利用芯片式高場非對稱波形離子遷移譜技術快速檢測苯丙氨酸

郭大鵬 汪永歡 徐天白 張媛 李靈鋒 陳金凱 汪小知 李鵬 駱季奎

摘 要 采用金屬擴散管芯片式高場非對稱波形離子遷移譜 （FAIMS） 技術對苯丙氨酸進行了快速檢測，設定測試壓強為250 kPa，金屬擴散管溫度為190℃，在優化的最佳分析條件下，即：載氣流速為2000 mL/min，分離電壓為152.8 V時，在正模式下獲得了苯丙氨酸的離子特征譜圖和補償電壓特征值

Symbolm@@ 0.62 V。另外，利用FAIMS對不同濃度的苯丙氨酸樣品氣進行了檢測，確定了FAIMS檢測的定量線性范圍為6～20 mg/L和檢出限為5.9 mg/L。本實驗為FAIMS應用于苯丙氨酸的快速檢測提供了重要參考。

關鍵詞 苯丙氨酸； 快速檢測； 高場非對稱波形離子遷移譜； 金屬擴散管

1 引 言

苯丙氨酸（Plenylalanine，PHE）屬于芳香族氨基酸，是機體合成各種激素、蛋白質及神經遞質的重要前體物質，苯丙氨酸的代謝紊亂會引發多種疾病如苯丙酮尿癥（PKU）[1]、高苯丙氨酸血癥[2]、白化病[3]以及神經損傷[4]等。測定PHE的含量是PKU診治的主要指標，對于PKU患者的診斷和監測極為重要[5，6〗]。因此，PHE含量的測定對于人體健康、相關疾病研究以及臨床診斷具有重要意義。目前，苯丙氨酸常見的分析檢測方法有同步熒光法[7，8]、高效毛細管電泳法（HPCE）[9]、高效液相色譜法（HPLC）[5，6，10]、質譜法（MS）[11～13]以及細菌抑制法和苯丙氨酸脫氫霉法[5]。但是上述幾種方法，涉及到繁雜的預處理， 且分析檢測周期長，不適合現場快速檢測的需求。

高場非對稱波形離子遷移譜（FAIMS）技術的出現，為物質在大氣環境下的快速檢測提供了可能。FAIMS又稱差分式離子遷移譜（DMS），是在大氣環境下對氣相離子進行快速分離識別的一種新興技術[14，15]。FAIMS基于離子遷移率非線性變化在高場下凸顯的特性，在離子前進方向構建非對稱性高電場，利用掃描電場、補償電壓及離子信號產生譜圖，從而對物質離子進行分離識別的氣相痕量物質檢測[16]。自FAIMS誕生以來，經過短短幾十年各國科研和商業機構的研究和開發[17～19]，該技術現已經成為主流的氣相檢測手段之一[20]，被廣泛用于爆炸物和毒品[21～23]、生物醫藥[24，25]以及環境監測[26]等領域的現場檢測。基于微納米加工工藝的FAIMS靈敏度高、檢測速度快、無溶劑和前處理，符合綠色化學的理念，且加工成本低廉，可大規模生產，另外操作電壓低[27]，可實現正負離子同步連續掃描[23，28]。

FAIMS在生物分子領域的研究和應用已有報道，但FAIMS都是作為前端過濾裝置，和HPLC及MS聯用[29～31]。芯片式FAIMS裝置也已成功應用于爆炸物、毒品、危險品的檢測以及常見色素和中西藥添加成分的檢測[22，23，32，33]。本實驗基于芯片式FAIMS的優勢，將其作為單獨的檢測裝置應用于苯丙氨酸的檢測，優化了檢測條件并在此基礎上建立了芯片式FAIMS快速檢測苯丙氨酸的新方法，獲得了苯丙氨酸的FAIMS特征譜圖，確定了FAIMS檢測苯丙氨酸的檢出限和定量線性檢測范圍。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

FAIMS譜儀由浙江大學與微木智能系統有限公司共同開發[22，23]。采用63Ni放射源作為電離源，芯片大小為7 mm×7 mm，其中遷移溝道呈U型來回曲折，共47個溝道。單個溝道長度為115 mm，寬度為35 μm，深度為300 μm。FAIMS芯片的原理示意圖如圖1所示。非對稱性射頻場強度最高可達61100 V/cm，頻率為25 MHz，其占空比為0.25。直流補償電壓掃描范圍為

Symbolm@@ 6～6 V。芯片式FAIMS譜儀是基于微納米加工技術（MEMS），采用深反應離子刻蝕（DRIE）在硅片上刻蝕出溝道，體積小，使得芯片式FAIMS譜儀的尺寸大大縮小，從而為便攜式的現場檢測提供了幫助。并且芯片溝道寬度窄，場強可達60000 V/cm以上，進一步拓寬了儀器的檢測范圍、選擇性和靈敏度，極大的縮短了檢測時間[23，32，34]。ES225SMDR分析型天平（瑞士Precisa公司）。

苯丙氨酸（分析純，阿拉丁試劑上海有限公司）；甲醇（分析純，南京化學試劑有限公司）。載氣為空氣壓縮機產生的連續穩定的清潔空氣，依次經過活性炭和分子篩過濾。

2.2 實驗方法

2.2.1 標準溶液制備 精確稱取苯丙氨酸0.5 mg，溶于2 mL純水中，再用8 mL甲醇定容至10 mL，超聲溶解，制得質量濃度為50 mg/L 的苯丙氨酸母液。將制得的苯丙氨酸母液按照不同比例稀釋，得到不同濃度的苯丙氨酸的標準溶液。

2.2.2 樣品氣的制備 樣品氣制備使用自制的氣體反生器（VG爐，含有金屬擴散管和加熱模塊，爐結構如圖2A所示。開啟加熱模塊，溫度升至設定值（190℃），旋開金屬擴散管密封蓋，使用微量進樣器移取10 μL苯丙氨酸標準溶液，將溶液迅速打入管中后密封，待測溶液在加熱狀態下氣化，通入潔凈載氣（活性炭和分子篩凈化）混合后轉化成測試樣品氣體。測試總流量為1600～2500 mL/min。

2.2.3 檢測方法 采用擴散管進樣，用FAIMS檢測不同濃度苯丙氨酸樣品氣，確定其檢出限及尋找定量檢測線性范圍。檢測流程圖如圖2B所示。圖2中所示裝置，已有過相關文獻報道[22，23，32，33]。利用空氣壓縮機產生連續穩定的空氣作為載氣，載氣依次經過濾芯（分子篩和活性炭）和氣體質量流量控制器（MFC）后將氣體發生器（VG爐）里的樣品帶入FAIMS譜儀中進行檢測，密封氣路的末端加一個針閥控制壓強，數值可以通過檢測器讀出。其中設置載氣的流速為2000 mL/min，壓強設定為

250 kPa。VG爐擴散管加熱模塊的溫度設定為190℃。射頻（RF）場掃描電場強度設定為最大電場強度值的60%～100%，補償電壓范圍為

Symbolm@@ 3～3 V。對不同濃度的標準溶液，移取相同體積10 μL的樣品溶液，進行測試，對每個濃度的樣品都進行7次掃描，以驗證樣品氣檢測的重復性。

3 結果與討論

3.1 實驗條件對苯丙氨酸檢測的影響及優化

在壓強設定為250 kPa，氣體發生器溫度為190℃時，苯丙氨酸的FAIMS譜圖穩定出峰。本實驗均在此壓強和溫度下進行。所用載氣是由空壓機制得并經干燥后的純凈氣體，保證了濕度的恒定。因此，影響FAIMS檢測的因素主要是載氣流量以及分離電壓對離子信號和分辨能力的影響。

3.1.1 分離電壓 圖3展示了FAIMS對20 mg/L苯丙氨酸檢測時的響應強度和分辨能力隨著射頻分離電壓幅值變化的趨勢圖。其中離子信號與到達檢測極板的離子數目有關，單位無量綱；分辨能力（Rd）由公式Rd=VC/Wh/2計算得出，式中VC為補償電壓， Wh/2為在該補償電壓下的苯丙氨酸的離子特征峰半峰寬。從圖3可見，當分離電壓由134.6 V增加到177.4 V時，苯丙氨酸的分辨能力從0.94增加到1.58，同時，苯丙氨酸相應的響應強度卻隨著分離電壓的增加而減小，從0.14下降到0.07。離子信號下降的原因在于，隨著分離電壓的增加，高場下離子的遷移率增加，使得縱向的凈位移增加，從而打到兩個極板上的離子數目增多，到達檢測極板的離子數目減小，從而使離子信號減小。綜合考慮分辨率與靈敏度， 選擇152.8 V為最優的分離電壓幅值。

圖3 苯丙氨酸響應強度和分辨能力隨著分離電壓幅值變化的趨勢圖

Fig.3 Resolution and ion intensity of phenylalanine versus dispersion voltage

3.1.2 載氣流速 圖4展示了FAIMS檢測20 mg/L苯丙氨酸時的響應強度隨著載氣流量變化的趨勢圖，所需補償電壓隨分離電壓變化的趨勢圖。當流速小于2000 mL/min時，響應強度隨著流量的增加，這是由于到達檢測極板的離子數目隨流量增多，離子信號隨之增加；而當流速大于2000 mL/min時，響應信號值迅速減小，其原因是載氣大于臨界值后，待測物質尚未檢測就被帶出檢測區域，從而使離子信號值下降。因此，本實驗選擇2000 mL/min為最佳載氣流量值。

3.2 譜圖特征

實驗表明，苯丙氨酸在正模式有響應信號，但在負模式下幾乎沒有響應。其原因可能是苯丙氨酸質子親和能比較高的原因。圖5A是在載氣流速為2000 mL/min時，通過擴散管進樣后，FAIMS在正模式下對

圖4 苯丙氨酸離子信號強度隨載氣流速的變化圖

Fig.4 Ion intensity of phenylalanine as a function of carrier gas flow rate

20 mg/L的苯丙氨酸在不同分離電壓場強下進行補償電壓和離子電流值的連續掃描得到的FAIMS譜圖。譜圖掃描完成時間約為20 s。其中，分離電壓從128.4 V掃描到214.0 V。對于每一條掃描電壓，直流補償電壓都會在

Symbolm@@ 3～3 V的區間掃描一遍。由離子響應的補償電壓位置確定對應的離子。信號區域的顏色深度則表示了離子信號的大小。在苯丙氨酸的FAIMS特征譜圖中可以觀察到3組特征峰，其中，左側是反應物離子峰，中間是待測物苯丙氨酸的離子峰，右邊是雜質離子峰。圖5B是在最優化的分離電壓幅值152.8 V下的FAIMS二維曲線。縱坐標為離子電流值，橫坐標為補償電壓值。對照圖5A可知，在152.8 V時，最左側的反應物離子峰已經消失，圖5B中二維曲線的兩組峰分別對應苯丙氨酸特征峰和雜質峰。在選定的152.8 V分離電壓下，對應的補償電壓

Symbolm@@ 0.62 V即為苯丙氨酸的特征值?？梢?，FAIMS對苯丙氨酸有很好的分辨能力。

3.3 譜圖分析

從圖5A的FAIMS特征譜圖中可見，中間的苯丙氨酸特征峰，是呈弧狀的分布。即，隨著分離電壓的增加，捕捉到的離子信號對應的補償電壓的絕對值先增大后減小。為此，在圖6展示了FAIMS對苯丙氨酸檢測時，所需的補償電壓隨著分離電壓變化的趨勢圖（空心點連線）。當分離電壓小于171.2 V時，掃描到的補償電壓的絕對值隨著分離電壓的增大而增大；而當分離電壓大于171.2 V時，補償電壓的絕對值隨著分離電壓的增大而減小。從前面的分析可知，補償電壓絕對值的變化與高低電場下積累的位移差的變化有關。為了解釋這一現象，從離子遷移率的非線性函數入手。

在高場下，離子的遷移率系數K與電場強度的關系是一個非線性關系，可由下式表示[23]，

Symbolm@@ 21V·m2）。從式（3）可知，求出α2和α4就能夠描繪出非線性函數隨分離電壓V的分布，將其展示在圖6（實心點連線）中。從圖6可見，當分離電壓小于171.2 V時，隨著分離電壓的增加，由于N值較大， （E/N）2 起主要作用。綜上，α2占據主導，非線性函數是正向增大的，即離子遷移率是增加的，對應離子在高場下的位移也是增加的，位移差開始變大，需要的補償電壓的絕對值也越來越大；而當分離電壓大于171.2 V時，隨著分離電壓的增加，（E/N）4 的作用開始凸顯，α4開始占據主導，α4是負的，對非線性函數的貢獻也是負的，因此， 離子遷移率是減小的，對應離子在高場下的位移是減小的，此時位移差又開始變小，需要的補償電壓的絕對值也越來越小。這就是苯丙氨酸特征譜呈現弧形分布的原因。

3.4 苯丙氨酸的動態響應

在優化的實驗條件下，即壓強為250 kPa， 載氣流速為2000 mL/min，分離電壓為152.8 V，補償電壓為

Symbolm@@ 0.62 V，定量檢測了不同濃度的苯丙氨酸。圖7展示了苯丙氨酸特征離子峰信號和質量濃度之間關系曲線。

結果表明，當濃度超過20 mg/L時，由于樣品分子的離化率隨著樣品濃度的增大而增幅降低，檢測到離子電流值增長緩慢。而苯丙氨酸在6～20 mg/L范圍內呈現較好的線性關系，相關系數r=0.994。通過計算在信噪比S/N=3時得到苯丙氨酸的檢出限（LOD）為5.9 mg/L。對不同濃度的苯丙氨酸樣品氣進行重復檢測，表明重復性較好。圖8A為6 mg/L苯丙氨酸樣品在正模式下的FAIMS譜圖，可以觀察到3組峰，左邊是反應物離子峰，中間是苯丙氨酸特征離子峰，右邊是雜質離子峰。圖8B為載氣（空氣）的背景FAIMS譜圖。左邊是反應物離子峰，右邊是雜質離子峰。對比可知，圖8A 中間的苯丙氨酸特征峰出峰明顯，說明FAIMS在檢出限濃度附近對苯丙氨酸有良好的分辨能力。

通過對不同濃度的苯丙氨酸樣品氣體進行FAIMS檢測，獲得一系列在不同濃度下的FAIMS動態響應和譜圖，并確定了FAIMS定量檢測濃度線性范圍為6～20 mg/L。圖9展示了在此區間內，處在最佳分離電壓152.8 V下的離子電流值和補償電壓二維曲線。濃度在6 mg/L時，苯丙氨酸的特征峰信號和雜質峰的信號比S/N≥3，補償電壓為

Symbolm@@ 0.62 V。醫學中正常兒童血清苯丙氨酸濃度的參考值為（16.46

SymbolqB@ 3.10） mg/L[6]?？梢奆AIMS對苯丙氨酸的定量線性范圍包含了這個正常范圍。與高效液相色譜及熒光法相比[5～7]，操作簡單，檢測時間明顯縮短，具有很大的優勢。

圖8 濃度為6 mg/L的苯丙氨酸樣品氣在正模式下的FAIMS譜圖 （A） 和背景 （空氣） 的FAIMS譜圖

Fig.8 FAIMS spectra of phenylalanine gas （A） and background （air） （B） in positive mode when phenylalanine concentration is 20 mg/L

圖9 苯丙氨酸在不同濃度下的離子信號強度隨補償電壓變化的二維曲線圖

Fig.9 Plots of ion intensity of phenylalanine versus compensation voltage with different phenylalanine concentrations

4 結 論

采用擴散管芯片式高場非對稱波形離子遷移譜技術對苯丙氨酸進行了快速檢測分析，考察了分離電壓、補償電壓和采樣流速對苯丙氨酸檢測的影響規律，計算出苯丙氨酸的非線性遷移率系數并對苯丙氨酸特征譜的形狀做出了理論解釋。在優化的檢測條件下，確定了苯丙氨酸的檢出限和定量線性范圍。為FAIMS應用于快速檢測苯丙氨酸提供了依據。整個過程檢出時間僅為30 s，與高效液相色譜熒光法[5，6]的檢測時間30 min相比，本實驗的裝置雖然分辨率有待提高，但是檢測時間優勢明顯。本方法進樣簡單，直接將樣品氣化進行測試；沒有涉及前處理；所需的試劑少，只需要純水和甲醇，操作簡單便捷。

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Rapid Determination of Phenylalanine by Microchip based Field

Asymmetric Waveform Ion Mobility Spectrometry

GUO DaPeng1， WANG YongHuan1， XU TianBai1， ZHANG Yuan2， LI LingFeng1，

CHEN JinKai1， WANG XiaoZhi*1， LI Peng2， LUO JiKui1

1（Department of Information Science & Electronic Engineering， Zhejiang University， Hangzhou 310027， China）

2（Suzhou Wei Mu Intelligent System Ltd.， Suzhou 215163， China）

Abstract Field asymmetric ion mobility spectrometry （FAIMS） technology was used for the rapid analysis of phenylalanine （PHE） using a metal diffusion tubemicrochip FAIMS system. The test pressure was set at 250 kPa， and the temperature of the gas generator for the diffusion tube was at 190℃. The ion characteristic spectra were acquired under the optimized conditions with a gas flow rate of 2000 mL/min， a dispersion voltage of 152.8 V and a compensation voltage value of

Symbolm@@ 0.62 V for phenylalanine in positive mode. Phenylalanine gas samples with different concentrations were analyzed by FAIMS. The results showed that the ion intensity was linearly correlated to phenylalanine concentration in the range from 6 mg/L to 20 mg/L， and the limit of detection for phenylalanine was 5.9 mg/L. This investigation shows the feasibility of FAIMS technique for rapid detection of phenylalanine. The FAIMS instrument is simple and sensitive， and can be used for rapid detection of phenylalanine.

Keywords Phenylalanine； Rapid Determination； Field asymmetric ion mobility spectrometry； Metal diffusion tube

（Received 6 September 2015； accepted 31 October 2015）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.61301046）