吡蟲啉與人血清白蛋白相互作用熱力學行為

郭清蓮潘凌立楊立云何 歡張業中劉 義,*

（1武漢大學中南醫院，武漢 430071；2黃石市中心醫院，湖北 黃石 435002；3武漢大學化學與分子科學學院化學系，武漢 430072）

吡蟲啉與人血清白蛋白相互作用熱力學行為

郭清蓮1潘凌立2楊立云3何 歡3張業中3劉 義3,*

（1武漢大學中南醫院，武漢 430071；2黃石市中心醫院，湖北 黃石 435002；3武漢大學化學與分子科學學院化學系，武漢 430072）

在模擬人體生理條件下，綜合利用熒光光譜、紫外吸收光譜、圓二色譜和分子模擬等方法，研究了吡蟲啉（IMI）和人血清白蛋白（HSA）相互作用的熱力學行為。熒光光譜和紫外吸收光譜的分析表明：吡蟲啉能有效猝滅HSA的內源熒光，猝滅機制為靜態猝滅；通過所獲取的相互作用熱力學參數，可知兩者之間的相互作用是一個吉布斯自由能降低的自發過程，且二者之間的主要作用力為氫鍵和范德華力。位點競爭實驗和分子模擬的結果表明：吡蟲啉在HSA的主要結合位置為位點I。圓二色譜、同步熒光光譜和三維熒光的分析發現：吡蟲啉引起HSA的構象發生改變，其α-螺旋含量降低，無規卷曲含量升高，肽鏈結構在吡蟲啉的作用下有所伸展。

吡蟲啉； 人血清白蛋白； 相互作用； 熱力學參數

1 引 言

蛋白質是生物體內具有重要生理功能的大分子，對一切生命過程都起著至關重要的作用，也是生命科學研究的重要對象1,2。血清白蛋白是血液中最豐富的載體蛋白，它具有貯運內源和外源化合物的作用3,4。許多生物活性物質，如代謝物、醫藥及其他有機物，與血清白蛋白的親和性，影響它們在體內的分布和新陳代謝5–8。研究白蛋白與藥物分子的相互作用，可以了解藥物在體內的運輸過程以及作用機制，對藥物化學和藥物分子設計具有重要的意義。

吡蟲啉（imidacloprid） ［1-（6-氯-3-吡啶甲基）-N-硝基咪唑烷-2-基胺］作為一種新型氯代煙堿類殺蟲劑，可以選擇性地抑制煙酸乙酰膽堿酯酶的受體，進而阻斷昆蟲神經系統的正常傳導，起到殺蟲作用9–11。一般認為吡蟲啉對哺乳動物低毒，但越來越多的證據顯示其嚴重的毒副作用，如可以產生基因毒性和免疫毒性12,13。隨著吡蟲啉農藥的長期大量使用，勢必會影響人體的健康，吡蟲啉對人類的毒性作用，可以導致定向障礙、嗜睡、頭暈、心悸和嘔吐，嚴重的會造成心動過緩和心肺驟停14。吡蟲啉還會破壞成年人的內分泌，干擾性腺類固醇性能，從而影響成年人的生殖系統15。研究吡蟲啉與蛋白質的結合，有助于了解吡蟲啉在體內的分布和代謝情況，對于闡明吡蟲啉對人的毒副作用機制具有重要意義。近年來，吡蟲啉與蛋白質作用引起了國內外許多研究人員的關注。Kazuhiko等16通過電化學與計算模擬的方法，研究了吡蟲啉與α4β2煙堿乙酰膽堿受體的相互作用，發現吡蟲啉主要結合在α4β2煙堿乙酰膽堿受體的loop C和loop D區域。Sun等14通過熒光光譜、紫外吸收光譜等手段，研究了吡蟲啉與血紅蛋白的相互作用。Ding和Peng17運用多種光譜手段和分子模擬的方法，研究了吡蟲啉對多種人體球蛋白的抑制作用。

人血清白蛋白（HSA）是血漿中最豐富的蛋白質，由585個氨基酸殘基組成。血清白蛋白是循環系統中含量最多的可溶性蛋白質，約占總蛋白的55%，在血漿中的含量約為0.05 g·mL–1, 維持血液循環系統的滲透壓。其生理功能主要表現為：維持體內生理環境相對穩定；可以結合多種藥物和生物活性小分子，便于其在血液中的運輸18。人血清白蛋白對藥物在生物體內的運輸有著重要的生理作用，無論從藥物動力學還是從臨床藥理學角度，研究血清蛋白與藥物的作用有助于了解藥物的體內運輸性質和作用機制。當然，從當今藥物研發的過程和經驗來看，新藥發現始于化學，但離不開藥理學的指導和臨床醫學的檢驗。

本文選擇人血清白蛋白作為模型蛋白，利用多種光譜手段和分子模擬的方法，研究了血清白蛋白與吡蟲啉的相互作用機制，獲取了兩者相互作用的系列熱力學參數、結合位點和作用力類型等，并研究了吡蟲啉對人血清白蛋白構象的影響。

2 實驗部分

2.1 儀器和試劑

帶恒溫系統的 Perkin Elmer LS55 熒光光度計（美國Perkin Elmer公司），TU-1901紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司），圓二色（CD）光譜儀（英國應用光物理公司），BS110S電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司），Milli-Q Advantage A10超純水系統（美國Millipore公司）。

采用Sybyl 8.1中Surflex-Dock模塊進行計算模擬，軟件購自Tripos公司，運行環境為CentOS系統。

人血清白蛋白（HSA）（電泳純試劑）購自Sigma公司，吡蟲啉（IMI）購自沙隆達農藥公司。HSA溶液均用濃度為0.05 mol·L–1，pH = 7.4的Tris-HCl緩沖溶液配成，保存于4 °C的避光處。三羥甲基氨基甲烷（Tris, 2-amino-2-（hydroxymethyl）-1,3-propanediol）純度不低于99.5%，NaCl、HCl等均為分析純。吡蟲啉溶液用無水乙醇配成，在整個實驗中的水均為Millipore純水。

2.2 實驗方法

2.2.1 熒光光譜

熒光猝滅光譜：設定激發波長為λex= 280nm，激發狹縫寬度為15 nm，發射狹縫寬度為4.0 nm。在模擬人體生理條件下，測定加入不同量的IMI時HSA的熒光發射光譜，記錄溫度為292、298、304、310 K，波長在300–450 nm范圍內的熒光發射光譜。為了避免濾波效應，在實驗中使用極稀溶液（HSA 2.0 × 10–6mol·L–1， IMI 的濃度范圍為0–1.6 × 10–5mol·L–1）。

位點競爭實驗：選擇華法林（warfarin）和布洛芬（ibuprofen）兩種熒光探針作為位點標記劑來研究IMI和HSA之間的結合位點。HSA的濃度固定為2 × 10–6mol·L–1，然后在HSA-warfarin或HSA-ibuprofen的混合物中，逐漸滴加IMI。設定激發波長為λex= 280 nm，記錄波長為300–475 nm范圍內的熒光發射光譜。

同步熒光光譜：固定Δλ = 60 nm，記錄IMI與HSA相互作用的同步熒光光譜。

三維熒光光譜：初始激發波長為200 nm，發射波長為200–500 nm，掃描次數為31，增量為5 nm，其它參數與HSA的熒光猝滅光譜一致。

2.2.2 紫外-可見吸收光譜

紫外-可見吸收光譜均用TU-1901紫外-可見分光光度計測量，波長范圍500–200 nm。

2.2.3 圓二色譜

記錄持續氮氣流條件下，室溫時波長范圍為200–260 nm內樣品的CD光譜。比色皿的光路長為0.1 mm，掃描速度200 nm·min–1。在相同實驗條件下，緩沖溶液作為空白，從樣品光譜圖中扣除，實驗的結果由SELCON3.0軟件處理。

2.2.4 分子對接實驗

HSA的晶體結構來自于數據庫Protein Data Bank （PDB），本實驗選擇了蛋白編號為1h9z的晶體結構數據19，原始晶體結構數據經去水、加氫、加電荷處理。小分子三維結構由軟件Sybyl8.1構建，并用最小能量法簡單優化。應用選擇HSA中配體的方法定義對接原型分子，配體選擇為1h9z中配體WRR2001。

3 結果與討論

3.1 熒光猝滅機制及猝滅常數

任何能夠通過相互作用（如激發態反應，分子重排，能量轉移，形成基態復合物及碰撞猝滅等）使熒光物質熒光強度下降的現象，都可稱為熒光猝滅作用20。圖1給出了pH = 7.4時在不同濃度IMI作用下的HSA的熒光猝滅光譜?？梢钥闯?，隨著IMI的不斷加入，其濃度增大，同時HSA的熒光強度逐漸降低，但最大發射波長并沒有明顯的移動，表明IMI可以有效猝滅HSA的內源熒光。

圖1 加入不同濃度IMI之后HSA的熒光發射光譜Fig.1 Fluorescence emission spectra of HSA in the presence of various concentrations of IMI

通常，熒光猝滅過程被認為是猝滅劑和熒光團之間的碰撞過程或者是二者之間形成了復合物，即動態猝滅或者是靜態猝滅21,22。不同的猝滅機制可以根據溫度對結合常數和粘度的影響及測定熒光壽命的方法來加以區分。一般情況下，對于靜態猝滅，猝滅常數KSV隨著溫度的升高而減??；相反地，對于動態猝滅，猝滅常數KSV隨著溫度的升高而增大23,24。

表1 pH = 7.4時不同溫度下IMI與HSA相互作用的猝滅常數Table 1 Quenching constants for the interaction of IMI with HSA at different temperatures and pH = 7.4

為了判斷上述體系的猝滅機制，對猝滅過程的熒光實驗結果按照Stern-Volmer方程25進行處理：

式（1）中F0和F分別表示不存在和存在猝滅劑時熒光物質的熒光強度；KSV表示Stern-Volmer猝滅常數；［Q］表示猝滅劑的濃度；kq表示生物大分子的猝滅速率常數；τ0表示不存在猝滅劑時生物大分子的平均熒光壽命。很明顯：

生物大分子的熒光平均壽命為10–8s，kq可以通過式（2）計算得到。不同溫度下KSV和kq的計算結果列在表1中。由上述的分析結果可知：KSV的值隨著溫度的升高而減小，且kq值遠大于生物大分子的最大碰撞猝滅常數（2.0 × 1010Lmol–1s–1）26，可以判斷上述實驗中的熒光猝滅是由于形成了復合物的靜態猝滅過程。

為進一步證實IMI與HSA相互作用的猝滅機制，測定了室溫條件下HSA、IMI 和HSA-IMI的紫外-可見吸收光譜（如圖2所示）。對于動態猝滅，只涉及熒光分子的激發態，因而猝滅劑對熒光物質的吸收光譜一般不產生影響；而靜態猝滅，由于基態復合物的形成，該過程一般會改變熒光物質的吸收光譜27。顯然，HSA的吸收光譜在加入IMI前后發生了改變，進一步證明了IMI對HSA的猝滅是靜態猝滅過程。

圖2 IMI與HSA相互作用的紫外-可見吸收光譜Fig.2 UV-Vis absorption spectra of interaction of HSA and IMI

對于靜態猝滅過程，可以使用修正的Stern-Volmer方程，進一步分析熒光猝滅數據28：式中，ΔF表示體系在無猝滅劑與猝滅劑濃度為［Q］時的熒光強度的差值；fa表示熒光團可接近猝滅劑的部分；Ka表示有效猝滅常數，此值相當于IMIHSA作用體系的結合常數。圖3顯示了F0/ΔF與1/［Q］呈線性關系，且計算得到的相應的Ka值列于表2中。從表2可以看出：隨著溫度上升，Ka值下降，表明盡管IMI和HSA發生了結合作用，但當溫度升高時其作用力減弱。

圖3 pH = 7.4時四個不同溫度下IMI猝滅人血清白蛋白熒光的修正Stern-Volmer曲線Fig.3 Modified Stern-Volmer plots for the quenching of HAS by IMI at four different temperatures and pH 7.4

表2 不同溫度下IMI與HSA相互作用的熱力學參數Table 2 Thermodynamic parameters of the interaction of HSA and IMI at different temperatures

3.2 IMI與HSA間的作用模式

通常，藥物等活性小分子與蛋白質等生物大分子之間的相互作用力可分為四類：疏水作用力、氫鍵、范德華力和靜電作用力29。為了說明HSA-IMI體系的作用模式，計算了四個不同溫度下的熱力學參數（ΔH、ΔS、ΔG），根據熱力學參數的符號和大小可以得出相互作用的主要的作用力類型。利用van't Hoff方程30，可以計算反應的焓變ΔH和熵變ΔS：

其中，Ka為相應溫度下的有效猝滅常數，R是氣體常數。吉布斯自由能變（ΔG）由下式計算：

圖4 HSA與IMI相互作用的范特霍夫曲線Fig.4 Van′t Hoff plot for the interaction of HSA and IMI

如圖4所示，以lnKa對1/T作圖，由斜率和截距，可以分別計算出焓變ΔH和熵變ΔS，進而可以得到不同溫度下的自由能變ΔG，計算結果列于表2。負的ΔG值，表明結合過程是自發的。此外，ΔH

和ΔS均小于0，根據Ross理論31可以推測：在結合過程中，氫鍵和范德華力是主要作用力。

3.3 IMI在HSA上結合部位的確定

HSA由三個主要的結構域（I、II、III）組成，每個區域又包含兩個亞域（A和B）。兩個結合位點site I和siteII，分別位于亞域IIA和亞域IIIA的疏水腔內32。我們選擇華法林（warfarin）和布洛芬（ibuprofen）分別作為site I和site II位點標記物，進行位點競爭實驗，希望得到IMI在HSA上的結合部位的信息。

如圖5（B）所示，華法林加入后，HSA的熒光強度明顯下降，繼續向warfarin-HSA體系中滴加IMI，HSA的熒光強度逐漸穩定降低，但是與圖1相比，其熒光強度遠低于不存在華法林時的熒光強度。而加入布洛芬后（如圖5（A）），體系的熒光猝滅變化趨勢與未加之前相似，因此可以推斷華法林占據了部分與HSA結合的IMI的位置，布洛芬并沒有影響IMI在HSA上的結合，說明IMI在HAS上的結合位點與華法林的結合位點相同33,34。

圖5 位點探針對IMI-HSA體系的影響Fig.5 Effect of site markers on IMI-HSA system

此外，為了便于比較說明華法林和布洛芬對體系的影響，采用修正的Stern-Volmer方程，對相應的實驗數據進行了處理（如圖6所示），結果列于表3中。顯然，加入華法林標記物后，Ka值是未加時的66%；而加入布洛芬后與未加時的結合常數相近。說明華法林對IMI與HSA的結合作用會產生很大的影響，而布洛芬幾乎不產生影響。綜上，華法林與IMI競爭同一個位點，IMI與HSA的結合主要發生在site I位點上。

圖6 位點競爭實驗的修正Stern-Volmer曲線Fig.6 Modified Stern-Volmer plots of site marker competitive experiments

Site marker · 10–4Ka/（Lmol–1） R S.D. blank 5.301 0.9998 0.05 ibuprofen 4.873 0.9999 0.04 warfarin 3.021 0.9998 0.08

3.4 IMI對HSA構象的影響

3.4.1 同步熒光

同步熒光光譜可以提供關于蛋白質構象改變的信息，因為其最大發射波長的偏移與蛋白質氨基酸殘基周圍的微環境有關。當激發波長和發射波長的波長差固定為60 nm時，可以得到色氨酸殘基周圍微環境改變的信息35。如圖7所示，隨著IMI的加入，HSA-IMI體系的同步熒光光譜發生了明顯的紅移，表明IMI的加入使HSA的構象發生了一定的變化，致使色氨酸殘基所處的環境極性增強，疏水性有所減弱。

圖7 IMI與HSA相互作用的同步熒光光譜Fig.7 Synchronous fluorescence spectra of HAS in the presence of IMI

3.4.2 圓二色譜

室溫條件下，使用圓二色譜，研究HSA構象的改變，更加科學合理。如圖8所示，在208和222 nm的遠紫外區，出現兩個負的特征肩峰譜帶，這是蛋白質α-螺旋結構的特征峰36。當加入IMI后，HSA的峰強度明顯減小，說明IMI對HSA的二級結構產生了影響。

圖8 HSA-IMI體系的圓二色譜圖Fig.8 CD spectra of IMI-HSA system

表4 由SELCON3軟件分析得到的二級結構的含量Table 4 Fractions of different secondary structures determined by SELCON3 software

圖9 HSA （A）和IMI-HSA復合物（B）的三維熒光光譜Fig.9 Three-dimensional fluorescence spectra of HSA （A）and HSA-IMI complex （B）

由程序SELCON3，可以方便地計算出蛋白質各二級結構的百分比。不同摩爾比時的各二級結構的計算結果，列于表4中。當IMI和HSA的摩爾比達到12 : 1時，α-螺旋的含量從59.4%下降到57.6%，表明HSA分子的肽鏈結構在IMI的作用下有所伸展。進一步也說明了IMI與蛋白質主要多肽鏈的氨基酸殘基結合，并且破壞了蛋白質的氫鍵結構37,38。當存在和不存在IMI時，HSA的CD光譜形狀相似，表明在發生結合反應后，HSA的結構仍然主要是以α-螺旋為主。因此，IMI與HSA發生相互作用時，在一定程度上使HSA的構象發生了一定的變化。

3.4.3 三維熒光光譜

三維熒光光譜不僅可以全面展現待測樣品的熒光信息，而且可以使蛋白質特征構象變化的研究更具有科學性和可靠性。它也是另外一種證實HSA構象和微環境是否改變的方法。圖9顯示了HSA和HAS-IMI復合物的三維熒光光譜，相應的特征參數列于表5中。

圖9中，峰a為瑞利散射峰（λem= λex），且隨著IMI的加入，峰a的熒光強度降低，可能原因是IMI在血清白蛋白表面結合后，破壞了蛋白質表面的保護水層，使原來較為分散的蛋白質更加分散，即所謂的解聚作用，引起蛋白質粒徑減小，熒光強度減弱。Peak 1 （λex= 280 nm, λem= 351.0 nm）為蛋白質熒光猝滅的熒光峰，主要顯示TRP和TYR的熒光光譜行為。另外，在peak 1旁邊有一個很強的新的熒光峰peak 2 （λex= 230.0 nm, λem= 352.0 nm），主要展現的是蛋白質肽鏈結構的特征熒光行為39。在加入IMI后，peak 2的熒光強度輕微降低，說明蛋白質肽鏈結構發生了改變，這也正與CD光譜中α-螺旋結構含量的降低相吻合。表5主要反映HSA和HSA-IMI的三維熒光圖譜特征。從峰的強度看，加入IMI后，HSA的兩熒光峰強度明顯減弱，且減弱的程度有所不同。說明蛋白質的多肽有一部分解旋，在HSA水溶液中加入IMI后，IMI在改變HSA所處微環境的同時也改變了HSA的構象。

表5 HSA和IMI-HSA復合物的三維熒光光譜Table 5 Three-dimensional fluorescence spectral characteristics of HSA and IMI-HSA system

圖10 （a） IMI與HSA分子對接模型， （b） IMI周圍0.5 nm范圍內的氨基酸殘基， （c） IMI與HIS288和ARG257形成的氫鍵Fig.10 （a） Molecular docking model of IMI and HSA， （b） amino acid residues around IMI within 0.5 nm，（c） hydrogen bonds between IMI and ARG222

3.5 分子模擬

研究表明，大多數藥物分子與HSA的作用位置位于由亞結構域IIA和亞結構域IIIA的疏水腔內，即site I和site II40。IMI和HSA分子對接結果的最佳構象見圖10（a），可以看出：IMI和HSA的作用區域更趨于位于site I，即華法林位點，這與位點競爭實驗的結果一致。在0.5 nm范圍內，IMI周圍的氨基酸殘基主要有12個，如圖10（b）所示：TYR150, PHE157, SER192, LYS195, GLN196, ARG197, HIS212, ARG257, SER287, HIS288, LYS289, LEU292。此外，IMI分子上的氧原子與HIS288、ARG257的氫原子形成了氫鍵（圖10（c）黑色虛線），這有助于IMI在HSA疏水腔中穩定存在，這也與前面熱力學數據分析的結果相符合。

4 結 論

在模擬人生理條件下，研究了IMI與HSA相互作用的熱力學行為。由變溫滴定實驗可知，Stern-Volmer猝滅常數KSV和有效猝滅常數Ka均隨著溫度的升高而減小，HSA的吸收光譜也在IMI加入之后發生變化，說明IMI對HSA的猝滅是生成了復合物的靜態猝滅過程。在獲取的熱力學參數中，焓變和熵變均為負值，說明IMI與HSA之間相互作用力類型主要是氫鍵和范德華力。位點競爭實驗和分子模擬的結果表明IMI在HSA上的結合位點位于site I。同步熒光光譜、CD光譜及三維熒光光譜的結果表明IMI與HSA的結合會引起HSA構象的改變。這些研究結果為獲得蛋白質分子信息，了解吡蟲啉在體內的作用機理，提供了一些具有重要理論意義的信息。

（1）Wang, N.； Liu, Z. Y.； Hu, X. L.； Bo, F. Q.； Zhao, X. Z. Chem. J. Chin. Univ. 2011， 32 （2）, 241. ［王 寧, 劉忠英, 胡秀麗, 卜鳳泉, 趙學忠. 高等學?；瘜W學報, 2011， 32 （2）, 241.］

（2）Ding, F.； Diao, J. X.； Sun, Y.； Sun, Y. J. Agric. Food Chem. 2012， 60, 7218. doi: 10.1021/jf300424w

（3）Bekale, L.； Agudelo, D.； Tajmir-Riahi, H. A. Colloid Surf. BBiointerfaces 2015， 130, 141. doi: 10.1016/j.colsurfb. 2015.03.045

（4）Luo, Y.； Chen, T. F.； Huang, X. C.； Wang, Y.； Huang, Y. C.；Zheng, W. J. Acta Chim. Sin. 2012， 70 （11）, 1295. ［羅 懿, 陳填峰, 黃曉純, 王 弋, 黃蔭成, 鄭文杰. 化學學報, 2012， 70 （11）, 1295.］ doi: 10.6023/A1202031

（5）Andrasi, M.； Lehoczki, G.； Nagy, Z.； Gyemant, G.； Pungor, A.；Gaspar, A. Electrophoresis 2015， 36, 1274. doi: 10.1002/elps. v36.11-12

（6）Khan, A. B.； Khan, J. M.； Ali, M. S.； Khan, R. H.； Din, K. U. Colloid Surf. B-Biointerfaces 2011， 87 （2）, 447. doi: 10.1016/j.colsurfb.2011.06.007

（7）Chi, Z.； Liu, R.； Teng, Y.； Fang, X.； Gao, C. J. Agric. Food Chem. 2010， 58, 10262.

（8）Peng, Y. L.； Wang, S. J.； Fu, L.； Zhang, C. G.； Liu, X. G. Acta Phys. -Chim. Sin. 2012， 28 （5）, 1054. ［彭玉苓. 王樹軍. 傅 麗,張成根, 劉新剛. 物理化學學報, 2012， 28 （5）, 1054.］ doi: 10.3866/PKU.WHXB201202222

（9）Uhl, P.； Bucher, R.； Schafer, R. B.； Entling, M. H.； Ling, E. Chemosphers 2015， 132, 152. doi: 10.1016/j.chemosphere. 2015.03.027

（10）Zhao, J.； Wang, M. L.； Dong, B. L.； Feng, Q.； Xu, C. X. Org. Process Res. Dev. 2013， 17, 375. doi: 10.1021/op300320a

（11）Ji, R. D.； Zhao, Z. M.； Zhang, L.； Ji, L.； Zhang, J. H.； Shen, L. B.； Lan, X. F. Spectrosc. Spect. Anal. 2013， 33 （3）, 668. ［季仁冬,趙志敏, 張 林, 季 雷, 張吉華, 沈令斌, 蘭秀風. 光譜學與光譜分析, 2013， 33 （3）, 668.］

（12）Costa, C.； Silvari, V.； Melchini, A.； Catania, S.； Heffron, J. J.；Trovato, A.； De Pasquale, R. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 2009， 672 （1）, 40. doi: 10.1016/j.mrgentox. 2008.09.018

（13）Gawade, L.； Dadarkar, S. S.； Husain, R.； Gatne, M. Food Chem. Toxicol. 2013， 51, 61. doi: 10.1016/j.fct.2012.09.009

（14）Ding, F.； Han, B. Y.； Liu, W.； Zhang, L.； Sun, Y. J. Fluoresc. 2010， 20, 753. doi: 10.1007/s10895-010-0618-0

（15）Ding, F.； Peng, W.； Diao, J. X.； Zhang, L.； Sun, Y. J. Agric. Food Chem. 2013， 61, 4497. doi: 10.1021/jf3048065

（16）Kayoko, T.； Satoshi, K.； Satoshi, K.； Atsushi, Y.； Miki, A.；David, B. S.； Kazuhiko, M. Neuropharmacology 2009， 56, 264. doi: 10.1016/j.neuropharm.2008.08.022

（17）Ding, F.； Peng, W. J. Photochem. Photobiol. B-Biol. 2015， 147, 24. doi: 10.1016/j.jphotobiol.2015.03.010

（18）Wang, J.； Li, S.； Peng, X.； Yu, Q.； Bian, H.； Huang, F.； Liang, H. J. Luminesc. 2013， 136, 422. doi: 10.1016/j.jlumin.2012.12.004

（19）Petitpas, I.； Bhattacharya, A. A.； Twine, S.； East, M.； Curry, S. J. Biol. Chem. 2013， 276, 22804.

（20）Hemmateenejad, B.； Yousefinejad, S. J. Mol. Struct. 2013， 1037, 317. doi: 10.1016/j.molstruc.2013.01.009

（21）Dangkoob, F.； Housaindokht, M. R.； Asoodeh, A.； Rajabi, O.；Zaeri, Z. R.； Doghaei, A. V. Spectroc. Acta Pt. A-Molec. Biomolec. Spectr. 2015， 137, 1106. doi: 10.1016/j.saa. 2014.08.149

（22）Song, W.； Zhang, D.； Pan, X.； Lee, D. J. J. Luminesc. 2013， 136, 80. doi: 10.1016/j.jlumin.2012.11.008

（23）Li, D. W.； He, H.； Lin, B. B.； Xu, Z. Q.； Jiang, F. L.； Liu, Y. RSC Adv. 2014， 4, 3913. doi: 10.1039/C3RA46172F

（24）Li, J. H.； Wang, S. M. J. Chem. Thermodynamics 2013， 58, 206. doi: 10.1016/j.jct.2012.11.009

（25）Zaidi, N.； Ahmad, E.； Rehan, M.； Rabbani, G.； Ajmal, M. R.；Zaidi, Y.； Subbarao, N.； Khan, R. H. J. Phys. Chem. B 2013， 117, 2595. doi: 10.1021/jp3069877

（26）Gong, Q. L.； Hu, X. G.； Fang, G. Y.； Li, X. H. J. Mol. Model. 2012， 18, 493. doi: 10.1007/s00894-011-1069-5

（27）Hu, Y. J.； Yue, H. L.； Li, X. L.； Zhang, S. S.； Tang, E.； Zhang, L. P. J. Photochem. Photobiol. B-Biol. 2012， 112, 16. doi: 10.1016/j.jphotobiol.2012.04.001

（28）Markarian, S. A.； Aznauryan, M. G. Mol. Biol. Rep. 2012， 39 （7）, 7559. doi: 10.1007/s11033-012-1590-3

（29）Banerjee, M.； Chakrabarti, A.； Basu, S. Dyes Pigment. 2013， 97,446. doi: 10.1016/j.dyepig.2013.01.005

（30）Han, X. L.； Tian, F. F.； Ge, Y. S.； Jiang, F. L.； Lai, L.； Li, D. W.；Yu, Q. L. Y.； Wang, J.； Lin, C.； Liu, Y. J. Photochem. Photobiol. B-Biol. 2012， 109, 1. doi: 10.1016/j.jphotobiol.2011.12.010

（31）Ross, P. D.； Subramanian, S. Biochemistry 1981， 20 （11）, 3096. doi: 10.1021/bi00514a017

（32）Wu, X.； Liu, J.； Huang, H.； Xue, W.； Yao, X.； Jin, J. Int. J. Biol. Macromol. 2011， 49 （3）, 343. doi: 10.1016/j.ijbiomac. 2011.05.010

（33）Wang, Q.； He, J. W.； Wu, D.； Wang, J.； Yan, J.； Li, H. J. Luminesc. 2015， 164, 81. doi: 10.1016/j.jlumin.2015.03.025

（34）Zhang, Y. Z.； Dai, J.； Xiang, X.； Li, W. W.； Liu, Y. Mol. Biol. Rep. 2010， 37, 1541. doi: 10.1007/s11033-009-9555-x

（35）Azimi, O.； Emami, Z.； Salari, H.； Chamani, J. Molecules 2010， 16 （12）, 9792.

（36）Zhang, G. W.； Ma, Y. D.； Wang, L.； Zhang, Y. P.； Zhou, J. Food Chem. 2012， 133, 264. doi: 10.1016/j.foodchem.2012.01.014

（37）Chen, T. T.； Zhu, X. T.； Chen, Q.； Ge, M.； Jia, X. P.； Wang, X.；Ge, C. W. Food Chem. 2015， 186, 292. doi: 10.1016/j.foodchem. 2014.11.041

（38）Zhang, Y. Z.； Zhou, B.； Liu, Y. X.； Zhou, C. X.； Ding, X. L.；Liu, Y. J. Fluoresc. 2008， 18, 109. doi: 10.1007/s10895-007-0247-4

（39）Punith, R.； Seetharamappa, J. Spectroc. Acta Pt. A-Molec. Biomolec. Spectr. 2012， 92, 37. doi: 10.1016/j.saa.2012.02.038

（40）Tian, F. F.； Jiang, F. L.； Han, X. L.； Xiang, C.； Ge, Y. S.； Li, J. H.； Zhang, Y.； Li, R.； Ding, X. L.； Liu, Y. J. Phys. Chem. B 2010， 114, 14842. doi: 10.1021/jp105766n

Thermodynamics of the Interaction of Imidacloprid with Human Serum Albumin

GUO Qing-Lian1PAN Ling-Li2YANG Li-Yun3HE Huan3ZHANG Ye-Zhong3LIU Yi3,*
（1Zhongnan Hospital, Wuhan University, Wuhan 430071, P. R. China；2Center Hospital of Huangshi City, Huangshi 435002, Hubei Province, P. R. China；3Department of Chemistry, College of Chemistry and Molecular Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072, P. R. China）

The thermodynamics of the interaction between human serum albumin （HSA） and imidacloprid（IMI） was inνestigated using fluorescence, UV-Vis absorbance, and circular dichroism spectroscopy, in addition to molecular modeling under physiological conditions. The fluorescence quenching of HSA by IMI was a static process, which was confirmed by the UV-Vis absorption spectra. The calculated enthalpy （ΔH） and entropy （ΔS） changes implied that hydrogen bonds and νan der Waals forces played a predominant role in the binding process. Site marker competitiνe experiments along with molecular docking indicated that the binding of IMI to HSA took place primarily in site I. The circular dichroism and synchronous fluorescence spectroscopy demonstrated that the secondary structure of HSA changed after its interaction with IMI, causing the α-helix content to decrease with an increase in anunordered structure. The peptide structure extended after binding with IMI.

Imidacloprid; Human serum albumin; Interaction; Thermodynamics parameter

O642

10.3866/PKU.WHXB201511021

Received: September 21, 2015； Revised: November 2, 2015； Published on Web: November 2, 2015.

*Corresponding author. Email: yiliuchem@whu.edu.cn； Tel: +86-27-68756667.

The project was supported by the Key Project of Health and Family Planning Commission of Hubei Province, China （WJ2015MB097） and Wuhan Yellow Crane Talents Program for Science and Technology, China （2014［10］）.

湖北省衛生計生委重點項目（WJ2015MB097）和武漢黃鶴英才（科技）計劃（2014［10］）資助

?Editorial office of Acta Physico-Chimica Sinica