基于陣列微流控細胞芯片的植物組分抗氧化活性分析

張瀟丹 徐溢 張濤 呂君江

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摘 要 設計并制作了一種集成有8個重復6×6細胞培養單元的陣列微流控細胞芯片，以實現細胞培養和系列植物組分的細胞抗氧化活性（Cellular antioxidant activity，CAA）分析。芯片主要包含聚二甲基硅烷蓋片、288個圓形培養腔體，48個獨立平行通道的玻璃基底層，一次可完成8個樣本的6個濃度篩選，并可在酶標儀上實現測試。槲皮素、蘆丁和山奈酚等植物組分與芯片上培養的細胞作用24 h，細胞存活率大于90%。以芯片上培養的人肝癌細胞HepG2為細胞載體，以2′，7′二氯熒光素乙酰乙酸酯（2′，7′Dichlorofluorescin diacetate， DCFHDA）為熒光探針，采用2，2′偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2，2′azobis（2amidinopropane） dihydrochloride，ABAP）為細胞內活性氧（Reactive oxygen species，ROS）引發劑，測得槲皮素、蘆丁、山奈酚等植物組分的CAA unit分別為71.42±0.19、74.31±0.36和69.92±0.09（±s， n=3），IC50分別為（7.20±0.06） μmol/L， （52.06±0.14） μmol/L， （32.55±0.03） μmol/L（±s， n=3）。

關鍵詞 陣列微流控細胞芯片； 細胞抗氧化活性； 高通量； 篩選

1 引 言

近年來，藥物細胞毒性和藥效評價已成為新藥研發中化合物篩選的主要觀測指標。在抗氧化活性評價研究中，Wolfe[1]建立了細胞抗氧化活性（Cellular antioxidant activity，CAA）分析方法，在細胞水平上測定抗氧化劑對自由基氧化的抑制效果，并對水果和蔬菜中活性物質進行抗氧化活性測定。隨后，Karl[2]和Zhao[3]等借鑒該法進行了植物提取物CAA分析。然而，這些方法依舊面臨著通量低、測試過程復雜等問題。因此，如何更好地將CAA測試方法與高通量、高內涵分析技術結合，實現快速準確、高自動化的篩選，仍是亟需解決的問題。為此，研究人員開發了多種新型技術，以便在藥物研發過程中盡早確定化合物的安全特性和功效。其中微流控芯片分析技術較以往的篩選技術更具有優勢，可將樣品預處理、反應、衍生、分離和檢測等分析步驟微型化到一個芯片上，以流體和陣列多通道的形式縮短分析時間，在低耗樣量的狀態下提供一個進行細胞生理、生化分析的微環境，具有快速分析、信息量大、制作成本低等優點[4]，因而成為極具潛力的藥效測試新平臺。如，Frey等[5]設計的可重組式微液滴器官芯片、Espulgar等[6]設計的離心式細胞芯片。Ye等[7]設計了結構非常緊密的由8個對稱的藥物濃度梯度發生器和細胞培養區組成的微流控芯片，一次可完成8個樣本的8個濃度篩選，利用該芯片培養肝微粒體，通過與下游的芯片電泳和細胞培養單元集成，可同時完成藥物代謝物檢測和毒性評價。Xu等[8]基于濃度梯度發生器和三維細胞培養單元建立的藥敏測試平臺中的芯片設計更為簡單巧妙，濃度梯度的產生依賴于3組不同長度的微通道（5.7/7.5/12.5 mm）和不同直徑的彎曲通道（0.2/0.23/0.3 mm），利用該芯片一次完成了4個樣本3個濃度的測試，可方便地用于肺癌的個體化治療。因此，將微流控芯片技術用于細胞內抗氧化活性測試研究，對于抗氧化活性藥物的高通量高內涵測試和篩選同樣具有啟發性。

本研究設計并制作了一種集成了8個重復6×6陣列細胞培養單元的陣列微流控細胞芯片，實現了芯片上細胞連續培養和化合物對細胞毒性檢測，將其與CAA測試方法結合，搭建了一個細胞抗氧化活性芯片分析平臺，并采用植物抗氧化劑槲皮素、蘆丁和山奈酚進行芯片功能測試。結果表明，此芯片可以很好地發揮體外活性評價作用。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

HH.CP7W二氧化碳培養箱（上海博迅公司）；ZDX35BI電熱壓力蒸汽滅菌器（上海申安公司）；IX71奧林巴斯熒光顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）；SynergyTM HT多功能酶標儀（美國BioTek公司）。SWCJ1FD超凈臺（蘇州凈化公司）；流動注射泵（美國Harward公司）。

含10%胎牛血清的DMEM細胞培養基（美國HyClone公司）。二甲基亞砜、多聚賴氨酸（分子量30000～70000）、2，2′偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽、二氯二氫熒光素乙酰乙酸酯、羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（美國Sigma公司）。山奈酚、蘆丁和槲皮素（純度>98%）。人肝癌細胞HepG2懸浮液，濃度為106 個/mL，生存狀態為對數生長期，取自重慶市西南醫院消化科。

2.2 實驗方法

2.2.1 陣列微流控細胞芯片的制作及檢測系統 如圖1A和圖2所示，設計了基于6×6細胞培養單元的陣列微流控細胞芯片及其檢測系統。采用標準光刻濕刻方法將掩膜圖形轉移至玻璃板，經過曝光、顯影、濕法刻蝕和去膠等步驟（圖1B），最終制成了一個含有288個圓形培養腔體、48個獨立平行通道的芯片玻璃層。實驗前將聚二甲基硅烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）預聚體與固化劑混合均勻，脫氣后澆鑄于載玻片上，放置在烘箱中80℃條件下加熱固化1 h形成PDMS蓋片。與芯片玻璃層可逆鍵合成PDMS玻璃復合芯片。在檢測時，將芯片固定在孔板讀數儀的托架上，儀器參數設置選擇96孔板板型，并通過Plate layout設置相應檢測孔。

2.2.2 陣列微流控細胞芯片上肝癌細胞HepG2的培養 將芯片清洗干凈，滅菌處理。通過流動注射泵，從芯片中心口M到兩端口E連續泵入10 μg/mL的多聚賴氨酸（PolyLLysine，PLL）溶液5～10 min，泵出多余液體，將芯片放置于超凈臺內晾干，使PLL充分包被微流控陣列芯片的微腔和管道。接種細胞前，由芯片中心口M到兩端口E連續泵入無水乙醇以排除氣泡，PBS清洗和培養基浸潤管道。隨后取對數生長期的HepG2細胞由芯片兩端口E到中心口M接種于芯片上，在37℃于5%CO2培養箱中培養4 h， 更換新鮮培養基。此后每隔6～7 h為芯片上所培養的細胞換液。

2.2.3 陣列微流控細胞芯片上植物抗氧化劑與細胞相互作用測試 芯片上培養細胞24 h。利用自行搭建的微分析系統，測試植物抗氧化劑對芯片上HepG2細胞生長的影響。將系列含不同濃度植物抗氧化劑的培養基，從芯片兩端口E輸入，保持液體在兩端口與中心口液面的高度差，液體緩緩地流過陣列微流控細胞芯片的PDMS玻璃通道和微腔，匯集到芯片中心口M，由M引出多余液體。芯片于培養箱中繼續培養。在系列植物抗氧化劑作用下細胞繼續生長24 h。由M到E用PBS沖洗細胞2 min，通入50 μmol/L 羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）孵育細胞3 min。選擇488 nm激發波長和518 nm觀測波長， 孔板讀數儀上讀數。測試中需手動調節芯片位置1次。實驗測得各細胞腔體內不同樣本濃度作用下CFSE標記細胞熒光強度，按照公式（1）計算細胞活力（Cell viabitity， CV）：

CV（%）=Fludose/Flucontrol×100% （1）

式中：Fludose表示單次實驗中化合物作用下微腔平均熒光強度，Flucontrol表示單次實驗中對照腔體平均熒光強度。

2.2.4 陣列微流控細胞芯片上植物抗氧化劑的CAA測試

芯片上培養細胞24 h后，除去培養液，PBS清洗2 min，同2.2.2節操作，芯片兩端口E通入系列含不同濃度植物抗氧化劑和25 μmol/L DCFHDA的細胞培養基，將芯片靜置于37℃、5% CO2培養箱中30 min，無菌PBS由M到E小心沖洗5 min。用200 μmol/L ABAP溶液處理，在孔板讀數儀上，同2.2.3節操作，選擇488 nm激發波長和525 nm觀測波長測定作用0～90 min的熒光值。同時，在90 min時，熒光倒置顯微鏡下逐個觀察各腔體內HepG2細胞的熒光圖譜。

實驗測得HepG2細胞平均相對熒光強度時間曲線，用Origin8.5軟件計算積分面積，按照公式（2）計算CAA值。通過CAA值濃度關系反映細胞熒光物質的減少量，從而反映該化合物的抗氧化能力。

3 結果與討論

3.1 陣列微流控細胞芯片的設計制作及表征

如圖1A，設計的陣列微流控細胞芯片的每個芯片單元有6條平行的陣列管道，每條管道有6個直徑為500 μm的圓形細胞培養腔，可同時進行6組不同的實驗，每組有6個平行實驗值，有效提高了結果的重復性和準確性。圓形腔體設計能有效減緩流速，降低剪切力對細胞的影響，有利于細胞停留。每條管道相距5 mm，相鄰培養腔中心連線相距1 mm，與酶標儀相匹配。芯片中心口M和兩端口E分別設有儲液池。實體單元芯片的尺寸如圖1A，深度為50 μm，尺寸符合設計要求。基于高通量藥物測試的需求，將8個這樣的芯片單元集成在一塊96孔板尺寸大小的玻璃上，集成芯片上有288個培養腔，48個獨立通道，可完成8種不同樣本的6個濃度篩選。

3.2 陣列微流控細胞芯片上肝癌細胞HepG2的培養

PLL能形成一層帶正電荷的親水性表面，從而促使表面含有大量陰性糖蛋白的細胞更易吸附在培養腔內。實驗發現通過PLL處理微管道和培養腔后，細胞貼壁時間可縮至4 h，且在腔體內分布均勻，與細胞培養瓶等常規細胞培養載體相比，細胞的形態和生長增值無顯著差異。培養24 h后細胞生長狀態良好（圖3）。此芯片可實現連續72 h的細胞培養。

3.3 陣列微流控細胞芯片上植物抗氧化劑與細胞相互作用結果

實驗中每個樣本由圖2A所示的1個6×6芯片單元完成其與細胞相互作用的測試，設5個樣本濃度，1個空白對照，每個濃度6個平行。用SPSS17.0統計軟件對濃度為0～300 μmol/L的槲皮素、蘆丁和山奈酚對細胞生長影響進行統計分析，p>0.05，無統計學意義，表明在以上濃度范圍內植物氧化劑對HepG2細胞生長基本無影響（表1）。槲皮素、蘆丁和山奈酚作用于HepG2細胞24 h后，與對照組腔體中一樣，培養腔內細胞數量多，排列緊密，生長狀態良好，CFSE標記細胞發出均勻一致的綠色熒光（圖4）。

3.4 陣列微流控細胞芯片上系列植物抗氧化劑的CAA測試結果

實驗中每個樣本采用圖2A所示的1個芯片單元，設5個樣本濃度，1個空白對照，每個濃度6個平行腔體。酶標儀上測得槲皮素、蘆丁和山奈酚作用下的DCFHDA標記HepG2細胞熒光強度時間曲線（圖5），其熒光強度隨陣列微流控細胞芯片不同管道內通過的抗氧化劑摩爾濃度增加而有不同程度的下降。在芯片熒光測試過程中，用熒光倒置顯微鏡觀察不同濃度的槲皮素、蘆丁和山奈酚作用下細胞內熒光強度的變化，可更加直觀地看出其抗氧化效果。

CAA法測定抗氧化劑作用下陣列微流控細胞芯片上所培養HepG2細胞中產生的ROS導致DCF形成的能力。與對照組相比，細胞熒光物質的減少量就能反映該化合物的抗氧化能力。實驗中的DCFHDA本身沒有熒光，它可以自由穿過細胞膜，進入細胞內后，可以被細胞內的酯酶水解生成無熒光的DCFH。而DCFH不能通透細胞膜，從而使DCFHDA熒光探針很容易地被裝載到細胞內。同時，進入細胞內的ABAP裂解成ROS，可以氧化DCFH生成有熒光的DCF，檢測DCF的熒光強度就可以反應細胞內ROS水平。由于HepG2細胞熒光強度與細胞內ROS水平呈正比，熒光強度越高，ROS含量越高，因此與對照組相比，化合物降低細胞熒光強度能力可以反映其能夠降低細胞內ROS的水平，即此化合物的抗氧化能力。

槲皮素、蘆丁和山奈酚具有明顯的抗氧化活性，并且存在一定的劑量效應關系，即抗氧化作用隨其摩爾濃度的增加而增強（p<0.05）。如圖5所示，隨著濃度增大，不同植物抗氧化劑作用下腔體內細胞熒光強度越來越弱。可以清楚的看到，槲皮素的活性氧清除效率要優于蘆丁，但是最終能夠清除的活性氧量，蘆丁要優于槲皮素。CAA值達到50時，3種化合物的摩爾濃度IC50如表1所示。

由表1可知，在作用于HepG2時，槲皮素、蘆丁和山奈酚的CAA值：蘆丁>槲皮素>山奈酚，IC50：蘆丁>山奈酚>槲皮素，即這3種植物抗氧化劑細胞內自由基清除能力：蘆丁>槲皮素>山奈酚，而自由基清除效率：槲皮素>山奈酚>蘆丁，數據趨勢與文獻中96孔板測試一致[2，10]。研究表明，黃酮類化合物具有很強的抗氧化性，在水溶液體系中雙糖苷優于苷元。此外，清除自由基活性與羥基數目相關，一般酚羥基越多，抗氧化性越好。而在生物模型中，由于細胞膜是脂溶性的，脂溶性藥物更易進入細胞，抗氧化活性苷元優于雙糖苷。如表1和圖5所示，高濃度下，當細胞內環境中有充足的抗氧化劑時，抗氧化能力表現出與水溶液中實驗結果相似的特性，表現為雙糖苷（蘆丁）優于黃酮苷元（槲皮素），優于類黃酮（山奈酚）。而在低濃度下，化合物抗氧化能力取決于進細胞難易，因此，黃酮苷元（槲皮素）優于類黃酮（山奈酚），優于雙糖苷（蘆丁）。因此，利用此實驗芯片不僅可以實現細胞的連續培養，通過靈活組合單元芯片，還可以實現多種植物氧化劑與細胞相互作用分析和抗氧化活性的評價，與已有結果符合。芯片設計不僅充分體現了CAA方法在抗氧化活性評價中的優越性，而且與酶標儀匹配，檢測方便快捷。

4 結 論

本研究設計并制作了基于6×6細胞培養單元的陣列微流控細胞芯片，芯片結構簡單，操作方便，實驗中可據不同測試需要對各單元和進出口進行靈活組合。實驗中，將芯片與CAA測試方法相結合，利用實驗室自行搭建的微流控分析平臺，定量評價了植物抗氧化劑（槲皮素、蘆丁和山奈酚）的活性氧清除效率和活性氧清除能力，表現為其IC50分別為（7.20±0.06） μmol/L、 （52.06±0.14） μmol/L和（32.55±0.03） μmol/L，CAA值分別為71.42±0.19、74.31±0.36和69.92±0.09。此陣列微流控細胞芯片上可同時完成8種不同樣本的多濃度測試，為高通量測試奠定基礎。實驗表明，此微系統和測試方法樣本適應性強，不僅具有很好的區分各種抗氧化劑的抗氧化效果，包括自由基清除效率和能力，定量評價抗氧化劑的抗氧化活性，還可以用于藥物對腫瘤細胞殺傷作用的研究，為現代藥物篩選和研究中的高內涵測試提供參考。

References

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Assessing Plant Antioxidants by Cellular Antioxidant Activity Assay

Based on Microfluidic Cell Chip with Arrayed Microchannels

ZHANG XiaoDan1，2，3， XU Yi1，2，3， ZHANG Tao1，2，3， L

JunJiang1

1（College of Chemistry and Chemical Engineering， Chongqing University， Chongqing 400030， China）

2（Key Disciplines Lab of Novel Micronano Devices and System Technology， Chongqing 400030， China）

3（International R & D center of Micronano Systems and New Materials Technology， Chongqing 400030， China）

Abstract An integrated microfluidic chip with arrayed micro channels that consisted of eight repeat arrayed 6×6 cell culture chamber was designed and fabricated. The analytical microsystem combined with designed microchip， measuring device and environmental control unit was established for cell culture and parallel cellular antioxidant activity （CAA） analysis of plant antioxidants. The microfluidic chip included a polydimethylsiloxane （PDMS） cover and glass substrate that consisted of two hundreds and eightyeight round cell culture microchambers and fortyeight independent parallel array channels. Eight groups of different samples with six different concentrations could be investigated simultaneously with multimode reader in one test. HepG2 cells were successfully cultured on the microchip. Moreover， the viability percentage of the HepG2 cells exposed to these plant antioxidants solutions at different concentrations for 24 h was higher than 90%. With 2′，7′Dichlorofluorescin diacetate （DCFHDA） as a fluorescence probe， 2，2′azobis（2amidinopropane） dihydrochloride （ABAP） as the initiator of intracellular reactive oxygen species （ROS）， we tested the inhibitory effect of several plant antioxidants such as quercetin， rutin and kaempferol on free radicals. The CAA units were calculated by the data measured from cellular morphology and fluorescence intensity over time. It was shown that the CAA units of quercetin， rutin and kaempferol were 71.42±0.19， 74.31±0.36 and 69.92±0.09 （±s， n=3）， while the calculated IC50 were （7.20±0.06） μmol/L， （52.06±0.14） μmol/L and （32.55±0.03） μmol/L （±s， n=3）， respectively.

Keywords Microfluidic cell chip with arrayed microchannels； Cellular antioxidant activity； High throughput； Screening

（Received 27 July 2015； accepted 4 October 2015）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 21375156）， National Mightech R&D Program （863 program）（No.2015AA021104） and the Fundamental Research Fund for the Central Universities （No. 106112015CDJZR225512）