骨髓間充質干細胞與內皮細胞平面共培養促進微血管網形成的初步研究

張磊　付煒　張文　白潔　馮蓓　唐梓清　張海波

骨髓間充質干細胞與內皮細胞平面共培養促進微血管網形成的初步研究

張磊付煒張文白潔馮蓓唐梓清張海波

目的研究大鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs）與內皮細胞（ECs）在不使用Matrigel等基質，以及在含或不含血清的條件下，于普通平面培養皿上共培養的成網能力，為日后兩類細胞相互作用的研究提供一種外界干擾最少的共培養條件。方法以全骨髓貼壁培養法分離培養大鼠BMSCs，并從培養形態、細胞表面標記物和三系分化能力等方面予以鑒定。以添加或不添加10%FBS的低糖DMEM為培養液，將大鼠BMSCs與ECs共培養于普通平面培養皿上，連續觀察微血管網的形成過程，并通過CM-Dil標記特定細胞的方法了解血管網中細胞構成。平滑肌細胞標記物SM22α，Calponin及內皮細胞標記物CD31被用于檢測上述條件下微血管網中細胞標記物變化。結果通過全骨髓貼壁培養可分離并獲得大鼠BMSCs。在含10%FBS條件下，細胞于普通平面培養皿上共培養8 d可形成明顯的微血管網，微血管網由大鼠BMSCs和ECs共同構成；在無血清共培養條件下，大鼠BMSCs和ECs可于24 h內共同參與形成微血管網。免疫熒光染色顯示CD31+細胞和SM22α+/Calponin+細胞共同構成網狀結構。結論在普通平面培養皿上，以含血清或不含血清的培養液共培養大鼠BMSCs和ECs均可形成微血管網。

骨髓間充質干細胞內皮細胞共培養微血管網

組織器官中的微小血管是保障組織正常生理代謝和養料供給的重要結構。然而，體外新構建的組織工程組織或器官，一般尚缺乏微小血管，因此體內移植后早期的營養供給主要依靠周圍組織液滲透。但溶解的氧氣向組織中滲透的深度不到200μm[1]，因此對于大部分組織工程組織或器官，是否具有或能否快速形成微小血管，是其移植成功的關鍵，也一直是組織工程研究的重要課題[2]。

為了實現組織工程組織的血管化，提出了支架材料改造、添加促血管生成相關因子[3]、體內預血管化[4]等方法。這些方法基于新生血管形成的基本環節，其特征是材料或組織植入后，自體滋養血管緩慢長入，但效率較低。近年來，于體外直接構建組織微血管，尤其是基于血管內皮細胞共培養的血管新生方法開始受到越來越多重視。作為參與新生血管形成的主要細胞，內皮細胞可與血管平滑肌相互作用：共培養體系中，前者可促進平滑肌細胞增殖，并提高平滑肌中α-SMA及Calponin等標記物的含量[5]。當內皮細胞與血管周細胞、脂肪基質細胞等具有干細胞性的間質細胞共培養時，體外可自發形成微血管網[6]。由于這種微血管網的形成被認為是血管新生的重要過程，因此在體外實驗中，是否觀察到這種自發形成的微血管網，是評價內皮細胞與另一種細胞共培養后能否可以促進新生血管形成的標志[7]。

盡管自發形成的微血管網已被證明是共培養的內皮細胞與其中的間充質干細胞直接接觸后相互作用的結果，并與該過程中細胞分泌的白細胞介素1β（IL-1β）、IL6等細胞因子有關[8]，但隨著研究的深入，共培養條件對微血管網形成的影響受到關注。Li等[9]認為，傳統的基質膠（Matrigel）作為研究共培養體系中微血管形成的支持基質是不合適的，因此他們有意識地選擇普通培養皿作為共培養載體，以排除基質膠對其他細胞的非特異性促微血管網形成作用[10]。另外，作為培養液常用的添加物，胎牛血清（FBS）對微血管網形成的影響也開始受到重視[11]。但事實上，多數研究依然添加FBS，并使用含內皮細胞支持成分的培養液，這都可能對研究間充質干細胞與內皮細胞共培養的相互作用造成潛在影響。

本研究中，我們以大鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs）和內皮細胞（ECs）為實驗對象，在普通平面培養皿中直接共培養，并以添加或不添加FBS的低糖DMEM為培養液，探索上述細胞在較單一的外界條件下自發形成微血管網的能力，為今后研究上述細胞的相互作用，提供外界作用最少的共培養條件。

1　材料與方法

1.1材料

體質量（150±10）g雄性清潔級SD大鼠（上海斯萊克實驗動物有限公司）。大鼠主動脈內皮細胞（Cell Application公司，cat.#R304K-05a）。

低糖DMEM培養液（Hyclone，美國），胎牛血清（Novogen，澳大利亞），OriCellTMSD Rat Mesenchymal Stem Cell Condrogenic Differentiation Medium、Osteogenic Differentiation Medium、Adipogenic Differentiation Medium（OriCell，美國），抗大鼠CD11b、CD29、CD31、CD44、CD45單抗（eBioscience，美國），CellTrackerTMCM-Dil（Invitrogen，美國），Anti-SM22 alpha antibody、Anti-CD31[HEC7]antibody、Calponin、Donkey Anti-Mouse IgG H&L、Donkey Anti-Rabbit IgG H&L（Abcam，美國）。

1.2方法

1.2.1大鼠BMSCs的分離和培養

采用全骨髓貼壁法分離培養大鼠BMSCs[12]：將大鼠頸椎脫臼處死后，完全浸泡于75%乙醇，10 min后取出。在無菌條件下完整分離大鼠股骨或脛骨。取出的股骨或脛骨用低糖DMEM培養液清洗后，轉入10 m L含10%FBS和1%青霉素/鏈霉素的低糖DMEM培養液中。用止血鉗夾碎骨骼一端，再用10m L無菌注射器抽取培養液，從骨骼斷端插入，反復沖洗出骨髓。將所得的含骨髓的培養液轉移到10 cm培養皿中，置于37℃、含5%CO2的培養箱靜置恒溫培養。原代細胞靜置培養24 h后換液，換液時用PBS洗去培養皿底部不貼壁的細胞。以后每2天換液，細胞達到60%～70%融合時傳代。傳代后的細胞每2～3天換液，當其達到70%融合后再傳代。第3代大鼠BMSCs用于后續實驗。

1.2.2大鼠BMSCs的鑒定

由于大鼠BMSCs在不同的培養階段具有特定的細胞形態，因此原代和傳代后的大鼠BMSCs可通過倒置相差顯微鏡觀察，予以形態學方面的鑒別。為了解分離培養細胞的表面標記物，第3代大鼠BMSCs用胰酶消化后重懸于200μL PBS，根據試劑操作說明，分別加入抗大鼠CD11b、CD29、CD31、CD44和CD45單抗[13]，于4℃條件下避光孵育30min。標記細胞用PBS洗滌后，通過流式細胞儀對其表面標記物予以鑒定[14-15]。未標記的細胞作為陰性對照。為了驗證上述獲得的大鼠BMSCs具有三系分化能力，我們按照OriCellTMSD Rat Mesenchymal Stem Cell Condrogenic Differentiation Medium、Osteogenic Differentiation Medium和Adipogenic Differentiation Medium說明書的指導方案，分別誘導其成骨、成脂肪和成軟骨，并完成特殊染色。

1.2.3大鼠BMSCs和ECs的共培養

根據我們預實驗的結果和類似文獻的報道，我們將大鼠BMSCs和ECs按照4.0×104cells/cm2和1.3×104cells/cm2的密度種植于6孔板，以含10% FBS和1%青霉素/鏈霉素的低糖DMEM為培養液，分別于共培養24 h、48 h、4 d和8 d動態觀察微血管網的形成情況。為了進一步觀察兩種細胞在無血清培養條件時的成網能力，以相同的實驗方法，將細胞培養于僅添加有1%青霉素/鏈霉素的低糖DMEM培養液中培養觀察。

1.2.4微血管網的細胞來源構成

為了解何種細胞參與構成了微血管網，實驗中將其中一種細胞標記紅色熒光，再按照上述有血清條件下共培養的方法培養8 d，最后通過熒光顯微鏡觀察，標記有紅色熒光的細胞在微血管網結構中的定位。具體方法是，以PBS重懸待染色的細胞至1.0×106cells/mL，每毫升細胞液加入5μL CM-Dil染液。將標記的細胞置于37℃培養箱孵育5 min后，再轉移至4℃冰箱孵育15 min，完成細胞熒光標記。處理后的細胞用PBS洗滌2次。實驗時，將標記有CM-Dil的大鼠BMSCs與未標記的ECs，或標記有CM-Dil的ECs和未標記的大鼠BMSCs按上述已確定的比例混合，并以含10%FBS培養液共培養，8 d后用熒光顯微鏡觀察標記細胞的分布。將標記有CM-Dil的ECs和未標記的大鼠BMSCs共培養于無血清低糖DMEM培養液，24 h后用熒光顯微鏡觀察帶熒光細胞與未帶熒光細胞間的定位關系。1.2.5共培養體系中的細胞分化

為了解共培養體系中大鼠BMSCs的表型變化，我們以相同的種植密度，將大鼠BMSCs和ECs共培養于24孔板中，以含10%FBS的培養液共培養8 d后固定，完成免疫熒光染色。在無血清培養條件下，共培養24 h后，完成免疫熒光染色。實驗中內皮細胞標記物CD31被標記為紅色，平滑肌細胞標記物calponin或SM22α標記為綠色；最后用DAPI套染細胞核。

2　結果

2.1大鼠BMSCs的培養

原代細胞在培養皿中培養3 d后，倒置相差顯微鏡下可見貼壁細胞呈棒狀或紡錘狀，細胞聚集呈克隆樣生長（圖1A）。培養至第7天時，細胞克隆變大，細胞增多（圖1B）。細胞傳代后，細胞分散生長，呈長梭形（圖1C）。

2.2大鼠BMSCs的細胞表面標記物檢測和三系分化能力鑒定

以流式細胞技術對第3代大鼠BMSCs的幾種表面標記物予以鑒定。結果表明，分離培養的細胞CD11b、CD31、CD45呈陰性，CD29、CD44為陽性（圖2A）。我們還進一步檢測了該大鼠BMSCs的三系分化能力。細胞成脂誘導4周后，可見細胞中出現大小不一具有強折光性、且能被油紅O染為紅色的脂滴。細胞成骨誘導3周，可見由茜素紅S染為紅色的鈣鹽沉積。細胞軟骨誘導4周可形成堅實的軟骨球，通過免疫組化染色，可見棕色染色的Ⅱ型膠原，證明有軟骨細胞生成（圖2B-D）。通過上述細胞形態、表面標記物、三系分化能力等方面的鑒定，我們認為，通過大鼠全骨髓貼壁法可獲得較純的大鼠BMSCs。2.3大鼠BMSCs和ECs普通平面培養皿上共培養

將兩種細胞按既定的比例混合，以含10%FBS的低糖DMEM培養液，在普通平面培養皿上培養，第4天可見共培養體系中部分細胞開始聚集成條索網狀，到共培養第8天，條索中聚集的細胞增多，相互間開始連接成網，表明微血管網形成，且明顯高出周圍的細胞（圖3A-D）。相同條件下，單獨培養的ECs或大鼠BMSCs在整個過程中僅表現為細胞數量增多，長滿培養皿，未見條索樣微血管網形成（圖3E-F）。

2.4大鼠BMSCs和ECs平面共培養后的細胞表型變化

為了解共培養微血管網形成后的細胞表型變化，我們通過免疫熒光染色對內皮細胞標記物CD31、平滑肌細胞標記物SM22α和Calponin進行染色。單獨培養于含血清培養液中的內皮細胞，其CD31+，SM22α-和Calponin-；而單獨培養的第3代大鼠BMSCs基本不表達SM22α及Calponin。上述兩種細胞在含血清培養液中共培養8 d后，可見微血管網形成。免疫熒光染色顯示，血管網條索中存在CD31+細胞（圖4A）；同時出現大量SM22α+及Calponin+細胞。這些具有平滑肌細胞標記物的細胞，大部分位于微血管網狀結構上（圖4B-C），表明微血管出現的同時，其構成細胞向平滑肌發生分化，分化的細胞聚集構成微血管網。

2.5微血管網的細胞來源構成

為了解共培養體系中微血管網的細胞構成來源，我們首先用CM-Dil活細胞染料將大鼠BMSCs標記紅色熒光，再與未標記的ECs共培養。共培養第8天，微血管網形成，熒光顯微鏡觀察見微血管網結構中紅色熒光標記的大鼠BMSCs（圖5A-C）。我們將ECs單獨用CM-Dil標記紅色熒光，并與未標記的大鼠BMSCs共培養。在第8天可見明顯的微血管網形成，且有ECs標記的紅色熒光（圖5D-F）。上述現象說明，有血清平面共培養條件下，微血管網主要由大鼠BMSCs和ECs共同構成。

2.6無血清及平面共培養下微血管網的自發形成

無血清條件下共培養可以排除動物血清成分對實驗結果的影響。因此，我們進一步將上述兩種細胞在無血清低糖DMEM培養液中培養。結果顯示，共培養17 h后細胞即可相互連接，構成明顯的網狀結構（圖6A）。對照組中，單獨培養的ECs或大鼠BMSCs在無血清培養液中無法形成類似的網狀結構（圖6B-C）。用CM-Dil標記ECs，與未標記的大鼠BMSCs共培養后，還可以觀察到帶紅色熒光的ECs及不帶熒光的大鼠BMSCs共同參與形成微血管網（圖6 D-F）。與有血清條件共培養不同的是，無血清條件下形成的微血管網于3 d內迅速消失，不能長期維持。免疫熒光染色結果顯示，網狀結構中內皮細胞標記物CD31+細胞與平滑肌標記物SM22α+或Calponin+細胞共同構成微血管網（圖6G-H）。上述實驗現象說明，兩種細胞在無血清條件下于平面培養皿中共培養依然可以自發形成微血管網。

圖1　不同培養時期大鼠BMSCs的形態（標尺：100μm）Fig.1 Them orphology of the culturing rat bonem ar row stem cells(BM SCs).(Scale bar:100μm)

圖2　大鼠BMSCs細胞表面標記物和三系分化鑒定（標尺：100μm）Fig.2 Cell surface phenotypes and trilineage differentiation of rat bonem arrow stem cells(BMSCs)(Scale bar:100μm)

圖3　大鼠BMSCs和ECs在普通平面培養皿中共培養（標尺：A-C 100μm；D-F 200μm）Fig.3 Rat bonem arrow stem cells(BMSCs)and endothelial cells(ECs)co-cultured on two-dim ensional p lastic tissue cu lture p late (Scale bars:A-C 100μm;D-F 200μm)

圖4　在含10%FBS低糖DMEM培養條件下，平面培養皿中共培養8 d后，共培養細胞的細胞表型鑒定（標尺：100μm）Fig.4 Imm unofluorescent stain ing of cellm arker of the vascular network form ed 8 days after co-cultured in m ed ium containing 10%FBS.(Scale bar:100μm)

圖5　有血清平面共培養條件下微血管網的細胞構成（標尺：100μm）Fig.5 Cell constitu tion of the vascular network from rat bonemarrow stem cells(rBMSCs)and endothelial cells(ECs)co-cultured on p lastic tissue culture p late.(Scale bars:100μm)

圖6　無血清平面共培養條件下的微血管網的形成和細胞構成（標尺：100μm）Fig.6 Vascular network form ation and cell constitution in serum-free co-culture condition on p lastic two-dim ensional tissue culture p late(Scale bars:100μm)

3　討論

BMSCs是一類來源于骨髓，具有自我更新能力和多向分化潛能的細胞。由于其容易獲取與培養擴增，因此廣泛應用于再生醫學研究。本實驗中，我們首先通過形態觀察，確認抽取培養的骨髓細胞具有BMSCs的一般特征。根據Li等[12]的描述，原代培養24 h的BMSCs呈棒狀或紡錘狀，并逐漸于原代培養第1～5天形成大小不一的細胞克隆。這與我們分離培養的原代骨髓細胞的生長形態一致。傳代后的骨髓細胞在融合后呈螺旋狀排列，也符合典型的BMSCs形態描述[12]。針對BMSCs表面標記物，我們獲取的骨髓細胞CD11b、CD31、CD45呈陰性，CD29、CD44為陽性，符合文獻中BMSCs的一般特征[13]。而三系分化實驗還證明了該骨髓細胞具有成骨、成軟骨和成脂肪潛能。因此可以認為，我們通過全骨髓貼壁分離培養的骨髓細胞是BMSCs。

盡管MSC與ECs相互作用可促進微血管網形成，但培養條件及外源物質干擾對共培養體系的潛在影響尚未獲得普遍重視。已知內皮細胞培養于基質膠中可自發形成網狀結構。因此，基質膠成管實驗被廣泛用于鑒定內皮細胞或評價干細胞向內皮細胞分化[16]。由于所用的基質膠（Matrigel）來源于Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤細胞分泌的細胞外基質，其來源情況復雜，因此基于基質膠的實驗依然存在諸多影響結果的不確定因素：一方面，在基質膠中成網并不是內皮細胞才具有的特征[10]，將含MSC細胞團的基質膠移植到裸鼠皮下后，MSC可向內皮細胞分化[17]；另一方面，不同生產來源的基質膠對內皮細胞的作用也不盡相同，甚至產生截然不同的結果[18]。因此，在本實驗中，我們采用了以普通培養皿平面條件下共培養的方法。這是研究細胞間相互作用最直接的方法，同時也避免了基質膠引起的不確定的實驗結果。實驗表明，平面培養皿中的BMSCs和ECs，在含10%FBS低糖DMEM培養液中共培養8 d，即可明顯聚集成由BMSCs與ECs共同組成的微血管網。這與Merfeld-Clauss等[11，19]的實驗結果一致。他們將ECs與脂肪間充質細胞在二維條件下共培養6 d后可見明顯的微血管網。

無血清培養從培養液層面杜絕了血清中復雜成分對實驗結果可能造成的影響。研究發現，BMSCs可于無血清MEM培養液中培養2～4周，且不影響其增殖和分化能力[20]。在此基礎上，我們設想將BMSCs和ECs在平面共培養于單純DMEM培養液中，以探索無血清DMEM作為培養液時是否仍能形成微血管網。結果顯示，共培養的細胞依然可以相互連接形成網狀結構，然而與含血清培養液共培養條件下形成的細胞網不同，無血清條件下微血管網形成的時間更短（24 h以內）、參與形成微血管網的細胞更少、穩定維持的時間變短（＜3 d）。但可以確定的是，微血管網依然由BMSCs與ECs共同形成。

在不同的共培養條件及時間下，共培養體系中自發形成的微血管網的特征不同。總結文獻報道中的網絡形態，在培養皿中二維共培養的細胞，在共培養24 h內形成者，微血管網條索細，由單細胞相互連接形成[9]。而長時間（如1周左右）共培養下形成的微血管網條索中則聚集有大量細胞，因而粗大，且可以觀察到中間包圍的未被募集的平滑肌細胞標記物陰性的細胞[11]。這與我們實驗中出現的兩類微血管網形態一致。

共培養細胞的直接接觸是間充質干細胞-內皮細胞網形成的必要條件[19]。在其形成過程中，還會發生細胞表型變化。我們的實驗中，隨微血管網出現的還有參與其構成的SM22α+和Calponin+細胞，且該細胞的出現與培養液條件無關。既往的研究將臍血間充質干細胞與內皮細胞在Matrigel中培養，可觀察到共培養體系細胞中SM22、SMA這類平滑肌細胞相關基因表達增高[21]。有研究指出，間充質干細胞與內皮細胞接觸共培養后，間充質干細胞內TGF-β表達上調。Hirschi等將具有多能性10T1/2細胞與內皮細胞共培養，發現前者可新表達SM22α與Calponin等平滑肌標記物。這與TGFβ誘導10T1/2細胞表達平滑肌細胞標記物結果類似；而中和共培養體系中的TGFβ則可阻斷平滑肌細胞標記物的表達[22]，并阻斷這兩種細胞在Matrigel共培養體系中微血管網的形成[23]。Lin等[24]通過在脂肪間充質干細胞與內皮細胞共培養體系中加入TGFβ1受體阻斷劑后，不僅微血管網形成明顯受到抑制，還可下調內皮細胞VEGF、VE-cadherin等因子的表達。另外，間充質干細胞還可被VEGF誘導分化為內皮細胞[25]。

綜合上述實驗結果，我們認為，大鼠BMSCs與ECs在普通平面培養皿中，以添加或不添加10% FBS的低糖DMEM為培養液共培養，可以觀察到明顯的自發微血管網形成。這說明上述條件可以作為研究這兩種細胞相互作用的“最低條件”，以獲得最直接和準確的實驗結果。但我們的實驗也還存在不足，比如尚未觀察到共培養體系中細胞趨化遷移的過程，也不能明確證明共培養后CD31+，SM22α+或Calponin+細胞來源于何種細胞，以及共培養前后的定量關系。這些問題還將在今后的研究中逐步完善。

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Two-D imensional Co-Culture of Bone M arrow Mesenchymal Stem Cells and Endothelial Cells for Inducing the Self-Assemb led Vascular Network

ZHANG Lei1,FU Wei1,2,ZHANG Wen1,BAI Jie1,2,FENG Bei1,2,TANG Ziqing1, ZHANG Haibo1.1 Department of Pediatric Cardiothoracic Surgery;2 Institute of Pediatric Translational Medicine,Shanghai Children's Medical Center,School of Medicine,Shanghai Jiaotong University,Shanghai200127,China.Corresponding author: ZHANGHaibo(E-mail:haibo.z@yahoo.com).

Objective To observe the vascular network formation by co-culturing rat bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)and endothelial cells(ECs)under conditions of two-dimensional co-culturing with/without serum,which would provide a minimum basal co-culture condition for the further study of the interactions between the cells.M ethods Rat BMSCs were isolated by direct adherence of the whole bonemarrow,and were identified by cellmorphology,cell surface antigens and three-lineage differentiation.Low-glucose DMEM with/without 10%FBSwas used during the co-culture of rat BMSCs and ECs,followed by a consecutive observation of the vascular network formation.CM-Dil solely labeled rat BMSCs or ECs were then co-cultured to verify the cell type within the network.Finally,immunofluorescent staining of EC marker CD31 and smoothmuscle cellmarker SM22αand Calponin was used to identify the cell differentiation during the co-culture. Resu lts Whole marrow direct adherence was used to isolate rat BMSCs successfully.With medium containing 10%FBS, co-cultured cells assembled vascular network in 8 days,which was formed together by rat BMSCs and ECs.In serum-free medium,however,self-assembled vascular network was formed together by co-cultured cells within 24 hours.In both settings,CD31+cells and SM22αor Calponin weremostly seen in the network structure.Conclusion Rat BMSCs and ECscan be co-cultured on two-dimensional plateswith/without serum-containingmedium for the induction of the self-assembled vascular network.

Bonemarrow mesenchymal stem cell;Endothelial cell;Co-culture;Vascular network

Q813.1+2

A

1673－0364（2016）05－0269－08

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.05.001

國家自然科學基金（31200735）；上海市科委基金（134119a0400，15411966800）；上海衛生和計劃生育委員會項目（20144Y0166）；東南大學生物電子學國家重點實驗室開放研究基金。

200127上海市上海交通大學醫學院附屬上海兒童醫學中心心胸外科（張磊，付煒，張文，白潔，馮蓓，唐梓清，張海波）；兒科轉化醫學研究所（付煒，白潔，馮蓓）。

張海波（E-mail：haibo.z@yahoo.com）。

（2016年8月14日；

2016年9月27日）