美洲大蠊提取液對大鼠難愈合創面VEGF表達影響的研究

曾娟妮劉筱伍偉明尹婷吳志榮李文華

【摘要】目的：探討外用單味動物藥促進創面愈合的機制。方法：將50只大鼠分為急性創面組、模型組、貝復濟組、美洲大蠊提取液組，用RT-PCR實驗方法，觀察大鼠皮膚修復組織VEGFmRNA的表達。結果：VEGFmRNA的表達在第5、7、11天，急性愈合創面組VEGFmRNA的表達量顯著高于美洲大蠊提取液組、貝復濟組及模型組（P<001）；在第5、7、11天，美洲大蠊提取液組、貝復濟組VEGFmRNA的表達量顯著高于模型組（P<001）；在第5、11天，美洲大蠊提取液組與貝復濟組VEGFmRNA的表達量有統計學差異（P<005）；第7天，肉芽組織生長期，美洲大蠊提取液組與貝復濟組VEGFmRNA的表達量無統計學差異（P>005）。結論：美洲大蠊提取液通過提高VEGFmRNA的表達來促進創面愈合。

【關鍵詞】美洲大蠊提取液；慢性難愈合創面；RT-PCR（逆轉錄聚合酶鏈式反應）；基因表達

【中圖分類號】R2855【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2016）19-0064-03

慢性難愈合創面是指創面在各種內外因素作用下不能通過正常的愈合進程達到解剖和功能上的完整，從而進入一種病理性炎癥反應狀態，最終導致經久難愈。藥理研究證明美洲大蠊提取物能促進肉芽組織生長，促進血管增生，加速壞死組織脫落，迅速修復各類潰瘍及創傷創面；抗感染、消除炎性水腫，提高機體免疫功能；外用可快速激活局部免疫細胞，縮短創面愈合時間[1-2]。目前，美洲大蠊提取物被廣泛應用在創面修復、胃潰瘍、腫瘤等領域[3-4]。筆者前期將美洲大蠊提取物外用于肛管難愈合創面，并取得滿意療效[5]。但其促進慢性難愈合創面的機制尚未探討。因此本實驗研究從創面愈合機制為出發點，以RT-PCR為主要研究方法，從肉芽組織中新生血管為切入點，通過動物實驗從局部生長因子等角度探討美洲大蠊促進創面愈合的機制提供理論依據，并為中醫藥的外治提供新思路。

1材料與方法

11實驗動物及分組實驗動物SPF級50只大鼠，2月齡，體重200～250g，雌雄不限“均由湖南中醫藥大學動物中心提供，混合飼料單籠飼養”，50只大鼠隨機分組，先取12只建立大鼠急性愈合創面模型，其余38只建立大鼠慢性難愈合創面模型，慢性難愈合創面組再隨機分為模型組、貝復濟陽性組（國藥準字Z20013152，實驗全過程使用同批號藥物）、美洲大蠊提取液實驗組（國藥準字Z20000004，實驗全過程使用同批號藥物）。

12大鼠慢性難愈合創面模型建立參照付小兵等[6]全層皮膚缺損法經改進制成大鼠慢性難愈合創面模型。

13主要實驗試劑Trizol：Invitrogen；Real-time PCR mix：Promega A6001；DNA Marker：Fermentas；異丙醇：上海化學試劑公司；氯仿：上海化學試劑公司；引物：上海生工；Gold View核酸染料：上海生工；瓊脂糖粉：上海生工。

14主要實驗儀器及耗材臺式高速冷凍離心機：美國Thermo；核酸蛋白分析儀：德國eppendorf；PCR儀：德國 Biometra；凝膠成像分析儀：美國Bio-Rad；微量移液器：德國eppendorf。

15實驗方法及步驟

151引物設計從NCBI中下載以下基因序列，引物設計采用Primer50軟件，引物序列見表1。

152RNA提取及逆轉錄從組織中提取RNA并反轉錄得到cDNA，并以該cDNA為模板，用針對目的基因設計合成的QPCR引物進行real-time PCR，以檢測組織中目的基因的表達。組織中總RNA抽提：①取50～100mg組織，每孔加入1000μL Trizol，吹打，室溫靜置5min；②每管加入200μL氯仿，劇烈震蕩15s，室溫靜置3min；4℃，12000rpm，離心15min；③從每管中吸取上清至另一新的15mL EP管。加入等體積異丙醇，混勻后室溫靜置20min；④4℃，12000rpm離心10min后，去上清；加入至少1mL 4℃預冷的75%乙醇，洗滌沉淀；⑤4℃，10000rpm離心5min，棄上清；4℃，10000rpm再次離心5min，吸去殘液，室溫干燥（不需完全干燥）；⑥加入20μL RNase-free水，至完全溶解，備用。

15312%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA純度。

154第一鏈cDNA合成 ①取10μg Total RNA加Nuclease-Free Water到無RNA酶的EP管中，混勻后離心，70℃溫浴10min，立即置于冰上；②加一下反應體系的其他試劑（冰上進行），混勻，短暫離心。③上述體系在42℃反應15min，然后在70℃水浴鍋中水浴10 min使Reverse Transcriptase失活。④將得到cDNA 置于-20℃保存備用。

155普通PCR檢測（德國，biometra） 按下列比例配置反應體系：①2×Real-time PCR mix/2×PCR mix：10μL；②PCRmix；③cDNA模板：1μL ④上游引物：1μL；⑤下游引物：1μL；⑥ddH2O：7μL；⑦總體積：20μL；⑧擴增程序94℃，4min；94℃，40sec，60℃ 30sec，×40cycle。

16統計學方法實驗數據用SPSS160統計分析軟件處理，計量資料以均數加減標準差（x[TX-*3]±s）表示，行t檢驗，P<005為差異具有統計學意義。

2結果

2112%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA純度

22VEGF電泳結果

圖2注：GAPDH電泳圖， 第 1、2、3泳道是急性愈合創面組，4、5、6泳道是模型組， 7、8、9泳道是貝復濟組，10、11、12泳道是美洲大蠊提取液組。

圖3注：VEGF mRNA表達電泳結果，第1、2、3泳道是急性愈合創面組，4、5、6泳道是模型組， 7、8、9泳道是貝復濟組，10、11、12泳道是美洲大蠊提取液組，可反映出VEGFmRNA的表達量從高到低依次是急性愈合創面組、貝復濟組、美洲大蠊提取液組、模型組，在第7天，美洲大蠊提取液組與貝復濟組的VEGFmRNA的表達量無明顯差異。

23結果（見表2）

3討論

31本實驗研究發現在第5天、第7天、第11天，急性愈合創面組VEGFmRNA的表達量顯著高于美洲大蠊提取液組、貝復濟組及模型組（P<001），表明造模成功；在第5天、第7天、第11天，美洲大蠊提取液組、貝復濟組VEGFmRNA的表達量顯著高于模型組大鼠（P<001）；在第5天、第11天，美洲大蠊提取液組比貝復濟組VEGFmRNA的表達量稍低，但差異不明顯（P>005）；在第7天的肉芽組織生長期，美洲大蠊提取液組與貝復濟組VEGFmRNA的表達量無差異（P>005）；表明美洲大蠊提取液在創面肉芽生長期能誘導內源性VEGF的基因表達，促進細胞外基質（ECM）形成并減少效應T細胞在組織局部蓄積的作用，促進創面血液循壞、增強創面免疫力，從而促進創面修復、抑制瘢痕生長。

32血管生成可為創面的修復提供充足的氧分，有利于細胞的增殖；新生血管是肉芽組織的主要成分，肉芽組織是膠原沉積、改建的場所，因此，血管新生是創面修復過程中重要的一環[7]。血管內皮生長因子（VEGF）是一種特異的直接作用于內皮細胞的有絲分裂原，可以刺激體內尤其是缺血部位的血管生成，是迄今為止已知的最強烈的促血管生長因子，它主要是通過啟動微血管發生的初始過程-出芽，并最終形成成熟的血管結構[8]因此，VEGF在皮膚潰瘍愈合過程中起決定性作用。在慢性創面，由于VEGF表達較正常創面下調而導致血管生成的下降，被認為是慢性創面難愈合的重要原因[9]。基于此，本實驗通過檢測肉芽結果中VEGFmRNA的表達來探討單味動物中藥對促愈具有非常重要的意義，但美洲大蠊提取液在創面重塑期與貝復濟組表達有差異，那么它是否能減少瘢痕的形成有待于進一步探討。

參考文獻

[1]李莉，唐文華，徐月芳.康復新液治療頭面部燒傷36例效果觀察[J].齊魯護理雜志，2010，（16）：57-58.

[2]魏強，楊運芳.康復新液治療復發性阿弗他潰瘍112例近期療效觀察[J].中國健康月刊，2010，（29）：235-236.

[3]尹彬.康復新聯合奧美拉唑、阿莫西林膠囊三聯療法治療消化性潰瘍療效分析[J].中外醫學研究，2010，8（26）：17-18.

[4]劉宏宇.保留灌腸治療放射性直腸炎48 例療效觀察[J].中國醫學創新，2010，7（3）：29-29.

[5]伍偉明，金麗穎，王真權，等. 康復新液治療肛管難愈合創面的臨床研究[J].中醫藥導報，2015，21（22）：71-73.

[6]付小兵，孫同柱，盛志勇.幾種用于創傷修復研究的動物模型[J].中華實驗外科雜志，1999，16（5）：479-480.

[7]唐乾利，韓珊珊，付軍，等.MEBT/MEBO 對皮膚創面愈合過程中VEGF、bFGF、EGFmRNA表達影響的研究[J].右江民族醫學院學報，2012，34（5）：597-601.

[8]曹波，李志，李紹堂，等.芪榆油膏對肛瘺術后創面肉芽組織中VEGFmRNA表達的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（16）：236-238.

[9]彭湃.VEGF在慢性創面愈合中的作用及機理研究[D].廣州：第一軍醫大學，2004.

（編輯：穆麗華）