(Oryza sativaL. Cv CO-43)[J]. Microbiological Research, 2009,164(1): 92-104.

[9] 孫海國(guó), 張福鎖. 小麥根系生長(zhǎng)對(duì)缺磷脅迫的反應(yīng)[J]. 植物學(xué)報(bào)，2000，42(9)：913-919.

[10] 王平, 董飚, 李阜棣, 等. 小麥根圈細(xì)菌鐵載體的檢測(cè)[J].微生物學(xué)通報(bào)，1994，21(6)：323-326.

[11] Leong J. Siderophores: their biochemistry and possible role in the biocontrol of plant pathogens[J]. Annu Rev Phytopathol,1986, (24): 187-209.

[12] 盛下放, 黃為一. 硅酸鹽細(xì)菌NBT菌株釋鉀條件的研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，35(6)：673-677.

[13] Monib M, Zahra M K, Abdel, et a1. Role of silicate bacteria in releasing K and Si from biblite and orthoclase[J]. Soil Biology and Conservation of the Biosphere, 1984, 2: 733-743.

[14] Singh BK, Millard P, Whiteley AS, et al. Unravelling rhizosphere–microbial interactions: opportunities and limitations[J]. Trends Microbiol. 2004, 12(8): 386-393.

[15] De Hoff P, Brill L, Hirsch A. Plant lectins: the ties that bind in root symbiosis and plant defense[J]. Mol Genet Genomics.2009, 282(1): 1-15.

[16] 蔣寶貴, 趙斌. 解磷解鉀自生固氮菌的分離篩選及鑒定[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，24(1)：43-48.

[17] Glickmann E, Dessaux Y. A critical examination of the specificity of the salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria[J]. Applied and environmental microbiology, 1995, 61(2): 793-796.

[18] Schwyn B, Neilands B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores[J]. Analytical Biochemistry, 1987, 160(1): 47-56.

[19] Gordon S A, Weber R P. Colorimetric estimation of indoleacetic acid[J]. Plant Physiol, 1951, 26(1): 192-195.

[20] Turner R H, Liener I E. The use of glutaraldehyde-treated erythrocytes for assaying the agglutinating activity of lectins[J].Analytical Biochem, 1975, 68(2): 651.

[21] 王慶忠, 張鷺, 吳耘紅, 等. 14種蔬菜中凝集素的提取和生物活性研究[J]. 中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2008，8(5)：749-757.

[22] 鮑士旦. 土壤農(nóng)化分析[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2005.

[23] 東秀珠, 蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001.

[24] John G H, Nobel R K, Peter H A. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology[M]. 9th ed. Baltimore: Williams and Wilkins Press, 1994.

[25] Antonyuk L P, Evseeva N V. Wheat lectin as a factor in plantmicrobial communication and a stress response protein[J].Microbiology, 2006, 75(4): 470-475.

[26] Yegorenkova I V, Konnoval S A, Sachuk V N, et a1.Azospirillum brasilense colonisation of wheat roots and the role of lectin-carbohydrate interactions in bacterial adsorption and root-hair deformation[J]. Plant and soil, 2001, 231(2): 275-282.

[27] 夏覓真, 馬忠友, 齊飛飛, 等. 棉花根際親和性高效促生細(xì)菌的分離篩選[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2008，35(11)：1738-1743.

[28] 齊飛飛, 夏覓真, 唐欣昀, 等. luxAB基因標(biāo)記的K2116菌株在棉花根際中的定殖[J]. 生態(tài)學(xué)雜志：2008，27(2)：192-196.

[29] Liu Xiaolu, Liu Yongzhi, Yang Liuqing,et a1. Classi fi cation of Potassium-releasing Bacteria Isolated from Four Agricultural Soil Samples[J]. Journal of Pure and Applied Microbiology,2013, 7(4): 3001-3008.

[30] 張愛民, 張雙鳳,趙鋼勇, 等. 膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑的研制及在煙草上的應(yīng)用[J]. 河北大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，33(4)：387-393.

[31] 劉璇, 孔凡玉, 張成省, 等. 煙草根際解鉀菌的篩選與鑒定[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2012，33(3)：28-31.

[32] Yang Suijuan, Zhang Xinghai, Cao Zhaoyun,et a1. GrowthpromotingSphingomonas paucimobilisZJSH1 associated withDendrobiumofficinalethrough phytohormone production and nitrogen fi xation[J]. Microbial Biotechnology, 2014, 7(6): 611-620.

[33] Subhashini D V. Antifungal activity ofStreptomycesspp.against different plant pathogenic fungi of tobacco[J]. Indian journal of plant protection, 2015, 43(4): 474-476.

Screening of af fi nity PGPRs from tobacco root and their growth-promotion effects on tobacco

GONG Wenxiu, CAO Yuanyuan, NI Haiting, SUN Leni, TANG Xinyun
College of Life Science, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China

[Objective] This paper aims to screen affinity potassium-solubilizing bacteria PGPR strains from tobacco, and to examine their e ff ects on growth and potassium content in leaf tobacco. [Method] Potassium-solubilizing bacteria culture and tobacco lectin methods were applied, and tobacco affinity potassium-solubilizing strains with a high potential for growth-promoting were selected from healthy tobacco seedlings rhizosphere soil. Strains with excellent potassium-solubilizing capability were selected by the potassium-solubilizing capability. E ff ects of the strains on growth and potassium content in leaf tobacco were investigated with pot experiment. [Result] The number of tobacco-affinity bacteria accounted for 84.11% of all isolates; 18 PGPR had strong capacity to solubilize potassium, and produced IAA and siderophore. Seven PGPR strains signi fi cantly promoted root growth and the accumulation of root and aerial parts dry matter of tobacco seedling. Eleven PGPR strains helped plant absorb more potassium, substantially increase potassium content in tobacco leaves. Potassium contents in tobacco leaves treated with these strains were much higher than those of the control with same level of potassium fertilizer dose, and even higher than those of control with 100% potassium fertilizer application. Being evaluated comprehensively with the parameters of the promotion on growth and potassium content of tobacco leaf and other characteristics, TK11, TK32, TK54, TK84 and TK89 were considered efficient affinity tobacco strains, and had the potential for further research and applications. Five efficient PGPR were identi fi ed and categorized into 5 genera.[Conclusion] Tobacco lectin can be used as an e ff ective tool for screening high-efficiency tobacco PGPR, and 5 excellent PGPR obtained provide a reliable material for the development of the tobacco-speci fi c potassium-solving fertilizer.

tobacco; potassium solving ability; affinity; PGPR; potassium content of leaf

龔文秀,曹媛媛,倪海婷,等. 煙草親和性解鉀PGPR篩選及促生效果研究[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2016,22（1）

國(guó)家自然基金(No. 41401269)、安徽省高校青年基金重點(diǎn)項(xiàng)目(No. 2013SQRL015ZD)、安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)穩(wěn)定和引進(jìn)人才基金（No.yj2011-25）、安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)校青年科研基金（No. 2012zr006）

龔文秀（1989—），碩士，微生物生理學(xué)研究方向，Email：gong.wenxiu@163.com

曹媛媛（1980—），副教授，微生物生理學(xué)研究方向，Email：caoyy721@sina.com

2015-04-07

: GONG Wenxiu, CAO Yuanyuan, NI Haiting, et al. Screening of affinity PGPRs from tobacco root and their growth-promotion e ff ects on tobacco [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016,22(1)