尿素/氧化三甲胺混合溶劑影響單壁碳納米管內部水合性質的分子動力學模擬

楊立江高毅勤,*

（1北京大學化學與分子工程學院，北京分子科學國家實驗室，北京 100871；2北京大學生物動態光學成像中心，北京 100871）

尿素/氧化三甲胺混合溶劑影響單壁碳納米管內部水合性質的分子動力學模擬

楊立江1,2高毅勤1,2,*

（1北京大學化學與分子工程學院，北京分子科學國家實驗室，北京 100871；2北京大學生物動態光學成像中心，北京 100871）

尿素是早已被人們認識的蛋白質變性劑，而氧化三甲胺則是最常用的蛋白質結構保護劑。雖然多年來被廣泛應用在生物實驗中，但是它們是如何在蛋白質結構形成中起作用，特別是氧化三甲胺是如何在高濃度尿素環境中起到抑制尿素蛋白變性作用的分子機制，至今仍然沒有得到圓滿解答。本文以單壁碳納米管為模型疏水體系，采用分子動力學模擬研究尿素/氧化三甲胺混合溶液中納米管內部水合性質，結果表明氧化三甲胺更易與水分子和尿素分子形成較強相互作用從而穩定了水溶液結構，這一結果亦表明了氧化三甲胺可以通過間接機制抵消尿素分子對于碳納米管內部水合性質的影響。

尿素；氧化三甲胺；碳納米管；水合作用；分子動力學

1 引 言

滲透調節物質（osmolytes），主要包括各種多羥基化合物、糖類、有機溶劑和多種氨基酸以及它們的衍生物1–3。這些小分子對蛋白質的折疊、結構穩定性和功能都有重要的影響2–10。盡管許多年來科學家們對于滲透調節物質的研究已經積累了大量生物化學和熱力學實驗數據，但是滲透調節物質改變蛋白質結構穩定性的分子機制仍然沒有被認識清楚。從微觀層次解釋現有生物化學研究結果，揭示滲透調節物質影響蛋白質結構形成和穩定性的分子機制是當前蛋白質科學研究中的一個重要前沿課題1。

在眾多的滲透調節物質中，尿素是一種在生物實驗中廣泛使用的蛋白質結構變性劑，而氧化三甲胺（TMAO）則是一種作用明顯的蛋白質結構的保護劑。氧化三甲胺可以有效增強蛋白質和核酸的結構穩定性，有效抑制由尿素、溫度和壓力變化等引起的蛋白質變性11–16。在過去幾十年的實驗和理論研究中，研究者對于滲透調節物質影響蛋白質結構的機制提出了很多理論和假設，其中被廣泛接受的是“直接作用”17–21和“間接作用”22–25兩種機理。所謂“直接作用”機制是指滲透調節物質通過與蛋白質的直接靜電/范德華相互作用影響蛋白質結構的形成，而“間接作用”機制的支持者則認為滲透調節物質通過與蛋白質周圍的水相互作用從而間接影響蛋白質結構的穩定性。因此“間接作用”機制支持者認為尿素是所謂的水結構的破壞劑“（structure breaker）”26，而氧化三甲胺是水結構的穩定劑“（structure maker）”27。

實際上在對滲透調節物質是如何影響蛋白質結構的研究領域，之所以至今仍然不能提出一個大家普遍認同的機理，一個重要的原因是滲透調節物小分子、水和蛋白質三者共存的體系中，各種分子之間的相互作用復雜，需要全面考慮滲透調節物小分子與蛋白質、水分子與蛋白質、滲透物小分子與水分子，滲透物小分子之間，以及水分子之間的相互作用，而其它分子與蛋白質的相互作用又需要分別考慮與蛋白質主鏈原子和支鏈原子之間的相互作用等，想要從這些紛繁復雜的相互作用中提煉出一個簡單而統一的分子層次的機制自然難度很大。過去人們之所以會提出“直接”和“間接”兩種截然不同的作用機制，一個主要原因也是由于體系中相互作用太復雜，研究者對某一個方面因素的關注，有時不可避免地忽視了其他因素。因此人們也嘗試使用適當簡化的體系來研究滲透物小分子的作用，在這樣的體系中由于分子間相互作用種類較少，所以更容易發現其中占主導地位的相互作用，從而澄清相應的分子機制。例如Zangi等21就研究了尿素分子對于簡單的疏水平面水合作用的影響，還有一些利用各種不同的輸水體系研究水合作用的工作28–30。2010年我們研究組也使用分子動力學模擬研究了滲透調節物分子對一個簡單且易于控制的疏水物質——碳納米管內部的水合作用的影響，揭示出了尿素、乙醇和氧化三甲胺等不同滲透物小分子引起碳納米管內部水分子數目變化的本質原因31。在此簡化體系理論研究的基礎上，我們還進一步研究了尿素、氧化三甲胺和四甲基脲在短肽鏈折疊中的作用，其結果也驗證了我們在簡化體系中得到的結論，強調了“間接作用”的重要性32。后續研究工作中，我們還有針對性地探討了一系列滲透調節物分子對蛋白質的溶解度、結構形成和聚集等過程的影響。用分子模擬以蛋白質在常見無機鹽、胍鹽和醇等的水溶液中的折疊作為模型體系，詳細研究了共溶劑分子或無機鹽對水溶液以及溶液環境對蛋白質折疊的影響，提出了陰陽離子協同性和氫鍵受體給體平衡的概念，解釋了包括無機鹽以及有機小分子在內的一系列滲透調節物分子對于蛋白質二級結構的影響，針對蛋白質變性和保護中的直接與間接作用提出了一個統一的分子圖像33–39。

在本篇論文的工作中我們使用分子動力學模擬研究尿素/氧化三甲胺混合溶液中碳納米管內部的水合作用，目的是更進一步理解氧化三甲胺是如何抑制尿素對于碳納米管內部水合性質的增強，并希望對此簡化模型的研究能幫助我們更深入地了解氧化三甲胺對于尿素蛋白質變性作用的抑制機制。

2 方 法

本文采用的是110個碳原子組成的“扶手椅（armchairs）”型單壁碳納米管，手性參數（6, 4），長度為1.34 nm，直徑為0.67 nm，碳納米管的初始結構由“nanotube coordinate generator”程序生成（http:// www.photon.t.u-tokyo.ac.jp）。組成碳納米管的碳原子在模型中被描述為不帶電荷的范德華粒子，其力場參數采用Hummer等40模擬中所使用的一組參數。研究中共模擬了四種類型的溶液條件：純水，4 mol·L–1尿素水溶液，4 mol·L–1氧化三甲胺水溶液和4 mol·L–1尿素/氧化三甲胺混合溶液（尿素與氧化三甲胺物質的量比為1 : 1）。四種溶液中均加入942個水分子，水分子采用TIP3P模型41，尿素和氧化三甲胺采用文獻42,43中使用的力場參數。本文采用AMBER 9分子動力學程序包對上述體系在周期性邊界條件和等溫等壓系綜下分別進行了125 ns的分子動力學模擬，體系的溫度通過Langevin動力學控溫方法維持在300 K （Langevin 動力學中使用5 ps–1的控溫頻率），體系的壓力則通過Berendsen弱耦合方法44控制在101.325 kPa，壓力控制的弛豫時間選為2 ps。模擬中使用了非鍵相互作用截斷半徑1.0 nm，長程相互作用使用particlemesh Ewald方法45處理。模擬的步長設為2 fs，因此使用SHAKE方法46限制了所有氫原子的鍵振動。

圖1 進入碳納米管內部的水分子數目（N）隨時間的變化Fig.1 Number （N） of water molecules inside the nanotube as a function of time

3 結果與討論

3.1 尿素和氧化三甲胺對碳納米管內部水合性質的影響

雖然碳納米管是疏水的，但是Hummer等47在研究中指出，碳納米管內外水分子的超額化學勢差會導致水分子進入碳納米管內部。在我們以前的研究中，為了更清楚地呈現不同滲透調節物分子對于碳納米管水合性質的影響，我們選擇了一個相對較小的碳納米管直徑（0.67 nm）31。在本文的研究中我們仍然采取相同策略，仍然使用0.67 nm直徑的碳納米管，這個尺寸剛好允許水分子進入碳納米管內部而大多數滲透調節物分子都由于分子尺寸限制無法進入。對于碳納米管在每一種溶劑中模擬了125 ns后，每一個模擬的最后50 ns的軌跡被用來做進一步的分析。首先，我們計算了在四種溶液的模擬中進入碳納米管內部的水分子數目，圖1顯示了進入碳納米管內部的水分子數目隨模擬時間的變化。

在圖1中可以觀察到模擬過程中進入碳納米管內的水分子數目在0–5之間變化，并且模擬過程中可以觀察到多次碳納米管內部水分子充滿狀態和無水分子進入的空腔狀態之間的轉換。圖1（b）的結果表明尿素分子會促進水分子更頻繁地進入碳納米管通道，通道中進入了4–5個水分子的充滿狀態占據多數情況，這與我們以前高濃度的尿素溶液（7 mol·L–1）模擬31的結果是相一致的。圖1（c）中氧化三甲胺的加入明顯減少了進入碳納米管通道的水分子，碳納米管通道很多情況下處于“干燥”的空腔狀態。圖1（d）所示的尿素/氧化三甲胺混合溶液中進入碳納米管通道內的水分子數目也比較少，但是由于尿素和氧化三甲胺對于進入碳納米管通道的水分子的促進或抑制作用的相互競爭，最后造成的結果就是在混合溶液中進入碳納米管通道的水分子數目對比單一氧化三甲胺溶劑的情況有明顯提高。通過計算四種溶液中進入碳納米管通道的平均水分子數目可以更明顯的看到上述趨勢：純水3.62，4 mol·L–1尿素溶液3.83，4 mol·L–1氧化三甲胺溶液1.43，4 mol·L–1尿素/氧化三甲胺混合溶液1.65。

圖2 尿素和水分子相對氧化三甲胺分子的徑向分布函數（RDFs）Fig.2 Radial distribution functions （RDFs） of urea and water molecules to TMAO

3.2 尿素、氧化三甲胺和水分子的相互作用

為了研究氧化三甲胺如何抑制尿素的作用，我們對尿素/氧化三甲胺混合溶液中尿素、氧化三甲胺和水分子的相互作用進行了細致分析。首先，我們計算了氧化三甲胺分子的疏水位點（甲基）和氫鍵質子受體位點（氧原子）與水分子和尿素分子的徑向分布函數，如圖2所示。從圖2（a, b）我們可以發現水分子在氧化三甲胺分子的甲基和O原子位置都有分布，顯示氧化三甲胺在混合溶液中能被水分子很好溶解。特別的，由圖2（b）水分子的氧原子在氧化三甲胺氫鍵受體位點處徑向分布函數可以明顯看到一個很突出的尖峰，這表明氧化三甲胺有很強的與水分子形成氫鍵的能力。圖2（c）和2（d）描述了尿素在氧化三甲胺分子周圍的分布，其分布函數的性狀與水分子的相應分布函數非常相似，即尿素分子也與氧化三甲胺很好的相互作用，但是圖2（d）中的第一個峰低于圖2（b）中的尖峰，這表明水分子比尿素更傾向于與氧化三甲胺發生相互作用，占據其第一溶劑化層。

圖3 水分子中氧原子在氧化三甲胺氧原子附近的徑向分布Fig.3 TMAO-water oxygen radial distribution function

作為對比，我們也計算了4 mol·L–1氧化三甲胺溶液中水分子對氧化三甲胺的徑向分布函數。圖3中對比了在4 mol·L–1氧化三甲胺溶液和尿素/氧化三甲胺混合溶液中水分子中氧原子相對于氧化三甲胺氧原子的徑向分布函數。為了更清楚地看到兩種溶液環境中徑向分布函數的不同，我們將分布函數第1個峰值處放大并畫入圖3的嵌入圖中。從放大后的對比圖可以看到混合溶液中該峰得到了輕微增強，也就是說混合溶液中水分子與氧化三甲胺的相互作用更具有優勢。

圖4 尿素/氧化三甲胺混合溶液中可能形成氫鍵原子對的徑向分布函數Fig.4 Radial distribution function of possible hydrogen bonding atoms in urea/TMAO solutions

為了表征尿素/氧化三甲胺混合溶液中各組分形成氫鍵能力的不同，我們計算了尿素/氧化三甲胺混合溶液可能形成氫鍵的原子之間的徑向分布函數，由于氧化三甲胺并不能提供氫鍵質子給體，因此它只能與溶液中水分子和尿素分子提供的氫鍵質子給體形成氫鍵。圖4（a）描述了水分子中的氫原子相對尿素分子氧原子和氧化三甲胺氧原子的徑向分布函數，我們可以發現，在第一分布峰處水氫原子在氧化三甲胺氧原子附近的分布遠遠高于尿素氧原子，這清楚地展示了氧化三甲胺比尿素更容易與水形成氫鍵。圖4（b）表征的是尿素和水中氫原子在氧化三甲胺氧原子周圍的徑向分布。結果表明氧化三甲胺更傾向于與水分子形成氫鍵，因為水分子中氫原子在氧化三甲胺氧原子第一溶劑化層的分布遠高于尿素的氫原子。

利用徑向分布函數我們也計算了尿素溶劑和尿素/氧化三甲胺混合溶劑中尿素分子第一溶劑化層中水分子的平均數目nAB，其計算公式48為

其中nAB代表距A類型原子rc距離之內的B類型原子數目，pB是體系中B類型原子的數密度。

通過比較表1中尿素和尿素/氧化三甲胺溶劑中尿素第一溶劑化層內水分子的數目，可以看到由于氧化三甲胺的競爭，在尿素/氧化三甲胺溶劑中尿素分子第一溶劑化層中要比在單一尿素溶劑中少11個水分子（考慮到尿素分子中有兩個氮原子，氮原子第一溶解層內水分子數目要乘以2）。

表1 尿素和尿素/氧化三甲胺混合溶液中尿素第一溶劑化層內水分子平均數目Table 1 Averaged number of water molecules in the first solvation shell of urea in the urea and urea/TMAO solutions

綜上所述，帶有一個氫鍵質子受體的氧化三甲胺分子非常易與水分子發生氫鍵作用，正是由于氧化三甲胺分子傾向與水分子和尿素分子形成氫鍵的特性，穩定了水分子參與的氫鍵網絡，從而使得從體相水中抽取水分子進入碳納米管內部的懲罰加大。這種通過改變水分子行為和化學勢來影響體系行為的機制和“間接作用”機制是一致的。

為了進一步研究氧化三甲胺對水分子的氫鍵網絡結構的影響，我們計算了在三種溶液中水分子的徑向分布函數，如圖5所示。在圖5（a）所示的水分子氧-氧徑向分布函數g（r）中首先我們可以看到由于共溶劑的加入，在0.277 nm位置附近出現一個非常突出的尖峰，尤其在氧化三甲胺和混合溶液中這個尖峰更加顯著。為了能更清楚的比較不同溶液中水分子的徑向分布，圖5（a）的第2和第3峰所在區域被放大顯示在圖5（b）中。在圖5（b）中很明顯可以看到混合溶液中g（r）分布介于尿素和氧化三甲胺溶液的結果之間。對于水的“structure breaker”——尿素，低平的第2和第3峰證明在尿素影響下水的結構有序性不佳，而加入氧化三甲胺后，它會奪取水分子和尿素分子的氫鍵質子給體以形成氫鍵，通過這些氫鍵的形成，尿素對水溶液結構的破壞作用得到了抑制。上述推斷從圖5（b）上看就是水的徑向分布圖上的第1和第2個山谷被降低，因此形成了較為明顯的第2和第3個峰，這也意味著更加有序的水結構（徑向分布圖上較突出并向外偏離零點的分布峰代表有序的結構，而不明顯并偏向零點的分布峰則代表較混亂的結構）。

除了從徑向分布函數角度考量，在不同溶液中水分子氫鍵或者氫鍵網絡的穩定性也可以通過計算形成氫鍵的原子之間的距離和角度分布來判斷。如圖6所示尿素/氧化三甲胺混合溶液中，水形成的氫鍵的距離和角度分布更接近氧化三甲胺的結果，即更短的作用距離和更大的作用角度，這也證明了混合溶液中氧化三甲胺使得水分子能形成更短也更強的氫鍵相互作用。

為了對比不同溶液環境中各組分形成氫鍵的情況，我們對三種包含共溶劑的溶液中氫鍵形成情況做了統計（見表2）。判斷氫鍵形成的標準同圖6的圖注所述。

由形成氫鍵數目的對比可知，在尿素/氧化三甲胺混合溶液中由于氧化三甲胺具有很強的與水形成氫鍵的能力，所以它會與尿素分子競爭水分子以形成氫鍵，另一方面氧化三甲胺分子也會與尿素分子的氫鍵給體形成氫鍵，從而進一步減少尿素分子與水分子形成氫鍵的能力。而尿素分子與水形成的氫鍵的減少（減少了尿素對水分子結構的破壞作用）和氧化三甲胺與水生成氫鍵對于水分子氫鍵網絡的穩定作用，同時造成了混合溶液中尿素增強碳納米管內部水合作用的消失。其實通過本文中模擬觀察到的現象也是符合我們所提出的蛋白質結構破壞劑和保護劑的氫鍵受體給體平衡40概念的。氫鍵受體給體平衡強調分別富含質子受體和給體的共溶劑對于蛋白質二級結構會有保護和破壞兩種截然相反的作用，比如富含氫鍵給體的尿素和胍鹽就是兩類典型的蛋白質結構破壞劑，它們通過增加溶液中自由氫鍵給體，以直接和間接作用的方式增強氨基酸氨基的水溶性使蛋白質結構遭到破壞。而相對的，醇類和氧化三甲胺等富含氫鍵受體的分子則通過減少溶液中自由氫鍵給體，降低蛋白骨架的水溶性來達到保護蛋白質二級結構的作用。通過對本文四種溶劑體系中平均每分子所帶自由氫鍵給體和受體的計算比較（表3），我們可以看到對比純水體系尿素溶劑中尿素略微提高了自由氫鍵給體的數目，而氧化三甲胺溶劑中由于氧化三甲胺只提供氫鍵受體，所以體系中自由氫鍵受體數目大大增加而自由氫鍵給體數目減少。尿素/氧化三甲胺混合溶劑中自由氫鍵受體給體數目與氧化三甲胺溶劑情況類似，因此在此溶劑中尿素對于碳納米管內部水合作用的增強基本被抑制了。

表2 三種溶劑中各組分平均每個分子形成的氫鍵個數Table 2 Averaged hydrogen bond number per molecule for solution species in 3 different solutions

表3 四種溶劑中平均每分子氫鍵受體/給體數目Table 3 Averaged numbers of hydrogen bond acceptors/donors per molecule in 4 different solutions

4 結 論

本文通過分子動力學模擬研究了尿素、氧化三甲胺、尿素/氧化三甲胺混合溶劑三種溶劑對單壁碳納米管通道中水合性質的影響。模擬結果顯示尿素提高了水分子進入碳納米管通道的數目，氧化三甲胺大大降低了進入碳納米管通道的水分子數目，而尿素/氧化三甲胺混合溶液的結果更傾向于單一氧化三甲胺溶劑的結果，即抑制了尿素對碳納米管內部水合作用的促進。因為模擬中碳納米管的直徑只允許水分子通過，因此共溶劑分子并不能直接進入納米管通道來影響水合性質，所以這個簡單的體系是檢驗氧化三甲胺抑制尿素蛋白質變性機制的合適的簡化模型。模擬結果表明，混合溶液中由于氧化三甲胺非常傾向與水分子和尿素形成氫鍵，這使得水分子氫鍵網絡穩定性增強，導致的結果就是加大了體相水分子進入碳納米管通道的懲罰，抑制了尿素促進水分子進入納米管通道的作用。本文的研究對幫助研究者理解共溶劑影響水合機理有一定作用，然而這里只是研究了一個簡化的疏水體系，對于復雜的蛋白質等生物大分子中共溶劑的變性和保護作用的研究還需要綜合考慮多方面的因素。需要指出的是，本文提出的氧化三甲胺抑制尿素變性劑作用的機理更多的是從間接作用機制方面進行考慮，但是，在真實的蛋白質環境中共溶劑分子與蛋白質的直接作用也起到相當關鍵的作用。另外，作為具有輸運分子應用前景的碳納米管，其本身水合性質的研究也是有價值的研究課題，當然這就需要更細致的研究不同手性參數的碳納米管中溶液分子的相互作用的差別，這也將是我們下一步的一個研究方向。

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Molecular Dynamic Simulations of the Effects of Trimethylamine-N-oxide/Urea Mixture on the Hydration of Single-Walled Carbon Nanotube Interiors

YANG Li-Jiang1,2GAO Yi-Qin1,2,*
（1Beijing National Laboratory for Molecular Sciences, College of Chemistry and Molecular Engineering, Peking University, Beijing 100871, P. R. China；2Biodynamic Optical Imaging Center, Peking University, Beijing 100871, P. R. China）

Urea is known for protein denaturation. The counteracting effect of trimethylamine-N-oxide（TMAO） against urea-induced protein denaturation is also well established. Howeνer, what is largely unknown is the mechanism TMAO counteracts urea. In this article, the hydration of the interior of a simple single-walled carbon nanotube in a urea/TMAO mixture is studied as a model system for hydrophobic hydration using molecular dynamic simulations. The results show that TMAO counteracts the hydration effect of urea to the nanotube interior through strong interactions among TMAO, water, and urea. The strong interactions of TMAO and water stabilize the water structure, which counteracts the effects of urea indirectly.

Urea; Trimethylamine-N-oxide; Carbon nanotube; Hydration; Molecular dynamics

O645.11

10.3866/PKU.WHXB201512161

Received: October 8, 2015； Revised: December 15, 2015； Published on Web: December 16, 2015.

*Corresponding author. Email: gaoyq@pku.edu.cn； Tel: +86-10-62752431.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China （21373016, 21233002, 21125311, 21573006）.

國家自然科學基金（21373016, 21233002, 21125311, 21573006）資助項目

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