多層紙芯片乳腺癌組織微陣列用于抗腫瘤藥物測試

劉未平 林錦瓊 杜燕 齊明月 梁廣鐵 楊娜 劉大漁

摘 要 [HTSS]開發了一種多層紙芯片細胞培養平臺， 將乳腺癌細胞分別接種于多層的圖形化紙芯片的親水區，折疊后構建了仿真實體腫瘤。多層紙芯片覆以微孔薄膜，用以仿真血管內皮層。培養不同時間后，拆解多層紙芯片檢測乳腺癌組織內各層面的細胞形態、存活率、細胞周期分布以及細胞內乳酸含量。實驗結果顯示，各層紙芯片培養的乳腺癌細胞存活率均高于80%，并形成了類組織結構。芯片乳腺癌組織內部呈酸化傾向，且酸化程度隨著培養時間的延長而升高。與二維（2D）培養細胞相比較，紙芯片乳腺癌組織內細胞增殖比例顯著降低（15% vs 60%）。多層紙芯片乳腺癌組織顯示了更接近體內情況的藥物反應機制，細胞存活率隨阿霉素濃度升高呈現緩慢下降趨勢，IC50值顯著高于2D培養細胞組（5.0 μmol/L vs 1.144 μmol/L）。這種多層紙芯片乳腺癌組織微陣列構建簡便、仿真度高，有望成為抗腫瘤藥物反應測試的有力工具。

關鍵詞 紙芯片；乳腺癌；組織微陣列；微環境；抗腫瘤藥物

1 引 言

惡性腫瘤是威脅人類健康的常見疾病。半個多世紀以來，對于腫瘤的發生機制研究取得了一系列重要進展，同時新的腫瘤治療手段也不斷出現，腫瘤治療也逐漸由經驗性治療模式轉變為個體化精準治療模式，因此需要根據患者個體情況制定針對性治療方案。腫瘤個體化治療需要參考基因檢測以及細胞-藥物反應結果。與分子水平的檢測相比較，細胞水平的藥物測試可以更直觀地顯示治療效果，發現耐藥信息以指導治療方案的及時調整，避免不合理治療引發的副作用，減輕經濟負擔[1]，為腫瘤個體化治療提供有力的支持。

在機體內，藥物由血管向腫瘤細胞的轉運需要穿越血管內皮層和細胞間質，最終進入細胞內部，這個過程涉及腫瘤細胞與藥物的相互作用。一方面，藥物從血管向細胞內部擴散，其濃度隨擴散距離的增加而遞減；另一方面，腫瘤組織對于藥物存在拮抗效應，不僅包括上述擴散屏障的被動性阻擋，還有腫瘤細胞[2]和間質細胞[3]對于藥物的主動性抵制。傳統的二維（2D）細胞培養不能有效模擬腫瘤組織[4～6]，具體表現在：（1）細胞在傳統平板培養容器中喪失了體內原有的三維結構，細胞細胞間相互作用以及細胞基質間相互作用不復存在，由此導致擴散屏障功能嚴重削弱；（2）由于細胞或組織幾乎完全暴露于培養液，不僅細胞藥物反應被人為地放大，由濃度梯度介導的細胞微環境反應過程也被干擾；（3）傳統的靜態培養方式不能實現及時的物質更新，代謝廢物蓄積對細胞的毒性作用可能會影響實驗結果。由于上述原因，目前通用的細胞水平的抗腫瘤藥物測試總體效果還不能令人滿意。為了模擬體內微環境，研究者們開發了一系列創新的體外細胞培養技術，如體外3D培養技術[ 7，8]和癌細胞間質細胞共培養技術[ 9，10]。相比傳統的2D細胞培養方法，使用3D培養和共培養技術所建立的腫瘤細胞微環境更加接近體內條件。但是，這些方法仍然具有明顯的不足。首先，簡單的3D培養仍然無法實現腫瘤組織和腫瘤微環境的細致仿真，而報道的圖形化細胞共培養方法[11]雖然可以模擬組織的復雜性，但普遍操作繁瑣；其次，大多數細胞研究平臺僅能獲知腫瘤組織整體對于藥物刺激反應的結果，而無法實現對腫瘤組織的空間解析。此外，目前使用的3D細胞培養平臺需要采用共聚焦熒光顯微鏡檢測，使用成本較高，難于推廣。因此，為實現簡單有效的個體化腫瘤治療指導，迫切需要對細胞水平抗腫瘤藥物測試平臺進行改進，包括采用簡便可靠的3D培養平臺、有效模擬組織擴散屏障以及提供腫瘤組織空間解析能力。

利用多層平面材料組裝形成復合的立體組織結構是一種簡便有效的組織構建方法。已有文獻報導了利用不同類型多孔平面材料，如電紡絲膜、聚合物薄膜和蠶絲蛋白薄膜等作為細胞載體[12～15]。在這些研究中，首先將不同類型細胞分別培養在多層薄膜上，繼而通過疊加簡便地實現組織的仿真。2009年，哈佛大學的Martinez等[16]在多層組裝組織構建技術的基礎上，提出“紙芯片”細胞培養和分析技術。該技術在微流控芯片中使用通透性薄膜材料（如紙、纖維膜以及聚合物薄膜等）作為分子擴散的媒介以及細胞培養的支撐， 自提出以來，紙芯片技術得到快速發展，紙和薄膜材料也在細胞培養中得到了初步應用并取得良好效果。張瓊等[17]用明膠處理的硝酸纖維素薄膜模擬基底膜，支撐肝癌細胞3D培養，顯示出極好的仿真性能。Derda等[18]報導了使用多層折疊紙材料作為3D細胞培養的支架，結果顯示多層紙芯片3D培養可以真實模擬體內生理狀態。之后，該研究組又使用噴蠟打印技術，發展了高通量3D紙芯片細胞培養技術[19]。從上述研究工作可以看出，紙芯片細胞培養技術不僅可以簡便地實現組織仿真，而且其可拆解特性便于從空間角度反映腫瘤組織不同層面細胞對于微環境因素的反應。

本研究提出了一種多層紙芯片3D腫瘤微陣列用于抗腫瘤藥物反應測試。以紙材料作為細胞培養的支撐，以聚碳酸酯（Polycarbonate，PC） 微孔薄膜仿真血管內皮屏障，將PC膜與接種有腫瘤細胞的圖形化多層紙疊加構建仿真乳腺癌組織。借助于紙材料中的分子擴散，模擬體內的物質運輸形式建立濃度梯度介導的細胞藥物相互作用機制。這種紙芯片的最大特色是可以通過紙層的拆分，簡便地實現腫瘤結構3D2D轉換。通過檢測各層面上細胞生存和代謝情況，可以從空間上解析不同層面上腫瘤細胞對于藥物刺激的反應。本研究以MDAMB231乳腺癌細胞株為模型構建組織陣列，并利用這種仿真芯片腫瘤組織獲取癌細胞對于藥物刺激的反應等信息。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

IX71倒置熒光顯微鏡，AU2700全自動生化分析儀（日本Olympus公司）；GUAVA easyCyte HT流式細胞儀（德國Merck公司）；噴蠟打印機（富士施樂8560DN）。

聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）前體及引發劑（美國Dow Coming公司）；PC薄膜（孔徑200 nm） 和Grade114濾紙（英國Whatman公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）、DMEM培養基、明膠、胰蛋白酶溶液、RNase A （美國ThermoFisher公司）；海藻酸鈉、CaCl2、碘化丙啶（Propidiumiodide，PI）購自上海生工公司；鈣黃綠素AM（CalceinAM，日本Dojindo公司）；鹽酸阿霉素（深圳萬樂藥業有限公司）；熒光染料和阿霉素用二甲基亞砜配制，熒光染料使用前用PBS稀釋為工作液，其中CalceinAM/PI兩種染料含量分別為1.0 mol/L和1.5 mol/L。乳腺癌細胞株MDAMB231由中科院廣州生物醫藥與健康研究院提供。實驗用水為二次蒸餾水。

2.2 紙芯片加工

紙芯片加工參考文獻[20]的方法。每張芯片包含一個8×5親水點陣，每個親水點直徑為4 mm，親水點間距為 2 mm。芯片圖案用噴蠟打印機在濾紙上打印出來（打印分辨率為2400 dpi × 2400 dpi），之后將濾紙在150℃烘烤2 min。濾紙表面的蠟在烘烤過程中熔化并滲透濾紙全層，形成封閉的親水區域限定細胞圖形化生長。在頂層濾紙的親水區打孔，底面用雙面膠封接一層微孔PC薄膜（孔徑0.1 μm）。濾紙的細胞接種區使用0.1%明膠處理，烘干后備用。

2.3 細胞培養

乳腺癌細胞MDAMB231首先在培養皿中培養，待增殖至80%覆蓋率時使用0.25%胰蛋白酶EDTA溶液消化。收獲的細胞洗滌2次后，MDAMB231細胞懸液與同體積的2.0%海藻酸鈉溶液混勻制成濃度為1.5×107/mL的細胞懸液。

2.4 紙芯片上細胞的接種與培養

紙芯片在使用前用紫外線照射消毒。多層紙芯片的14層的每個親水區接種1.5 × 105個細胞，之后滴加3 μL CaCl2溶液。靜置2 h后將接種了細胞的紙芯片折疊，用訂書機將折疊濾紙的兩端裝訂起來。折疊紙芯片放置于尺寸為60 mm×9 mm×2 mm的長方形PDMS孔板中（圖1），加入培養基覆蓋。培養過程中隔天換液。

圖1 A.芯片加工和實驗操作流程示意圖。（i）濾紙噴蠟打印后烘烤，得到8×5親水點陣；（ii）在首行親水區打孔并用雙面膠封接一層微孔PC薄膜；（iii）在其余4行親水區接種乳腺癌細胞；（iv）濾紙折疊后兩端用訂書機裝訂，放入培養池中浸泡培養；B. 多層紙芯片仿真乳腺癌組織；C. 噴蠟打印加工紙芯片實物圖；D. 紙芯片折疊后置于培養池中浸泡培養。

2.5 紙芯片培養細胞分析

培養2， 4， 7天后，將多層紙芯片取出、展開， CalceinAM/PI染色后，用熒光顯微鏡觀察每層細胞的形態和熒光顯色情況。CalceinAM可透過細胞膜，進入細胞后被細胞內的酯酶剪切形成Calcein，發出強綠色熒光 （激發波長490 nm，發射波長515 nm），因此CalceinAM僅對活細胞染色。PI僅能穿過死細胞膜到達細胞核，并嵌入細胞的DNA雙螺旋從而產生紅色熒光 （激發波長535 nm，發射波長617 nm）。由于Calcein和PIDNA都可被490 nm激發光激發，因此可用熒光顯微鏡根據不同顏色的熒光同時觀察活細胞和死細胞。用Photoshop軟件分別統計紅色和綠色熒光覆蓋面積（S），細胞生存率=S綠/（S綠+S紅） ×100%。

在培養2， 4， 7天后，將多層紙芯片取出、展開，并用剪刀將紙芯片分別剪開并放到裝有生理鹽水的試管中。待水凝膠溶解后，分別將各層濾紙收集到1.5 mL離心管，用膠原酶和胰酶消化并收集細胞，用PBS洗1次后，用預冷的70%乙醇重懸細胞，4℃放置30 min固定細胞。PBS再次洗滌1次后，加入RNase A （100 μg/mL），37℃放置30 min去除RNA，之后加入PI（10 mg/μL）染色15 min，流式細胞儀檢測并用Modfit軟件分析得出細胞周期分布。同時，制備等量細胞懸液放入一個含200 μL細胞裂解液的離心管，劇烈振蕩，以1000 r/min離心3 min后，用全自動生化分析儀檢測各層細胞的胞內乳酸含量。

2.6 抗腫瘤藥物鹽酸阿霉素測試

在細胞接種后第二天，更換含有不同濃度鹽酸阿霉素的新鮮培養基。培養24 h后取出濾紙，CalceinAM/PI染色， 熒光顯微鏡下觀察并拍照，計算每層細胞存活率。同時，以96孔板培養細胞作為2D組對照實驗。

3 結果與討論

3.1 紙芯片上乳腺癌組織的構建

本研究利用噴蠟打印技術加工圖形化紙芯片構建高密度腫瘤細胞陣列。紙芯片折疊后用孔徑0.1 μm微孔PC薄膜覆蓋，用以構建仿真腫瘤組織。多層紙材料支撐3D培養乳腺癌細胞模擬腫瘤實質，紙芯片腫瘤組織表面的微孔薄膜模擬血管內皮層，包裹細胞的水凝膠模擬細胞外基質，而明膠處理紙纖維模擬腫瘤間質。因此，多層紙芯片乳腺癌組織允許在高度仿真的條件下進行體外抗腫瘤藥物測試。這種多層紙芯片乳腺癌組織的最大優勢在于可以通過拆解簡便地實現組織結構從3D至2D的轉化，從而可以從空間角度解析腫瘤組織內部細胞形態、結構和功能變化。

3.1.1 乳腺癌組織實質的模擬 濾紙孔隙中的乳腺癌細胞由于受空間限制得以維系3D 排列形式。熒光顯微鏡成像（圖2A）顯示，濾紙上細胞團散的分布，提示乳腺癌細胞聚集形成類似實體瘤的腫瘤球結構。Photoshop軟件分析結果顯示（圖2B），隨著培養時間的延長，各層濾紙的熒光強度逐漸增強，表明培養細胞的增殖。

圖2 多層濾紙上的乳腺癌細胞培養

Fig.2 Breast cancer cells cultured on multilayer paper chip

（A） 培養不同時間后紙芯片各層乳腺癌組織CalceinAM/PI染色熒光圖 （放大倍數4×10，標尺100 μm）；B. Photoshop軟件分析得到的各層乳腺癌組織的熒光強度動態變化曲線；C. 紙芯片乳腺癌組織的CalceinAM/PI熒光染色局部放大圖顯示細胞團的形成 （放大倍數10×10）。

3.1.2 乳腺癌組織間質的模擬 紙材料為多孔纖維素結構，具有良好的生物兼容性。本實驗使用明膠處理濾紙纖維，模擬腫瘤間質，對乳腺癌細胞起到支持、連接、保護和營養作用。接種細胞懸液中混有一定濃度的海藻酸鈉，當接觸Ca2+時固化成水凝膠包裹細胞，功能類似于細胞外基質。實驗使用海藻酸鈉濃度為2.0%，可以為細胞生長提供適宜的間質硬度。海藻酸鈉和明膠中含有選擇素和整合素成分，可以提供細胞結合位點[21]，促使乳腺癌細胞通過粘附分子與間質成分之間建立聯系。

3.1.3 乳腺癌組織微血管擴散屏障的模擬 在腫瘤組織中，細胞與外界的物質交換通過血管內皮層、組織間質和細胞外基質擴散而實現。在多層紙芯片腫瘤組織內，物質運輸依賴于被動擴散因而形成了各種物質成分在細胞整個擴散路徑內的濃度梯度分布，模擬了體內微環境。據文獻[22]報道，由于物質擴散屏障的存在，體內腫瘤組織與外界物質交換效率遠低于體外培養。實驗在紙芯片腫瘤組織中以孔徑0.1μm多孔PC薄膜仿真血管內皮，以紙纖維和水凝膠模擬組織間質和細胞外基質，以3D腫瘤球模擬腫瘤實體結構，這樣就構建了從微血管到腫瘤細胞的完整擴散屏障。

由于擴散屏障的存在，腫瘤組織內處于缺氧狀態，而細胞的代謝主要依賴糖酵解，因而會產生乳酸蓄積[ 23]。實驗結果表明，多層紙芯片乳腺癌組織內細胞內乳酸水平隨著培養時間的延長而增加（圖3），因此非常接近于體內腫瘤組織的酸化狀態[24]。

3.2 多層紙芯片乳腺癌組織中的細胞生存和增殖

連續監測接種后7天內的細胞存活率和細胞周期分布實驗結果如圖4所示。隨著培養時間的延長，細胞存活率緩慢降低，至第4天時穩定在80%左右（圖4A）。在相同時間點，各層濾紙上的細胞存活率無明顯差異。如圖4B所示，隨著時間延長，紙芯片腫瘤組織中增殖細胞比例逐漸降低。在第2天時，增殖細胞比例在1層和2層濾紙中約為20%，3層和4層濾紙中分別為30%和50%； 4天以后，各層的增殖細胞比例均降至15%以下。與2D培養組相比較，多層紙芯片腫瘤組織內增殖細胞比例顯著降低（15% vs 60%），這符合體內腫瘤細胞的增殖動力學。

3.3 多層紙芯片乳腺癌組織對于阿霉素刺激的反應

如圖5所示，多層紙芯片乳腺癌組織中的細胞存活率隨著阿霉素濃度升高而降低。相比之下，芯片培養細胞的效應劑量曲線要平緩得多。IC50值在2D組和芯片組分別為1.14和5 μmol/L（預測）。阿霉素濃度升高至0.5 μmol/L以上時，顯現出較強的細胞毒性。用相對存活率（R=藥物刺激細胞存活率/同層非藥物刺激細胞存活率 × 100%）反映細胞對于藥物刺激的反應，則有 R3>R2>R4>R1。上述結果提示多層紙芯片乳腺癌組織對于阿霉素具有較強的抵制，這解釋了為何實體瘤化學治療效果普遍不佳[25]。這種藥物抵制效應在深層組織更為顯著[26]，分析其原因可能為由于擴散屏障的存在，藥物運輸效率受到限制，此外由于組織內部的缺氧和微環境酸化，削弱了藥物的療效。

4 結 論

本研究開發了一種多層紙芯片細胞培養平臺。將乳腺癌細胞分別接種于多層的圖形化紙芯片的親水區，折疊后構建了仿真實體腫瘤。結果顯示，各層紙芯片培養的乳腺癌細胞存活率均保持在80%以上，并形成了類組織結構。芯片乳腺癌組織內部呈酸化傾向，且酸化程度隨著培養時間的延長而升高。與2D二維（2D）培養細胞相比較，紙芯片乳腺癌組織內細胞增殖比例顯著降低。多層紙芯片乳腺癌組織顯示了更加接近體內情況的藥物反應機制，細胞存活率隨阿霉素濃度升高呈現緩慢下降趨勢，IC50值顯著高于2D培養細胞組。本研究的實驗結果表明，基于多層紙芯片腫瘤陣列的抗腫瘤藥物測試操作簡便、仿真性高，是體外藥物測試的有力工具。

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AntiCancer Drug Testing Using MultiLayer PaperSupported

Breast Cancer Tissue Array

LIU WeiPing1， LIN JinQiong1， DU Yan1， QI MingYue1， LIANG GuangTie1，2， YANG Na1，2， LIU DaYu*1，2，3

1（Department of Laboratory Medicine， Guangzhou First People′s Hospital，

Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University， Guangzhou 510180， China）

2 （Clinical Molecular Medicine and Molecular Diagnosis Key Laboratory of Guangdong Province， Guangzhou 510180， China）

3 （Clinical Research Center， the Second Hospital Affiliated to Dalian Medical University， Dalian 116027， China）

Abstract This paper describes a multilayer papersupported breast cancer tissue array. The paperbased microchip with arrayed hydrophilic spots was fabricated by wax printing. After cell seeding， the microchip was folded to form an artificial solid tumor， and the multilayer paper was covered by a layer of microporous membrane that mimics endothelial layer. After culturing the papersupported breast cancer tissue for a certain period of time， the multilayer device was unfold thus enabling detections of cell survival， proliferation， morphology and metabolism on different layers. Breast cancer cells cultured on paper had a survival rate >80% and aggregated into tumor spheroids. Intracellular lactic acid levels increased with the extension of culture time. Compared to two dimensional （2D） counterparts， the decreased fraction of S phase cell （15% vs 60%） was detected. The papersupported breast cancer tissue showed a drug response mechanism similar to the tumor in vivo. Cancer cells within the tissue were less sensitive to doxorubicin and the IC50 value detected was significantly higher than that obtained with 2D cultures （5 μmol/L vs 1.14 μmol/L）. The multilayer papersupported breast cancer tissue array developed in this work featured simple tissue reconstruction and easy operation， thus providing an ideal tool for anticancer drug testing.

Keywords Paperbased microfluidic chip； Breast cancer； Tissue microarray； Microenvironment； Anticancer drug

（Received 30 December 2015； accepted 29 February 2016）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 81371649， 81271730， 81171418） and the Medicine Health Science and Technology Program of Guangzhou （Nos. 20121A021002， 20121A011035）